Name: מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: למדו למפות תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). שיטה זו מאפשרת מדידות ברזולוציה תת-תאית וקורלציה עם תהליכי גידול ומורפוגנזה בביולוגיה צמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו נותנים תודה מיוחדת לאיב Couder עבור רבים דיונים מועילים. אנו מודים עאטף Asnacios לכיול של הזיזים והדיון. אנו מודים לליסה וויליס, אליוט מאירוביץ, ואוליבר Hamant לקריאה ביקורתית. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק RGP0062/2005-C אדם Frontier תכנית המדע; סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר פרויקטי&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; ו&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. הכן זכוכית שקופיות להרכבה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן imbedding תקשורת agarose: 0.7% agarose התכה הנמוך במניטול 10% (במים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכשיר מתכת חזק (טיפ לדוגמא: תרגיל, סיד), לחרוט את אזור סנטימטר 0.5 x 0.5 במרכז שקופית זכוכית מיקרוסקופית. או במקום, להדביק חתיכה קטנה של lamella זכוכית (כ -20 x 200 מיקרומטר) לשקופית הזכוכית באמצעות דבק Araldite. הערה: זה לחספוס פני השטח על מנת להקל את ההדבקה של agarose כדי להבטיח כי מקלות agarose תקשורת או תיקונים לשקופית. ניתן לעשות שימוש חוזר שקופית זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם טיפה של כ -20 μl של imbedding תקשורת agarose על האזור הצרוב של שקופית הזכוכית. זה נותן שכבה דקה של agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את שקופיות הזכוכית בקופסא לחה ולחכות לתקשורת agarose כדי לחזק. </li></ol> 2. ביתור והרכבת דוגמאות meristem <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> meristems Microdissect לImagi confocalng: להסיר את ניצני פרחים אחד אחד מהגזע על ידי משיכת אותם עם פינצטה העדינה במיוחד. חשוב להסיר את כל ניצני הפרחים עד הניצנים שאינו מציגים עלי גביע (כלומר primordia P1 14). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח או הקצה של פינצטה, חתך את meristem מהגזע. החתך צריך להיות מקביל לאזור של פני השטח meristem שיימדד עם AFM. השיא שהושג צריך להיות בין 300 מיקרומטר ומיקרומטר 600 גבוה להתאים מתחת לקצה AFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הקודקוד לסרט של מדיה agarose מוכנה בשלב 1.1.4. בחר מיקום בשקופית זכוכית / agarose ולדחוף בעדינות כך שmeristem הוא גם ישירות במגע עם שקופיות הזכוכית ובולט החוצה מן agarose. זה חיוני כדי למקם את meristem בagarose בתוך כמה שניות שאחרי החתך שלה מהגזע. הערה: זו על מנת למנוע meristem מייבוש. בשלב זה, meristem יעמוד בCRACk כי agarose שבר על הפעלת לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה meristems דרך זו להדמיה אצווה, ובלבד שהם באותו הגובה וממוקמים פחות מ -500 מיקרומטר זה מזה בשקופית. שמור meristems הכין בתיבה הלחה בזמן לנתח דגימות נוספות. הערה: הוא מגביל את הווריאציה המגיעה מהכיול. באופן אידיאלי 2 דוגמאות של כל תנאי יכולה להיות מוכנות ונמדדו באופן אקראי. עד כה אין השפעה נצפית של הדמיה אצווה על המדידה (תגובת לחץ מושרה). זה יכול להיות הודות לדילול של מולקולות איתות מתח באגר ו / או הפתרון הגובר. לחלופין תגובת הלחץ היא זהה, ללא קשר לכמות המדגם מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעברתי לשלב הבא, ודא שהגבול בין meristem וניצני פרחים יבש. אם לא, להסיר בעדינות את המים העודפים באמצעות נייר סינון. זה צריך למנוע בשלב הבא שנמסagarose מציף המדגם בשל כוחות נימיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת 20 μl, להוסיף מספיק נמס ההרכבה agarose כדי למלא את הסדק שנוצר בשלב 1.2.3. ולהקיף את כל meristem. Agarose צריך להגיע לרמה של הצלקת של הניצן שהוסר הפרח (primordium). כדי להשיג זאת, ייתכן שיהיה צורך להוסיף agarose בכל קצה של הסדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר agarose הוא הוסיף, זה יציף במהירות לתוך הסדק; באמצעות פיפטה, למצוץ את חלק מומס ההרכבה agarose כדי להבטיח שmeristem הוא הנקודה הגבוהה ביותר בשקופית. זה מתקן את meristem כך שהוא לא יכול לזוז במהלך הדמיה. </li></ol> 3. דוגמאות שורש או hypocotyl הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורשים וhypocotyls, לא לנתיחה היא הכרחית. בשכבה הדקה של agarose בשקופית הזכוכית מוכנה, לעשות חריץ באופן ישיר מעל לחרוט בזכוכית או יחד lamella זכוכית. מקם את השורש או hypocotyl בחריץ זה להבטיח כי היא נמצאת בקשר עםזכוכית לכל אורכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעברתי לשלב הבא, לוודא כי המדגם הוא יבש על פני השטח שלה. אם לא, בעדינות להסיר את עודפי מים באמצעות נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה נמס הרכבה agarose סביב המדגם כמו בשלב 1.2.6. </li></ol> 4. AFM הכנה ורגישות כיול (לJPK Nanowizard AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שלוחה על AFM. שלוחה צריכה להיות מותקנת עם indenter בצורה עגולה. הרדיוס יקבע את x, y, z ברזולוציה ועומק הכניסה שבמדידה מדויקת יכולה להיות