Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל
1 בספטמבר 2014
Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.
המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע גנים או מסלולים המעורבים באנגיוגנזה באמצעות שימוש בשיטה מהירה וכמותית in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי הרעבת סרום של תאי אנדותל ראשוניים או אלמוות ביום שלפני הבדיקה. השלב השני הוא דגירה של תאי האנדותל עם calcine למשך 30 דקות, ולאחריה שטיפת התאים ב-PBS.
בשלב הבא, תאי האנדותל עוברים עיכול בטריפסין, סינון להסרת גושים וספירה. השלב הסופי הוא שילוב תאי האנדותל עם מצע גידול מותנה (conditioned media) המכיל גורמים אנגיוגניים פוטנציאליים, והעברתם על גבי תמצית ממברנה בסיסית שהתמצקה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אור או פלואורסצנציה להדמיית רשתות צינוריות, אותן ניתן לכמת באמצעות תוכנות מחשב ייעודיות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות לבדיקת אנגיוגנזה הוא שהיא קלה להקמה, זולה יחסית, מייצרת צינוריות תוך שעות בודדות וניתנת לכימות בהדגמת טכניקה זו. אריקה בולווינקל היא סטודנטית לתואר שני במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת אמריקן. באמצעות המצע המתאים, העבירו תאי B 11 למבחנה חדשה יומיים לפני תחילת הבדיקה; לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בתאים שנמצאים בין המעברים השני לשישי.
בשלב הבא, גדלו את התאים במשך 24 שעות ב-dmm מועשר. כאשר התאים מוכנים, מבצעים להם הרעבת סרום. על ידי החלפת המצע במצע עם סרום מופחת, גדלו את התאים המורעבים בסרום למשך 24 שעות נוספות.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לוודא מול היצרן כי ריכוז תמיסת המלאי של ה-BME הוא 10 milligrams per milliliter. הפשיר את ה-BME, גורם צמיחה רדוקטיבי, במקרר. מכיוון ש-BME נוטה להתמצק בטמפרטורה חמימה, יש לשמור אותו בקירור לפני השימוש.
בשלב הבא, הפשיר את המדורה הדרושה לסבב הבדיקה לצורך ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. הוסף Calcein AM למדורה בריכוז סופי של 2 µg/mL והשאר את התאים המסומנים ב-Calcein AM בחושך למשך כ-30 עד 45 דקות. לאחר זמן זה, הסר את המדורה ושטוף את תאי ה-3B11 ב-DPBS. לאחר מכן, בצע טריפסינזציה לתאים על ידי הוספת 1 mL של Trypsin-EDTA. לאחר סיום הטריפסינזציה.
השביו את התאים לנפח סופי של 10 milliliters. ב-dmm מועשר, הסירו גושים מהתאים על ידי סינונם דרך מסננת תאים של 100 micrometer. לאחר ספירת התאים, השביו אותם לריכוז הסופי הנכון כדי להתחיל את בדיקת יצירת השפופרות (tube formation assay) בקירור.
יש לחמם פלטת 24 בארות וטיפים של מיליליטר אחד למשך 20 עד 30 דקות לפני הטעינה. פעולה זו מונעת מה-BME להתמצק בטרם עת בעת תחילת העבודה; העבר באמצעות פפיטה 250 µL של BME עם גורם גדילה מרובל לכל בארה בפלטת 24 בארות. הימנע מיצירת בועות על ידי אי-לחיצה של הפפיטה עד למעצורה הסופית.
בעת השימוש בפיפט, לאחר מילוי הבארות, יש לוודא שנותר מספיק BME במרכז הבאר. כאשר נוצר המניסקוס, אם המטריצה דקה מדי, התאים יצרו רק שכבה אחת (monolayer). לאחר מכן, יש להדגיר את הפלטה למשך 30 דקות כדי להקשות את ה-BME.
