Name: Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל במבחנה חקר אנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למד שיטה מהירה וכמותית להערכת אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל ותצפית ברשתות צינור. השיטה מאפשרת זיהוי גנים ומסלולים מעורבים בהיווצרות כלי דם חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תכנית מחקר המיפוי של המכון הלאומי לסרטן במכון הלאומי לבריאות, ועל ידי NCI להעניק UA5CA152907.

1 האוסף של מדיה אוויר לבדיקת פוטנציאל angiogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ראשוניים או הונצחו להיבדק לפוטנציאל angiogenic או אנטי אנגיוגנזה בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או לאסוף את התקשורת ממוזגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, שימוש מותנה בתקשורת באופן מיידי, או aliquoted ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. השתמש בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או nonconditioned כביקורת שלילית, ולהשתמש במדיה מיזוג אינם מלאים צמיחה (10% FBS, או ריכוז מתאים) כביקורת חיובית. לחלופין, כדי לבדוק את גירוי פוטנציאל של אנגיוגנזה, תקשורת הפשיטה פחם תוספת חסרת גורמי גדילה עם ריכוזים ידועים של חלבונים ספציפיים של עניין ולהשוות לתקשורת חופשית גורם גדילה לבד. </li></ol></li></ol> .2 הכנת תאי האנדותל לפני Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני assay, מעבר 3B-11 תאים לתוך T-75 בקבוק חדש. מספר מעבר של תאים חשוב. assay זה עובד הכי טוב כאשר תאים הם בין הקטעים השניה והשישי. Assay לא יעבוד גם אם תאי האנדותל משמשים לפני השני או לאחר המעבר עשירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל24 שעות DMEM בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay, סרום להרעיב 3B-11 תאים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מתאי 3B-11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה סרום מופחתת של DMEM בתוספת FBS 0.2%, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל24 שעות נוספות. </li></ol></li></ol> .3 הכנת ריאגנטים לפני Assay הערה: ריכוזי BME הם משתנים מאוד תלויים בהרבה. BME לא עובד טוב אם הריכוז הוא פחות מ -10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולכן יצרן BME יש לפנות לפני רכישה על מנת להבטיחרכישה של הרבה מרוכז כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה מופחתת גורם גדילת BME במקרר. BME מתמצק כאשר חם, ולכן הוא חייב להיות כל הזמן קר לפני השימוש. ניתן לאחסן BME תחת קירור במשך כמה שבועות, או aliquoted וקפוא ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם גדילה מופחת BME עדיף על פני BME המסורתי. חוסר גורמי angiogenic בBME יעשה את זה קל יותר להבחין בהשפעה שיש לי גורמים מהתקשורת המותנה בהיווצרות צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת הפשרה להיבדק. </li></ol> .4 הכנת תאי האנדותל מייד לפני Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3B-11 תאים בDPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal היא רצויה, לפני הכביסה 3B-11 תאים, להוסיף AM calcein לתאי האנדותל בכלי תקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הנח תאי שכותרתו calcein בחושך ב37 ° C ו 5% CO 2 לפני תחילת assay. לפזר calcein המניהAM בDMSO ופעם calcein מדולל בריכוז סופי תקשורת של DMSO לא יעלה על 0.1%. אחרי 30-45 בבוקר calcein לשטוף דקות מהתאים (שלב 4.1 לעיל) ולהמשיך בניסוי הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA לT-75 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר trypsinization הוא מלא, לנטרל טריפסין על ידי resuspending תאים לנפח סופי של 10ml בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סינון דרך מסננת תא 100 מיקרומטר כדי להסיר גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ותאי resuspend לריכוז סופי של 7.