בארכיון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת מידות טווינה-ננו על פני השטח של האפידרמיס, השתמש indenter עגול 50 רדיוס ננומטר; לקחת מידות mesoscale, השתמש indenter עגול מיקרומטר רדיוס 0.5; לקחת מידות microscale (מול 2-3 תאים), השתמש indenter עגול 2.5 מיקרומטר רדיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הלייזר בקצה שלוחה. יישר את הלייזר לאמצעשל השובה באמצעות המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם כוס נקייה מתחת AFM. הערה: את הפעולות הבאות מוגדרת להפוך את האות של עמדת הלייזר על קולט AFM לעיוות של שלוחה, ועל ידי הערכת קבוע הקפיץ של שלוחה, לתרגם אותה לכוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה עם &quot;נקודה להגדיר&quot; כוח היעד של V. 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;ספקטרוסקופיה כוח&quot;. האם כניסה על ידי קביעת &quot;הנקודה להגדיר יחסי&quot; המקסימלי ל2 V, &quot;להרחיב את המהירות&quot; ל40 מיקרומטר / שנייה, ואת &quot;אורך z&quot; עד 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;כיול מנהל&quot;, בחר את החלק הליניארי של העקומה קדימה כדי להתאים את הרגישות באמצעות הכפתור &quot;בחר טווח בכושר&quot;. &quot;הנקודה להגדיר יחסי&quot; צריכה להפוך מ&quot; וולט &quot;ל&quot; מטר &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;מנהל כיול&quot;, בחר &quot;קבוע קפיץ&quot; כדי להעריך את אלasticity של שלוחה באמצעות תנודות תרמיות. לחץ על &quot;הפעל&quot; כדי להשיג את עלילת הצפיפות ספקטרלית של שלוחה. מצא את שיא התהודה עם התדר הנמוך ביותר. להתאים אותו באמצעות הכפתור &quot;בחר טווח בכושר&quot;. הערה 1: לפרטים נוספים על כוונון תנודות תרמיות, לקרוא קוק ואח&#39; 15. הערה 2: עדיף להשתמש בשיטה ישירה כדי להעריך את האלסטיות של שלוחה באמצעות שלוחה התייחסות (או חומר עם קשיחות ידועה). אחד משמש כאן נתרם באדיבות על ידי עאטף Asnacios 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 10% פתרון מניטול תחת קצה שלוחה. ליישר מחדש את הלייזר לאמצע השובה באמצעות המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל מחדש את הרגישות: מתפריט &quot;כיול מנהל&quot;, לחץ על הכפתור &quot;לא ידוע&quot;; חזור על שלבים 2.3 דרך ל2.5. </li></ol> . 5 קליטים נתונים: מודול מיפוי של יאנג לכאורה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגימות הרכובים תחת AFM ולהוסיף טיפת 500 μl של 10% פתרון מניטול על המדגם. פתרון מניטול plasmolyzes התאים בתוך דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה עם כוח יעד (&quot;להגדיר נקודה&quot;) של 20 ננ (&quot;נקודה מוגדרת&quot; לא צריכה להיות יותר מ 3 V) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסה עם &quot;נקודת מערכת יחסי&quot; של 200 NN, &quot;להרחיב את המהירות&quot; של 40 מיקרומטר / sec, ו&quot; אורך z &quot;של 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את &quot;נקודה להגדיר יחסי&quot; על מנת לקבל כניסה של 100 ננומטר ל200 ננומטר רכובים שלוחה או 0.5 מיקרומטר לשלוחה רכוב 1 מיקרומטר / 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב &quot;כוח מיפוי&quot;, בחר אזור לסריקה: לmeristems, 70 מיקרומטר x מיקרומטר 70 עם רזולוציה (&quot;פיקסלים&quot;) של 64 x 64; לhypocotyls ושורשים, עם רזולוציה של 64 x 64 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיתונות לסרוק להשיק את הניסויים. שמור את הפלט. </li&gt; </ol> . 6 ניתוח נתונים: חישובי מודול יאנג לכאורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים בתוכנה לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;עיבוד אצווה&quot; כדי להחיל את אותו ניתוח לכל העקומות של מפה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;לתקן את הגובה עבור הכיפוף של שלוחה&quot; כך כדי לחלץ את עומק הכניסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הפונקציה של יאנג מודולוס כושר&quot; שתניח הכוח הוא פרופורציונאלי לאזור של כניסה. הגדר את &quot;צורת הקצה&quot; לParabolic להניח שצורת הכניסה היא parabolic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את הרדיוס של הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מעדיף את העקומה &quot;לסגת&quot; לניתוח משום שהוא פחות רגיש לטופוגרפיה מאשר עקום &quot;להאריך&quot;. עם זאת, אם יש דבק משמעותי של החללית במהלך &quot;לסגת&quot;, להשתמש בעקומה &quot;להאריך&quot;, שאינה רגיש לדבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכהיחס פואסון ל0.5. לחץ על לנתח ולשמור את הפלט. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בצמחים, תכונות מכאניות משתנות לשחק תפקיד מרכזי בהכוונת צמיחה והמורפוגנזה. נכון להיום חלה התקדמות רבה בהתרת הרשתות הגנטיות וכימיות השולטות בגידול צמחים, אבל הידע של איך רשתות אלה תורמות ל, ומושפע משינויים בתכונות מכאניות שלנו הוא מתוצרת מקומית. שיטה זו אמורה לאפשר לנו למלא את הפער הזה, וכך זה צריך להיות אינטרס חזק למדענים ללמוד כל היבט של גידול צמחים או המורפוגנזה. כעת אנו מסכמים את האתגרים ומגבלות של השיטה, והתחזית לעתיד. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direct...