לאחר שה-BME התקשח, ערבבו כ-300 microliters של מצע מותנה (conditioned media) עם 10 microliters של תאי three B 11 שהושעו מחדש, וחלקו את תרחיף התאים לבארות של הפלטה. לאחר הנחת הפלטה באינקובטור, צינוריות יתחילו להיווצר תוך שעתיים עד ארבע שעות. בהתאם לריכוז הגורמים האנגיוגניים במצע המותנה, שיאו של תהליך היווצרות הצינוריות עשוי להתרחש בין שלוש ל-12 שעות. יהיה צורך לבצע אופטימיזציה לתזמון הבדיקה בהתאם לתנאי המחקר הספציפיים.
הצינורות יחלו לרוב להתפוגג תוך 18 שעות, והתאים האנדותליאליים יעברו אפופטוזיס בשיאו של תהליך היווצרות הצינורות. שאבו בזהירות את המצע מהבאר כדי למנוע פגיעה ברשת הצינורות. לאחר מכן, שטפו כל באר ב-1 mL של DPBS לצורך ויזואליזציה מיידית.
הוסיפו מיליליטר אחד של DPBS טרי לכל באר וצלמו את רשת הצינורות במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לקבע את רשת הצינורות לצורך ויזואליזציה מאוחרת. הוסיפו 4% paraformaldehyde לכל באר שנוקזה והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת ה-paraformaldehyde, שטפו פעמיים ב-DPBS ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של DPBS טרי לכל באר. תמונות אלו מראות כי גורמים אנגיוגניים המופרשים על ידי קרטינוציטים או פיברובלסטים של עכבר מסוגלים להשרות יצירת צינורות.
עם הזמן, תאי אנדותל נודדים ומתחילים ליצור ענפים קטנים תוך שעה עד שעתיים מהזריעה. יצירת צינוריות מקסימלית הושגה לאחר ארבע עד שש שעות. לאחר 24 שעות חלק מהענפים נותרו, אך תאים רבים הפכו לאפופטוטיים והצינוריות החלו להתנתק.
למספר התאים יש השפעה עמוקה על היווצרות השפעלים. כאשר מזריעים מספר תאים שאינו מספיק, נוצרים שפעלים מעטים והרשת מינימלית; ככל שמזריעים תאים רבים יותר, רשת השפעלים הופכת למקיפה יותר. עם זאת, בריכוז גבוה מדי, התאים מתחילים להתקבץ או ליצור שכבות חד-שכבתיות (monolayers), וההבדלים בין קבוצות הטיפול נסתרים. התאים צריכים לעבור לפחות שני מעברים (passages) כדי להבטיח היווצרות תקינה של השפעלים.
קצב הצמיחה של B 11 שלושה הוא כה מהיר שמעבר של 25% מהתאים ביום אחד יניב מבחנה מלאה (confluent) ביום למחרת. כאן, נעשה שימוש ב-Image J עם תוסף ה-angiogenesis על רשת צינורות שנצבעה ב-calcine AM כדי לזהות את סך הצמתים, הצינורות ברשת בשילוב, ואת המיזוגים ברשת. בנוסף, ניתן להשתמש בתוכנה זו כדי לזהות באופן פרטני צמתים, צינורות או רשת, שניתן לכמתם.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין כיצד לבצע אנגיוגנזה in vitro באופן מהיר ואמין תוך הימנעות מטעויות נפוצות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקת יצירת צינוריות (tube formation assay) היא שיטה מהירה וכמותית להערכת אנגיוגנזה in vitro. טכניקה זו כוללת שילוב של תאי אנדותל עם מצע גידול מותנה (conditioned media) וזריעתם על תמצית קרום בסיס, מה שמוביל ליצירת צינוריות שניתן לכמת בתוך מספר שעות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אנגיוגנזה
- ביולוגיה של התא
- בדיקות In Vitro
רקע
- אנגיוגנזה היא התהליך של יצירת כלי דם חדשים.
- תאים אנדותלייליים ממלאים תפקיד מכריע בתהליך זה.
- שיטות כמותיות הן חיוניות לחקר האנגיוגנזה.
- בדיקת יצירת צינורות (tube formation assay) מספקת דרך פשוטה ויעילה להדמיה ומדידה של תהליך זה.
מטרת המחקר
- לזיהוי גנים או מסלולים המעורבים באנגיוגנזה.
- שימוש בשיטה מהירה וכמותית in vitro לצורך ניתוח.