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין. </li></ol> Assay גיבוש .5 Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפים 24 גם צלחת ו1 מ&quot;ל במקרר או על קרח למשך 20-30 דקות לפני טעינת הצלחת כך שBME לא Prematurely לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 250 μl של גורם גדילה המופחת BME לבאר כל צלחת 24 גם. הימנע מיצירת בועות על ידי לא מדכא פיפטה לתחנתה הסופית בעת הניפוק. תשמור על עצמך שBME מספיק נשאר במרכז גם כאשר צורות המניסקוס; אם המטריצה ​​היא רזה מדי, התאים רק יוצרים שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 24 גם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לגבש את BME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שBME קבע, לערבב כ 300 μl של תקשורת ממוזגת עם 10 μl של 3B-11 תאי resuspended (כ 75,000 תאים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את עוצמת הקול של מדיה ומספר התאים מצופים בהתאם לסוג תא האנדותל בשימוש מותנים, ולבדוק את דילולים סדרתי של התקשורת המותנה להפגין פעילות. אם תאי השוואה גדלו בתנאים שונים, לנרמל התנה תקשורת נפח למספר התאים ששימשו להתנות את התקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> wil צינורותl מתחיל להיווצר בתוך 2-4 שעות. בהתאם לריכוז גורם angiogenic בתקשורת המותנה, היווצרות צינור שיא עלולה להתרחש בין 3 ל 12 שעה והעיתוי של assay יצטרך להיות מותאם. אם עובד עם תאי האנדותל עיקריים במקום תאים הונצחו, היווצרות צינור ראשונית עשויה להתעכב בכמה שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לעתים קרובות יתחילו להתדרדר בתוך 18 תאי שעה ואנדותל יעבור אפופטוזיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת היווצרות צינור שיא, תקשורת לשאוב בזהירות מהבאר כדי למנוע שיבוש רשת הצינור על BME. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב עם כל 1 DPBS מ&quot;ל, ואז לשאוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה מיידית, להוסיף 1 מ&quot;ל DPBS הטרי לכל רשת צינור היטב ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך מצורף למצלמה דיגיטלית, או הקרינה / מיקרוסקופ confocal אם התאים היו מוכתמים בבוקר calcein כמו ב4.1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את רשת הצינור להדמיה מאוחר יותר, ולהוסיף paraformaldehyde 4% לכל אחדלהישאף היטב דגירה ל15 דקות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר paraformaldehyde, לשטוף פעמיים עם DPBS, ולאחר מכן להוסיף 1mL DPBS הטרי היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה מיקרוסקופית לפני הקיבוע ככמה צינורות עשויים לשבור במהלך הליך זה. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> .6 כימות רשת Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את רשת הצינור במספר דרכים שונות בהתאם להעדפותיו של החוקר, ויש לי כמה תוכנות מחשב יכולת למדוד את הפרמטרים הבאים: מספר הצינורות; מספר לולאות / רשתות; מספר אתרי סניף / צמתים; אורך של צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת מחשב נציג כגון J תמונה עם תוסף אנגיוגנזה Analyzer 16 לכימות של רשתות צינור. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li>
<li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li>
<li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research+%3A+the+official+journal+of+the+Italian+Pharmacological+Society%22%5BJournal%5D)">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li>
<li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li>
<li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tumour+vasculature%3A+insights+from+physiological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20%3A+state+of+the+science+and+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li>
<li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+contribution%3A+Angiogenesis+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+News%22%5BJournal%5D)">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