צמיחה בצמחים מושגת על ידי ההרחבה מתואמת של קירות תא הנוקשה המקיפים כל תא ותא של האורגניזם. צבירת ראיות מצביעה על כך שזאת היא באמצעות השינוי של דופן תא כימיה שצמחים מקומיים לשלוט התרחבות זו. הוא חשב ההתרחבות שמונעת בעיקר על ידי לחץ על דפנות תאים, הנגרמות על ידי לחץ turgor הגבוה של התא; תגובת זן זה ללחץ turgor נשלטת על ידי התכונות מכאניות של קירות תא 1. מעט ידוע על התכונות מכאניות הללו וכיצד הם משתנים במהלך התפתחות. יתר על כן מעט מאוד ידוע על איך התכונות מכאניות האלה נשלטות והאם פידבקים לתרום לשנות דופן תא כימיה באופן שמתואם, ככל הנראה, על פני רקמה. אם אנו רוצים להבין את הקשר בין שינויים כימיים ומכאניים בקירות תא צמח במהלך פיתוח, וסופו של דבר איך האינטראקציות מיקרוסקופיות האלה למשול צמחצמיחה מקרוסקופית של, שיטה שיכולה לפקח על תכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בקנה המידה התאי או רקמות נדרשת. שיטת מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) שתוארה כאן, המבוססת על לחיצות רקמת מיקרומטר או ננומטר או חריצים, פותח בדיוק כדי למדוד את התכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בו זמנית ברזולוציות subcellular ועל פני אזורים שלמים של רקמות. יש שיטות אחרות או ברזולוציה שהיא נמוך מדי או גבוהה מדי: extensometer היא רק מסוגלת למדוד את התכונות מכאניות הממוצעת של כל רקמה בקנה מידת מילימטר 2-4, בקנה מידה שהיא למשל גדול מדי כדי למדוד את האירועים בתחילת organogenesis; microindenter יכול לקחת מדידות ברזולוציה subcellular בקנה המידה ננומטרי, אבל זה מוגבל למדידת תאים מבודדים ולא קבוצות של תאים או איברים 5-7. עם AFM, דורשרקמת ד, סלולרית, והחלטות subcellular יכולים להיות מושגת על 8-10. לאחרונה כמה פרוטוקולים פותחו במיוחד כדי למדוד את המכניקה של רקמות צמחים שיכולים לשמש גם 11, 12. אנו נציג כאן כיצד להעריך את האלסטיות של הרקמות באמצעות מדידה של מודול יאנג לכאורה 13. מודול יאנג משמש בדרך כלל כדי לתאר את הקשיחות של חומר. במהלך עיוות קטנה את הכוח הדרוש כדי לעוות חומר הוא יחסי לאזור של כניסה. מודול יאנג הוא מקדם זה. במקרה של חומר הומוגני רציף אותו מקדם יימדד ללא קשר לסוג הכניסה (גודל וצורה), אבל ישתנה עם המהירות של המדידה. במקרה של המבנה המורכב של רקמת צמחים, ראה עד כה כי הכוח הוא פרופורציונאלי לעיוות המאפשרת הקביעהמקדם של מידתיות שאנחנו שם &quot;מודול הצעיר לכאורה&quot;. בניגוד לכך מבמדיות מתמשכת בצמחים, מודול הצעיר לכאורה זו הוא רגיש לגודל של הכניסה. זה לא מתאימות לmoduli הצעיר של דופן תא טהורה. זה הכי טוב מתאר את האלסטיות של הפיגומים של תא הקיר של הרקמה.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>כל הדור השלישי מסוגל לעשות את העבודה באותה העדפה.</td></tr><tr><td>שלב AFM</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>נדרש לדגימה עם טופוגרפיה נמוכה (פחות מ-11 ומיקרו; m בין הנקודה הנמוכה ביותר לגבוהה ביותר באזור סריקת הכוח).</td></tr><tr><td>אופטיקה של AFM אופטיקה</td><td>JPK</td><td>Top View</td><td>חשוב מאוד על מנת למקם את המדגם. ניתן להחליף במשקפת ארוכת טווח או במיקרוסקופ.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>כל סוג של מיקרוסקופ סטריאו יכול לעשות.</td></tr><tr><td>שלוחה רכובה 150 ננומטר</td><td>ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ</td><td>R150-NCL-10</td><td>כדי למדוד רק את דופן התא על פני האפידרמיס השתמש.</td></tr><tr><td>1 ומיקרו; m רכוב שלוחה</td><td>ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>למדידת המכניקה של דופן התא אורתוגונלית לפני השטח של האפידרמיס.</td></tr><tr><td>שלוחה ללא קצה</td><td>ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ</td><td>TL-NCH-20</td><td>כדי למדוד את המכניקה המקומית של הרקמה (רוחב 2-3 תאים) השתמש ב-5 ומיקרו; שלוחה רכובה מ '. חיברנו 5 ומיקרו; m חרוז בורוסיליקט לשלוחה חסרת קצה.</td></tr><tr><td>5 ומיקרו; m מיקרוספירות סיליקון</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, צרפת</td><td></td><td>Araldite לקיבוע החרוז לשלוחה חסרת הקצה.</td></tr><tr>מדשאת פישר המדעית <td>פישר נמסה</td><td>, ניו ג'רזי 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 & #176; טמפרטורת ג'לציה</td></tr><tr><td>C D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, סנט לואיס, MO 63103 ארה"ב</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 נירוסטה מס' 5 פינצטה</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, שוויץ&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

