מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. ראשית הכינו שקופיות זכוכית על ידי פיפטינג טיפה של ארוס בטמפרטורת התכה נמוכה על אזור חרוט של המגלשה ליצירת סרט ארוס דק. השלב השני הוא לנתח ולהרכיב את הדגימה.

הסר ניצני פרחים מהגבעול, חתוך את גבעול המאריס מהגבעול, והטמיע מיד את גבעול החתך בסרט אגרוס הדק על הזכוכית. החלק הבא, הוסף מספיק אגרוס הרכבה מומס כדי למלא את הסדק שנוצר כאשר גזע מאריס הוטמע בסרט הארוס. השלב האחרון הוא הגדרת מיקרוסקופ הכוח האטומי לרכישת נתונים.

בסופו של דבר, ניתוח נתונים ומדידות של מודול דפנות התא לכאורה של יאנג מייצרים מפה מכנית של תכונות דפנות התא בו זמנית ברזולוציות תת-תאיות ועל פני אזורים שלמים של רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שהיא יכולה למדוד תכונות מכניות של דופן התא בו זמנית ברזולוציה התת-תאית ועל פני כל אזור הרקמה. המדיה של Aros להטמעת דגימות מוכנה מטמפרטורת התכה נמוכה של 0.7%, ארוס ב-10% מניטול במים.

בעזרת מכשיר מתכת חזק כגון קצה מקדחה, חרטו שטח של 0.5 על 0.5 סנטימטר במרכז זכוכית מיקרוסקופיה. החלקה זו מחספסת את פני השטח על מנת להקל על הידבקות האגרוס כדי להבטיח שאמצעי האגרוס נדבק או מתקבע לשקופית. טיפת פיפידה של כ-20 מיקרוליטר של הטמעת מדיה אגרוס על האזור החרוט של מגלשת הזכוכית.

זה מייצר סרט דק של אגרוס. אחסן את שקופית הזכוכית בקופסה לחה והמתין עד שאמצעי האגרוס יתמצק דגימות מ-Arabidopsis. אנה תשמש למיקרוסקופ כוח אטומי להכנת דגימות מריסטם.

הסר את ניצני הפרחים בזה אחר זה מהגבעול על ידי משיכתם כלפי מטה בעזרת פינצטה עדינה במיוחד. חשוב להסיר את כל הניצנים הפרחוניים עד לניצנים שאינם מציגים המשך המכונה P שלב אחד ראשוני. בעזרת סכין גילוח או קצה הפינצטה חותכים את המריסטם מהגבעול.

החיתוך צריך להיות מקביל לאזור משטח המריסטם שיש למדוד במיקרוסקופ הכוח האטומי או FM. הקודקוד המתקבל צריך להיות בגובה של בין 300 מיקרון ל -600 מיקרון כדי שלא יתפורר במהלך הניסוי. דחף מיד את הקודקוד לתוך הסרט הדק של ארוס מדיה שהוכן קודם לכן. בחר מיקום על מגלשת הזכוכית או הארוס ודחף בעדינות כך שהמריסטם יהיה גם במגע ישיר עם מגלשת הזכוכית וגם יבלוט החוצה מהארוס.

האגרוס נשבר עם הפעלת לחץ, כך שגזע המארי יעמוד כעת בסדק. חיוני למקם את גבעול המרית בארוס תוך מספר שניות לאחר חיתוכיו מהגבעול. זה מונע מגזע ה-MA להתייבש.

ניתן להכין מספר גבעולי MA בדרך זו להדמיית אצווה, בתנאי שהם באותו גובה וממוקמים במרחק של פחות מ-500 מיקרון זה מזה. בשקופית, שמור את גבעולי המא המוכנים בקופסה הלחה תוך ניתוח דגימות נוספות. לפני שתמשיך לשלב הבא, השתמש בנייר סינון כדי להסיר בעדינות עודפי מים בגבול שבין המריסטם לניצני הפרחים.

זאת כדי למנוע מהאגרוס המומס להציף את הדגימה עקב כוחות נימיים. מאוחר יותר עם פיפטה של 20 מיקרוליטר באגרוס הרכבה מומס מספיק כדי למלא את הסדק שנוצר קודם לכן ולהקיף כל מריסטם, הארוס צריך להגיע לרמת הצלקת של ניצן הפרחים שהוסר או חדר הכושר הראשוני. כדי להשיג זאת, יתכן שיהיה צורך להוסיף אגרוס בכל קצה של הסדק.

כאשר מוסיפים את האגרוס, הוא יציף במהירות לתוך הסדק. בעזרת הפיפטה שאפו חלק מאגרוס ההרכבה המומס כדי להבטיח שגזע ה-me הוא הנקודה הגבוהה ביותר בשקופית. זה מקבע את גזע ה-me כך שהוא לא יכול לזוז במהלך הדמיה לשורשים והיפו-פינוקים.

אין צורך בנתיחה בסרט הדק של אגרוס. על מגלשת הזכוכית המוכנה, השתמש בפינצטה מיקרו כדי ליצור חריץ ישירות מעל תחריט בכוס או לאורך למלה מזכוכית מקם את השורש או ההיפו בחריץ זה, וודא שהוא נמצא במגע עם הזכוכית לאורך האחיזה שלה. הוסף אגרוס הרכבה מומס סביב הדגימה באותו אופן שהודגם עבור דגימת גזע me.

אשף ננו JP PK. נעשה שימוש ב-FM בהדגמה זו. כדי להתחיל בהליך זה, התקן שלוחה עם שקע בצורת עגול על ה- A FM. הרדיוס יקבע את רזולוציית X, Y, Z ואת עומק הכניסה שבו ניתן לאחסן מדידה מדויקת.