אנגיוגנזה היא מעורבת בשני תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. חקר מנגנונים המעורבים באנגיוגנזה דורש השימוש במבחנים שיסכמו את השלבים העיקריים באנגיוגנזה. Assay היווצרות צינור תא האנדותל מציע מספר יתרונות על פני מבחני אחרים. זה קל להגדרה, הוא זול יחסית, מייצר tubules בתוך שעות, וניתן למדידה. יתר על כן, זה יכול להסתיים ב24- או 96 גם צלחות, ולכן ניתן להשתמש בם להקרנת תפוקה גבוהה לזהות גורמים המגרים או לעכב אנגיוגנזה. למרות שאנו משמשים 3B-11 תאי האנדותל עכבר לניסויים שלנו, assay יכול להתבצ...

אנגיוגנזה, הפיתוח של כלי דם חדשים מכלי preexisting, הוא חיונית עבור מגוון רחב של תהליכים לרבות גידול איברים, התפתחות עוברית, וריפוי פצע 1-3. חדש שפותח כלי דם, בשורה של תאי האנדותל, חמצן אספקה ​​וחומרים מזינים לרקמות, לקדם מעקב חיסוני על ידי תאי hematopoietic ולהסיר חומרי פסולת 2,4. אנגיוגנזה היא בעל חשיבות מרכזית בהתפתחות עוברית ועוברית. עם זאת, תהליך זה נשאר רדום במבוגרים, למעט בתקופות של ריפוי פצעים, צמיחת שלד, הריון או במהלך המחזור החודשי 1-3. במהלך שני העשורים האחרונים, מנגנונים מולקולריים מרכזיים המסדירים אנגיוגנזה החלו לצוץ. אנגיוגנזה היא אירוע בחוזקה מוסדר, מאוזנת אותות פרו וantiangiogenic כוללים integrins, כמוקינים, angiopoietins, סוכני חישת חמצן, מולקולות junctional ומעכבי אנדוגני 5. ברגע שproangאותות iogenic כגון גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF), גורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), גורם גדילה המופק טסיות דם (PDGF), וגורם הגדילה באפידרמיס (EGF) להפעיל תא האנדותל קולטניים תאי האנדותל לשחרר פרוטאזות להשפיל קרום במרתף. תאי האנדותל אז להתרבות ולהעביר, ויצרו נבטים בשיעור של כמה מילימטרים ליום 6,7. אנגיוגנזה קשורה למצבים פתולוגיים שונים, כוללים סרטן, פסוריאזיס, רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים, אסטמה, הפרעות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות, וטרשת עורקת 8-10. בשל החשיבות של אנגיוגנזה במחלות שונות, הבנת גנים ומסלולים המווסתים את התהליך הזה הוא קריטי לעיצוב של תרופות טובות יותר. Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה וכמותיים לקביעת גנים או מסלולים מעורבים באנגיוגנזה. תואר לראשונה בשנת 1988,העקרונות שבבסיס assay זה הם שתאי האנדותל שומרים על היכולת להתחלק ולהעביר במהירות בתגובה לאותות angiogenic 11-13. יתר על כן, בתאי האנדותל הנגרמים לבדל וליצור מבנים דמויי צינור כאשר בתרבית על מטריצה ​​של תמצית קרום במרתף (BME). צינורות אלה מכילים לומן מוקף בתאי האנדותל המקושרים ביניהם באמצעות מתחמי junctional. היווצרות צינור מתרחשת במהירות עם רוב הצינורות ויוצרים בassay זה בתוך 2-6 שעות בהתאם לכמות וסוג של גירויי אנגיוגנזה. מספר סוגים של תאי האנדותל יכולים לשמש עבור assay זה כולל שני תאים ראשוניים ושורות תאים הונצחו 14,15. שורת התא המשמשת למאמר זה הייתה עכבר 3B-11, אך אותן השיטות יכולות להיות מיושמת עם קווים אחרים אנדותל תא כגון SVEC4-10 (עכבר) או תאי האנדותל עיקריים כגון HUVEC תאים (אדם). תלוי באיזה קו סלולארי משמש והאם ce אנדותלLLS הופכים או לא הופך, אופטימיזציה תצטרך להתנהל כדי לזהות את הזמן האידיאלי נחוץ להיווצרות צינור נכונה.

<table><tbody><tr><td>Costar 24 בארות צלחת מטופלת בתרבית רקמות</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>BD מטריג'ל מטריצת קרום בסיס, גורם גדילה מופחת</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td> <td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gibco עט סטרפטוקוקוס</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלס ביולוגי</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr></tbody></table>

assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

אנגיוגנזה היא תהליך חיוני להתפתחות רקמות נורמלית וריפוי פצעים, אלא גם קשורה עם מגוון רחב של מצבים פתולוגיים. שימוש בפרוטוקול זה, אנגיוגנזה ניתן למדוד במבחנה באופן מהיר, לכימות. תאי האנדותל ראשוניים או הונצחו מעורבבים עם תקשורת מותנית ומצופים על מטריצת קרום במרתף. תאי האנדותל יוצרים נימים כמו מבנים בתגובה לאנגיוגנזה אותות מצאו בתקשורת מותנית. היווצרות הצינור מתרחשת במהירות עם תאי האנדותל מתחילים ליישר את עצמם בתוך שעה 1 וצינוריות המכיל לומן מתחילים להופיע בתוך 2 שעות. יכולים להיות דמיינו צינורות באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפוך שלב, או ניתן לטפל בתאים עם AM calcein לפני assay והצינורות דמיינו באמצעות הקרינה או confocal. מספר אתרי סניף / צמתים, לולאות / רשתות, או מספר או אורך של צינורות שנוצרו ניתן לכמת בקלות כמדד בvitrאנגיוגנזה o. לסיכום, assay זה יכול לשמש כדי לזהות גנים ומסלולים המעורבים בקידום או העיכוב של אנגיוגנזה בצורה מהירה, לשחזור, וכמותי.