מיפוי מבוסס afm של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

אנו מתארים שיטה שפותחה לאחרונה למדידת תכונות מכאניות של פני השטח של רקמות צמח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מיקרו / ננו חריצים, לAFM JPK. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה אנו מודדים את מודול יאנג לכאורה של קירות תא ברזולוציות subcellular על פני אזורים של עד 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר בmeristems הפרחוני, hypocotyls, ושורשים. זה דורש הכנה מדוקדקת של המדגם, הבחירה הנכונה של מיקרו indenters ועומק כניסה. כדי להסביר את דופן תא אך ורק נכסים, מדידות מתבצעות בתמיסות מרוכזות מאוד של מניטול כדי plasmolyze תאים ובכך להסיר את תרומתו של לחץ turgor התא. בניגוד לטכניקות קיימות אחרות, באמצעות indenters שונה ועומקי כניסה, שיטה זו מאפשרת מדידות multiscale בו זמנית, <em&gt; כלומר ברזולוציות subcellular ועל פני מאות תאים המרכיבים רקמות. משמעות הדבר היא כי ניתן כעת לאפיין מרחבית-temporally שינויים המתרחשים בתכונות מכאניות של קירות תא במהלך התפתחות, המאפשר שינויים אלה כדי להיות מתואמים עם צמיחה ובידול. זה מייצג צעד מפתח כדי להבין כיצד שינויים תאיים מיקרוסקופיים מתואמים להביא לאירועי morphogenetic מקרוסקופית. עם זאת, מספר מגבלות יישארו: השיטה יכולה לשמש רק על דגימות קטנות למדי (כ -100 מיקרומטר קוטר) ורק ברקמות חיצוניות; השיטה היא רגישה לטופוגרפית רקמות; הוא מודד רק היבטים מסוימים של תכונות מכאניות המורכבת של הרקמות. הטכניקה מפותחת במהירות וסביר להניח כי רוב המגבלות האלה ייפתרו בעתיד הקרוב.

באיור 1 אנו מציגים מפות טיפוסיות יאנג moduli של meristems הפרחוני (איורים 1 א ו-1B) hypocotyls, צעיר ומבוגרת (דמויות 1C-F), וmeristem שורש (איור 1G ו1H). בכל הניסויים indenter הוא חצי כדור, אבל הרדיוס שלו שונה, כך שיכולות להיות מושגת על החלטות מרחביות שונות דמויות 1C ו1D להראות תוצאות אופייניות לindenters טווינה-ננומטרי (50 רדיוס ננומטר) עם חריצים טווינה-ננומטרי (ננומטר 50 עומק).; . Cartographs לח...