- הדמיה של רשתות צינוריות הנוצרות על ידי תאי אנדותל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרעבת סרום של תאי אנדותל ראשוניים או תאי אנדותל מומימליים.
- דגירה של התאים עם calcine למשך 30 דקות.
- שטיפת התאים ב-PBS להסרת שאריות של calcine.
- שילוב התאים עם מצע גידול מותנה (conditioned media) וזריעתם על תמצית ממבנה התשתית (basement membrane extract).
תוצאות עיקריות
- ניתן להדמיות רשתות צינוריות הנוצרות על ידי תאי אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה.
- כימות של יצירת הצינוריות מתבצע באמצעות תוכנות מחשב ייעודיות.
- הבדיקה מאפשרת הערכה של גורמים אנגיוגניים פוטנציאליים.
- התוצאות עשויות לתרום להבנת המנגנונים של אנגיוגנזה.
מסקנות
- בדיקת יצירת צינוריות היא כלי יעיל לחקר אנגיוגנזה.
- שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי גורמי מפתח המעורבים ביצירת כלי דם.
- היא מספקת פלטפורמה למחקר נוסף של מטרות טיפוליות למחלות הקשורות לאנגיוגנזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות אנגיוגנזה כמותיות in vitro הן קריטיות לאימות מטרות בשלבים מוקדמים ולהסרת סיכונים מכניסטיים במסלולי פיתוח בביולוגיה של כלי דם ובאונקולוגיה. בדיקת יצירת צינוריות של תאי אנדותל מאפשרת הערכה מהירה וניתנת לשחזור של הפוטנציאל האנגיוגני, ובכך תומכת בביטחון חזוי בחקירת מסלולים ובמיון תרכובות. יכולת ההרחבה והכימות שלה מקלות על קבלת החלטות מוצקה בנקודות הכרעה מרכזיות בתהליכי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מהירה של גנים ומסלולים המווסתים אנגיוגנזה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות מועמדות במערכת מבוקרת וכמותית.
- מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי בידוד תגובות אנגיוגניות לגירויים מוגדרים.
- מספק ביטחון חיזוי עבור קידום מטרות בעלות השפעות וסקולריות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של יצירת צינוריות לצורך סריקת תרכובות.
- תומך בהערכה כמותית של פעילות אנגיוגנית או אנטי-אנגיוגנית בתנאי בדיקה.
- מאפשרת את הרחבת קנה המידה של הבדיקה (scalability) ואת שימוש חוזר בפלטפורמה במספר פרויקטים.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה פנוטיפית בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדי אנגיוגנזה במבחנה (in vitro) עם נקודות קצה וסקולריות הרלוונטיות למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות כלי דם.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכון, המבוססת על תגובות אנגיוגניות כמותיות.
- מספק תובנה מכניסטית לפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים כאשר הדבר נתמך בנתונים נוספים.
שילוב בקו תהליך (Pipeline) ובזרימת עבודה
בדיקה זו ממוקמת בממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת תיקוף של מטרות מבוסס היפותזה וסריקה תפקודית לפני ביצוע מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות יצירת צינוריות אנדותליאליות בתגובה לגורמים מוגדרים.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואת פעילות אנגיוגנית בין תנאים או תרכובות שונות.
- אנליטיקה: מייצרת נקודות קצה מדידות, כגון נקודות פיצול, לולאות ואורך צינוריות, לצורך ניתוח סטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מהווה גשר למודלים פרה-קליניים על ידי ביסוס הפוטנציאל האנגיוגני in vitro של מטרות או תרכובות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית עבור יוזמות מחקר ופיתוח מגוונות המתמקדות באנגיוגנזה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים על אנגיוגנזה.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור עבור בדיקות (assays).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי מתן אפשרות להערכת סיכונים ביולוגית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות וכומפונדות וסקולריות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי אנדותל ובניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast) או פלואורסצנציה/קונפוקלית ותוכנה לכימות תמונות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של מעברי תאים (cell passage), צפיפות זריעה והכנת המטריקס.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות לסוגי תאי אנדותל שונים או למקורות שונים של מדיה מותנית (conditioned media).
- יש למטב את יציבות השפופרות ואת התזמון עבור כל הקשר ניסויי.