עכבר 3B-11 תאי האנדותל היו זורעים על גורם גדילה מופחתת הקרושה BME - בassay זה, מוצר Matrigel שימש - ואחריו לאורך זמן. כפי שניתן לראות באיור 1, גורמי angiogenic מופרשים על ידי שני הקרטינוציטים עכבר או פיברובלסטים הם מסוגלים גרימת היווצרות צינור לאורך זמן. תאי האנדותל להגר ולהתחיל לגבש סניפים קטנים בתוך 1-2 שעות של ציפוי. הושגה היווצרות צינור מקסימלי על ידי 4-6 שעות באמצעות מדיה מותנית שהתקבלה בעבר מקרטינוציטים. על ידי 24 שעות, חלק מהסניפים נשארו, אבל רבים מהתאים הפ...

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע גנים או מסלולים המעורבים באנגיוגנזה באמצעות שימוש בשיטה מהירה וכמותית in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי הרעבת סרום של תאי אנדותל ראשוניים או אלמוות ביום שלפני הבדיקה. השלב השני הוא דגירה של תאי האנדותל עם calcine למשך 30 דקות, ולאחריה שטיפת התאים ב-PBS.בשלב הבא, תאי האנדותל עוברים עיכול בטריפסין, סינון להסרת גושים וספירה. השלב הסופי הוא שילוב תאי האנדותל עם מצע גידול מותנה (conditioned media) המכיל גורמים אנגיוגניים פוטנציאליים, והעברתם על גבי תמצית ממברנה בסיסית שהתמצקה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אור או פלואורסצנציה להדמיית רשתות צינוריות, אותן ניתן לכמת באמצעות תוכנות מחשב ייעודיות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות לבדיקת אנגיוגנזה הוא שהיא קלה להקמה, זולה יחסית, מייצרת צינוריות תוך שעות בודדות וניתנת לכימות בהדגמת טכניקה זו. אריקה בולווינקל היא סטודנטית לתואר שני במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת אמריקן. באמצעות המצע המתאים, העבירו תאי B 11 למבחנה חדשה יומיים לפני תחילת הבדיקה; לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בתאים שנמצאים בין המעברים השני לשישי.בשלב הבא, גדלו את התאים במשך 24 שעות ב-dmm מועשר. כאשר התאים מוכנים, מבצעים להם הרעבת סרום. על ידי החלפת המצע במצע עם סרום מופחת, גדלו את התאים המורעבים בסרום למשך 24 שעות נוספות.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לוודא מול היצרן כי ריכוז תמיסת המלאי של ה-BME הוא 10 milligrams per milliliter. הפשיר את ה-BME, גורם צמיחה רדוקטיבי, במקרר. מכיוון ש-BME נוטה להתמצק בטמפרטורה חמימה, יש לשמור אותו בקירור לפני השימוש.בשלב הבא, הפשיר את המדורה הדרושה לסבב הבדיקה לצורך ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. הוסף Calcein AM למדורה בריכוז סופי של 2 µg/mL והשאר את התאים המסומנים ב-Calcein AM בחושך למשך כ-30 עד 45 דקות. לאחר זמן זה, הסר את המדורה ושטוף את תאי ה-3B11 ב-DPBS. לאחר מכן, בצע טריפסינזציה לתאים על ידי הוספת 1 mL של Trypsin-EDTA. לאחר סיום הטריפסינזציה.השביו את התאים לנפח סופי של 10 milliliters. ב-dmm מועשר, הסירו גושים מהתאים על ידי סינונם דרך מסננת תאים של 100 micrometer. לאחר ספירת התאים, השביו אותם לריכוז הסופי הנכון כדי להתחיל את בדיקת יצירת השפופרות (tube formation assay) בקירור.יש לחמם פלטת 24 בארות וטיפים של מיליליטר אחד למשך 20 עד 30 דקות לפני הטעינה. פעולה זו מונעת מה-BME להתמצק בטרם עת בעת תחילת העבודה; העבר באמצעות פפיטה 250 µL של BME עם גורם גדילה מרובל לכל בארה בפלטת 24 בארות. הימנע מיצירת בועות על ידי אי-לחיצה של הפפיטה עד למעצורה הסופית.בעת השימוש בפיפט, לאחר מילוי הבארות, יש לוודא שנותר מספיק BME במרכז הבאר. כאשר נוצר המניסקוס, אם המטריצה דקה מדי, התאים יצרו רק שכבה אחת (monolayer). לאחר מכן, יש להדגיר את הפלטה למשך 30 דקות כדי להקשות את ה-BME.