אנו מתארים שיטה למיפוי תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). אנו מתמקדים כיצד לתעד שינויים מכניים המתרחשים בדפנות התא במהלך התפתחות הצמח בקנה מידה בינוני בשדה רחב, מה שמאפשר לתאם את השינויים האלה עם גדילה ומורפוגנזה.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למפות תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. ראשית, הכינו למסחיות זכוכית על ידי טפטוף טיפה של aros בעל טמפרטורת התכה נמוכה על אזור חרוט של הלמסחית ליצירת שכבת aros דקה. השלב השני הוא להכין את הדגימה באמצעות דיסקציה וקיבוע.הסר את ניצני הפרחים מהגבעול, חתוך את גבעול ה-marris מהגבעול, וטמיע מיד את גבעול ה-me החתוך בשכבת ה-Agros הדקה שעל הזכוכית. לאחר מכן, הוסף מספיק Agros הרכבה מומס כדי למלא את הסדק שנוצר כאשר גבעול ה-Maris הוטמע בסרט ה-Aros. השלב הסופי הוא הגדרת מיקרוסקופ הכוח האטומי (atomic force microscope) לרכישת נתונים.בסופו של דבר, ניתוח נתונים ומדידות של מודול יאנג (Young's modulus) הנראה של דפנות התאים יוצרים מפה מכנית של תכונות דפנות התאים בו-זמנית ברזולוציות סוב-תאיות ובמרחבים של אזורי רקמה שלמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת למדוד תכונות מכניות של דופן התא בו-זמנית ברזולוציה סוב-תאית ועל פני אזור רקמה שלם. מצע ה-Aros להטמעת דגימות מכין מ-0.7% aros בטמפרטורת התכה נמוכה ב-10% mannitol במים.בעזרת מכשיר מתכת חזק, כגון ראש מקדח, חרצו שטח של 0.5 על 0.5 סנטימטר במרכז זכוכית למיקרוסקופ. פעולה זו מחשפסת את פני השטח כדי להקל על היצמדות ה-agros ולהבטיח שמצע ה-agros יידבק או יקבע לזכוכית. טפטפו בעזרת פיפטה טיפה של כ-20 microliters של מצע agros להטמעה על האזור שהחורץ בזכוכית.פעולה זו יוצרת שכבה דקה של agros. יש לאחסן את למסית הזכוכית בתיבה לחה ולהמתין עד להת굳ות מצע ה-Agros מדגימות של Arabidopsis. Ana תשמש להכנת דגימות מריסטמה עבור מיקרוסקופיית כוח אטומית.הסר את ניצני הפרח אחד אחד מהגבעול על ידי משיכתם כלפי מטה באמצעות פינצטה עדינה במיוחד. חשוב להסיר את כל ניצני הפרח עד להגעה לניצבים שאינם מראים רצפים המוכרים כשלב P one primord. בעזרת להב תער או קצה הפינצטה, חתוך את המריסטמה מהגבעול.החתך צריך להיות מקביל לאזור של פני המריסטמה שיימדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או FM. הגובה של ראש השורש (apex) שהתקבל צריך להיות בין 300 microns ל-600 microns כדי שלא יתפורר במהלך הניסוי. דחפו מיד את ראש השורש לתוך שכבה דקה של מצע aros שהוכנה מראש. בחרו מיקום על תגית הזכוכית או ה-aros ודחפו בעדינות כך שהמריסטמה תהיה במגע ישיר עם תגית הזכוכית ותבלוט החוצה מה-aros.ה-agros נסדק בעקבות הפעלת לחץ, כך שגבעול ה-mari יעמוד כעת בתוך סדק. חיוני למקם את גבעול ה-marit בתוך ה-aros בתוך שניות ספורות לאחר חיתוכו מהגבעול. פעולה זו מונעת את התייבשותו של גבעול ה-MA.