כדי לקחת מדידות בקנה מידה ננומטרי על פני האפידרמיס, השתמש בשקע עגול ברדיוס של 50 ננומטר. כדי לבצע מדידות בקנה מידה בינוני, השתמש בשקע עגול ברדיוס של 0.5 מיקרון, וכדי לבצע מדידות בקנה מידה מיקרו על פני שניים עד שלושה תאים, השתמש בשקע עגול ברדיוס 2.5 מיקרון מקם את הלייזר בקצה השלוחה יישר את הלייזר לאמצע הלוכד באמצעות המראה.

מקם זכוכית נקייה בגישת A FM עם יעד לנקודת הגדרה של וולט אחד, בחר לספקטרוסקופיה. בצע הזחה על ידי הגדרת נקודת ההגדרה היחסית המקסימלית לשני וולט, מהירות ההארכה ל-40 מיקרון לשנייה ואורך ה-Z לחמישה מיקרון. מתפריט מנהל הכיול, בחר את החלק הליניארי של העקומה קדימה כך שיתאים לרגישות.

באמצעות כפתור בחירת טווח ההתאמה, יש להפוך את נקודת ההגדרה היחסית מנפח למטר ב-200 מיקרוליטר של תמיסת מניטול של 10%. מתחת לקצה השלוחה, יישר מחדש את הלייזר לאמצע הלוכד באמצעות המראה, ועל ידי הזזת המכבד, כייל מחדש את הרגישות מתפריט מנהל הכיול. לחץ על הכפתור הלא ידוע, בחר ארבע ספקטרוסקופיות ובצע הזחה כפי שהוצג קודם לכן.

בחר את החלק הליניארי של העקומה קדימה כך שיתאים לרגישות באמצעות כפתור בחירת טווח ההתאמה כדי להתחיל בהליך זה, מקם את הדגימות המותקנות מתחת ל-A FM והוסף טיפה של 500 מיקרוליטר של תמיסת מניטול של 10% על הדגימות. תמיסת המניטול פלזמה התאים תוך דקות מתקרבים עם היעד לנקודת הגדרה של 20 ננו ניוטון בשקע עם נקודת הגדרה יחסית של 200 ננו ניוטון ומהירות מאריכה של 40 מיקרון לשנייה ואורך Z של חמישה מיקרון. התאם את נקודת ההגדרה היחסית על מנת לקבל כניסה של 100 ננומטר עבור שלוחה המותקנת של 200 ננומטר או 0.5 מיקרון עבור המיקרון האחד.

מצב מיפוי כוח שלוחה המותקן על חמישה מיקרון. בחר אזור לסריקה עבור גבעולי מאר 70 על 70 מיקרון ברזולוציה של 64 על 64 עבור היפוקוס ושורשים 100 על 100 מיקרון ברזולוציה של 64 על 64. לחץ על סריקה כדי להפעיל את הניסויים, שמור את הפלט.

התחל בפתיחת קובץ הנתונים בתוכנת ניתוח הנתונים. לאחר מכן בחר עיבוד אצווה. להחיל את אותו ניתוח על כל העקומות של מפה אחת.

בחר נכון את הגובה לכיפוף השלוחה כדי לחלץ את עומק השקע. בחר את פונקציית התאמת המודול של יאנג. זה יניח שהכוח פרופורציונלי לאזור הזיחה.

הגדר את צורת הקצה לפרבולית כדי להניח שצורת הכניסה היא פרבולה. ציין את רדיוס הקצה. לאחר מכן, בחר את עקומת הנסיגה עבור הניתוח.

עקומת הנסיגה עדיפה על פני עקומת ה-xtend מכיוון שהיא פחות רגישה לטופוגרפיה. הגדר את יחס הפוסו ל-0.5. לבסוף, לחץ על, נתח ושמור את הפלט.

מפות מודולריות צעירות טיפוסיות של גבעולי מאדים פרחוניים, היפו-קונדלים צעירים ומבוגרים וגבעולי MA שורשים מוצגות כאן בכל הניסויים. הכניסה היא חצי כדורית, אך הרדיוס שלה שונה כך שניתן להשיג רזולוציות מרחביות שונות. מפות אלה מציגות תוצאות אופייניות לשקעים בקנה מידה של מזו עד ננומטר ברדיוס של 50 ננומטר עם כניסות עומק של 50 ננומטר.

הקרדיוגרף חושף הטרוגניות בקנה מידה מיקרו בדפנות תאי פני השטח של תאי אפידרמיס היפו-קודליים. כמו כן מוצגות תוצאות אופייניות לתותבות בקנה מידה בינוני ברדיוס של 500 ננומטר עם חריצי עומק של 500 ננומטר עבור מריסטם פרחוני, היפו קודל ושורש. קרדיוגרף זה לשיניים תותבות בקנה מידה מיקרו ברדיוס של 2.5 מיקרון עם חריצי עומק של 500 ננומטר חשף ריכוך רקמות במהלך התחלת איברים שקדמה לכל צמיחה נראית לעין.

עם זאת, סריקה זו בוטלה עקב טווח גובה הדגימה העולה על טווח ה-Z המרבי של A FM. תנועת דגימה במהלך הניסוי עקב קיבוע לא תקין עלולה לגרום לסריקה מטושטשת כפי שמוצג כאן. גם אזורים המכוסים באגרוס אינם ניתנים למדידה נכונה כפי שמודגם בדוגמה זו. ברגע ששולטים, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.