לאחר שה-BME התקשח, ערבבו כ-300 microliters של מצע מותנה (conditioned media) עם 10 microliters של תאי three B 11 שהושעו מחדש, וחלקו את תרחיף התאים לבארות של הפלטה. לאחר הנחת הפלטה באינקובטור, צינוריות יתחילו להיווצר תוך שעתיים עד ארבע שעות. בהתאם לריכוז הגורמים האנגיוגניים במצע המותנה, שיאו של תהליך היווצרות הצינוריות עשוי להתרחש בין שלוש ל-12 שעות. יהיה צורך לבצע אופטימיזציה לתזמון הבדיקה בהתאם לתנאי המחקר הספציפיים.הצינורות יחלו לרוב להתפוגג תוך 18 שעות, והתאים האנדותליאליים יעברו אפופטוזיס בשיאו של תהליך היווצרות הצינורות. שאבו בזהירות את המצע מהבאר כדי למנוע פגיעה ברשת הצינורות. לאחר מכן, שטפו כל באר ב-1 mL של DPBS לצורך ויזואליזציה מיידית.הוסיפו מיליליטר אחד של DPBS טרי לכל באר וצלמו את רשת הצינורות במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לקבע את רשת הצינורות לצורך ויזואליזציה מאוחרת. הוסיפו 4% paraformaldehyde לכל באר שנוקזה והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת ה-paraformaldehyde, שטפו פעמיים ב-DPBS ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של DPBS טרי לכל באר. תמונות אלו מראות כי גורמים אנגיוגניים המופרשים על ידי קרטינוציטים או פיברובלסטים של עכבר מסוגלים להשרות יצירת צינורות.עם הזמן, תאי אנדותל נודדים ומתחילים ליצור ענפים קטנים תוך שעה עד שעתיים מהזריעה. יצירת צינוריות מקסימלית הושגה לאחר ארבע עד שש שעות. לאחר 24 שעות חלק מהענפים נותרו, אך תאים רבים הפכו לאפופטוטיים והצינוריות החלו להתנתק.למספר התאים יש השפעה עמוקה על היווצרות השפעלים. כאשר מזריעים מספר תאים שאינו מספיק, נוצרים שפעלים מעטים והרשת מינימלית; ככל שמזריעים תאים רבים יותר, רשת השפעלים הופכת למקיפה יותר. עם זאת, בריכוז גבוה מדי, התאים מתחילים להתקבץ או ליצור שכבות חד-שכבתיות (monolayers), וההבדלים בין קבוצות הטיפול נסתרים. התאים צריכים לעבור לפחות שני מעברים (passages) כדי להבטיח היווצרות תקינה של השפעלים.קצב הצמיחה של B 11 שלושה הוא כה מהיר שמעבר של 25% מהתאים ביום אחד יניב מבחנה מלאה (confluent) ביום למחרת. כאן, נעשה שימוש ב-Image J עם תוסף ה-angiogenesis על רשת צינורות שנצבעה ב-calcine AM כדי לזהות את סך הצמתים, הצינורות ברשת בשילוב, ואת המיזוגים ברשת. בנוסף, ניתן להשתמש בתוכנה זו כדי לזהות באופן פרטני צמתים, צינורות או רשת, שניתן לכמתם.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין כיצד לבצע אנגיוגנזה in vitro באופן מהיר ואמין תוך הימנעות מטעויות נפוצות.

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Assay הקמת הצינור משמש להערכת פעילות כלי הדם של תאים סרטניים.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.

מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

מטרת שיטה זו היא להשיג פיברוההדף מטריצות 3D נגזר כפיגום טבעי עבור הבאים הסלולר assays. פיברותקיעות מורצת לוחית התרבות שטופלו מראש ומגורה עם חומצה אסקורבית ליצירת מטריקס. מטריצות מdecellularized וחסומות לתאים רלוונטיים לתרבות (למשל, תאי האנדותל).

מערכת מטריצה תלת-ממדית פיברובלסט הישימה בשיטת היווצרות שפופרת אנדותל

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

למד שיטה מהירה וכמותית להערכת אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל ותצפית ברשתות צינור. השיטה מאפשרת זיהוי גנים ומסלולים מעורבים בהיווצרות כלי דם חדשים.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל

גלה סרטונים נוספים