ניתן להכין מספר גבעולי MA בדרך זו לצורך דימות במנות (batch imaging), בתנאי שהם באותו גובה וממוקמים במרחק של פחות מ-500 microns זה מזה. השאר את גבעולי ה-ma שהוכנו על השקופית בתוך קופסת הלחות בזמן ביצוע דיסקציה של דגימות נוספות. לפני המעבר לשלב הבא, השתמש בנייר סינון כדי להסיר בעדינות עודפי מים בגבול שבין המריסטמה לניצני הפרח.פעולה זו נועדה למנוע מהאגרס המומס להציף את הדגימה עקב כוחות קפילריים. מאוחר יותר, באמצעות פיפטה של 20 µL, יש להוסיף מספיק אגרס מומס כדי למלא את הסדק שנוצר קודם לכן ולהקיף כל מריסטמה; האגרס צריך להגיע לגובה הצלקת של ניצן הפרח שהוסר או של ה-primordium. כדי להשיג זאת, ייתכן שיהיה צורך להוסיף אגרס בכל אחד מקצות הסדק.בעת הוספת ה-agros, הוא יזרום במהירות לתוך הסדק. השתמשו בפיפטה כדי לשאוב חלק מה-agros להרכבה המומס, כדי להבטיח שגבעול ה-me הוא הנקודה הגבוהה ביותר על העגלה. פעולה זו מקבעת את גבעול ה-me כך שלא יוכל לזוז במהלך הדמיה של שורשים ו-hypo coddles.אין צורך בדיסקציה בשכבה הדקה של הג'ל. על נגחית הזכוכית המוכנה, השתמש בפינצטה מיקרוסקופית כדי ליצור חריץ, או ישירות מעל חריץ בתבנית הזכוכית או לאורך למלה של זכוכית; מקם את השורש או את השבת (hypocotyl) בחריץ זה, תוך הבטחה שהם במגע עם הזכוכית לאורך כל אורכם. הוסף ג'ל קיבוע מומס מסביב לדגימה באופן דומה לכפי שהודגם עבור דגימת הגבעול.מדריך לביצוע Nano-indentation ב-JP PK. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-FM. כדי להתחיל בהליך, התקן על ה-FM קנטילבר (cantilever) בעל שקע עגול. הרדיוס יקבע את הרזולוציה בצירים X, Y, Z ואת עומק ההחדרה שבו ניתן להשיג מדידה מדויקת.לביצוע מדידות ברמה המזו-ננומטרית על פני השטח של האפידרמיס, השתמשו בנקירה עגולה ברדיוס של 50 nanometer. לביצוע מדידות ברמה המזו-סקלית, השתמשו בנקירה עגולה ברדיוס של 0.5 micron, ולביצוע מדידות ברמה המיקרו-סקלית על פני שני עד שלושה תאים, השתמשו בנקירה עגולה ברדיוס של 2.5 micron. מקמו את הלייזר בקצה הקטיליבר. יישרו את הלייזר למרכז הקולט באמצעות המראה.מקמו זכוכית נקייה תחת גישת ה-A FM עם נקודת יעד (set point) של 1 volt, ובחרו באפשרות לספקטרוסקופיה. בצעו פניטראציה (indentation) על ידי הגדרת נקודת היעד היחסית המקסימלית ל-2 volts, מהירות ההארכה ל-40 microns per second ואת אורך ה-Z ל-5 microns. מתפריט מנהל הכיול (calibration manager), בחרו בחלק הליניארי של עקומת הפריסה (forward curve) כדי להתאים את הרגישות.באמצעות כפתור בחירת טווח ההתאמה (select fit range), יש להמיר את נקודת הset point היחסית מנפח (vol) למטר ב-200 microliters של תמיסת 10% manitol. תחת קצה הקניבלה (cantilever), יש ליישור מחדש את הלייזר למרכז הקולט באמצעות המראה, ובאמצעות הזזת המשקף (respecter), יש לכייל מחדש את הרגישות דרך תפריט מנהל הכיול (calibration manager). לחצו על כפתור unknown, בחרו באפשרות four spectroscopy, ובצעו פנימה (indentation) כפי שהודגם קודם לכן.בחר את החלק הליניארי של עקומת הדחיפה כדי להתאים את הרגישות באמצעות כפתור בחירת טווח ההתאמה (select fit range) כדי להתחיל בהליך זה, מקם את הדגימות המורכבות תחת ה-A FM והוסף טיפה של 500 µL של תמיסת manitol בריכוז 10% על הדגימות. תמיסת ה-manitol גורמת לפלסמציית התאים תוך דקות ספורות; התקרב למטרה עם נקודת ייחוס (set point) של 20 nN בדחיסה, עם נקודת ייחוס יחסית של 200 nN, מהירות התארכות של 40 µm/s ואורך Z של 5 µm. כוונן את נקודת הייחוס היחסית כדי להשיג שקיעה של 100 nm עבור קנטילבר מורכב של 200 nm, או 0.5 µm עבור קנטילבר של 1 µm.מצב מיפוי כוחות באמצעות קנטילבר מורכב של חמישה מיקרון. בחרו אזור לסריקה עבור גבעולי mar במידות של 70 על 70 מיקרון ברזולוציה של 64 על 64, ועבור hypo cos ושורשים במידות של 100 על 100 מיקרון ברזולוציה של 64 על 64. לחצו על scan כדי להפעיל את הניסויים ושמרו את הפלט.התחל בפתיחת קובץ הנתונים בתוכנה לניתוח נתונים. לאחר מכן, בחר בעיבוד אצוות (batch processing), כדי להחיל את אותו הניתוח על כל העקומות של מפה אחת.בחר את הגובה הנכון של כיפוף הקנטילבר כדי לחלץ את עומק ההחדרה. בחר את פונקציית ההתאמה עבור מודול יאנג. פונקציה זו תניח שהכוח פרופורציונלי לשטח ההחדרה.הגדירו את צורת הראש כפרבולית כדי להניח שצורת ההחדרה היא פרבולה. ציינו את רדיוס הראש. לאחר מכן, בחרו את עקומת הנסיגה (retract curve) לצורך הניתוח.עקומת הנסיגה (retract curve) מועדפת על פני עקומת ההארכה (xtend curve) כיוון שהיא פחות רגישה לטופוגרפיה. הגדירו את יחס ה-poso ל-0.5. לבסוף, לחצו על on, בצעו ניתוח ושמרו את הפלט.כאן מוצגות מפות מודולריות טיפוסיות ב-AFM של גבעולים צעירים של צמחי Mars, גבעולים היפו-קודלים צעירים וזקנים, וגבעולי שורש MA בכל הניסויים. ההטבעה היא חצי-ספירה, אך הרדיוס שלה משתנה כדי שניתן יהיה להשיג רזולוציות מרחביות שונות. מפות אלו מראות תוצאות טיפוסיות עבור הטבעות מקנה מידה מזו-ננו עד ננו, עם רדיוס של 50 nanometer ועומק הטבעה של 50 nanometer.הקרדיוגרף חושף הטרוגניות בקנה מידה מיקרוסקופי בדפנות התאים השטחיות של תאי אפידרמיס של ה-hypo codal. מוצגות גם תוצאות טיפוסיות עבור שקעים בקנה מידה מזוסקופי עם רדיוס של 500 nanometer ועומק של 500 nanometer עבור מריסטמה פרחית, hypo coddle ושורש. קרדיוגרף זה עבור שקעים בקנה מידה מיקרוסקופי עם רדיוס של 2.5 micron ועומק של 500 nanometer חשף ריכוך של הרקמה במהלך התחלת היווצרות האיברים, שקדם לכל גדילה נראית לעין.עם זאת, סריקה זו הופסקה כיוון שטווח גובה הדגימה עלה על טווח ה-Z המקסימלי של ה-AFM. תזוזה של הדגימה במהלך הניסוי עקב קיבוע לא נכון עלולה להוביל לסריקה מטושטשת, כפי שמוצג כאן. כמו כן, לא ניתן למדוד בצורה תקינה אזורים המכוסים בחומרים זרים, כפי שמוצג בדוגמה זו. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים את התהליך בשעה אחת אם הוא מבוצע כראוי.

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

פרוטוקול הכניסה למיקרוסקופיה של הכוח האטומי מציע את האפשרות לנתח את תפקיד התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תא מסוים ברקמה או באיבר במהלך גדילה רגילה או מוגבלת (כלומר, תחת גירעון מים).

מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

מחקרים על ביומכניקה של דופן התא חיוניים להבנת גדילת צמחים ומורפוגנזה. הפרוטוקול הבא מוצע לחקור דפנות תאים ראשוניות דקות ברקמות הפנימיות של איברים צמחיים צעירים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי.

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

כימות שטח המגע והכוח המופעל על ידי קצה גשושית כוח אטומי (AFM) על משטח הדגימה מאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות. נדונות שיטות עבודה מומלצות ליישום ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות למדידת מודולוס אלסטי או תכונות ננו-מכניות אחרות.

מיקרוסקופ כוח אטומי ננו-הזחה מבוססת Cantilever: מדידות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי באוויר ובנוזל

פרוטוקול זה מדמיין כיצד להכין חתכים קריוגרפיים של רקמת ריאה של עכברים, לבצע ניסויים במפת כוח במיקרוסקופ כוח אטומי ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את המודול של יאנג של קרום הבסיס הריאתי המקומי של העכבר.

חילוץ מודול הצעירים של ממברנות הבסיס הריאתיות של עכברים מקומיים ממפות כוח הנגזרות ממיקרוסקופ כוח אטומי

למדו למפות תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). שיטה זו מאפשרת מדידות ברזולוציה תת-תאית וקורלציה עם תהליכי גידול ומורפוגנזה בביולוגיה צמחית.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

גלה סרטונים נוספים