Electroporation שטח pial ילודים
7 במאי 2014
שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג ולתפעל גנטית אבות עצביים של משטח הקליפה. זה מושג על ידי החדרת פיפטת זכוכית מלאה בתמיסת DNA פלזמה לאזור פני השטח של הקליפה. השלב השני הוא הזרקת ה- DNA לחלל קרום המוח, המכסה את משטח הקילוף.
לאחר מכן, האלקטרודות מכוונות לספק זרם כראוי למשטח הקילוף. השלב האחרון הוא שה-DNA עובר אלקטרופוטציה לאבות משטח קילוף על ידי הפעלת זרם. בסופו של דבר, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות אחרות כדי להראות את ההיסטוריה הטבעית והגורמים המולקולריים של משטח הקילוף, התפשטות אב עצבי, נדידה ו/או התמיינות.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון התמרה ויראלית, הוא שהאלקטרופורציה בטוחה יותר, גמישה יותר ואינה דורשת יצירת חלקיקי וירוס או אריזה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע והאב העצביים, כגון מהי התרומה של אבות פני השטח של הקילוף הללו לרקמות, להיווצרות היסטו ולתפקוד המעגלים העצביים. כדי להתחיל, השתמש במושך פיפטות ליצירת פיפטות מצינורות נימי זכוכית לאחר משיכתם, חתוך את הקצה במספריים חדים.
לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי ירוק מהירה של 1% באמצעות מים מסוננים ללא נוקלאז. לאחר דילול מאגר EDTA ללא ריבית DNA בפלזמה נטולת אנדוטוקסין, שלב אותו בפרופורציות המתאימות לתמיסה הירוקה המהירה של 1%. בעזרת פיפטה רגילה מניחים את הכמות הרצויה של תערובת הפלסמיד להזרקה על פיסת סרט שעוות פרפין לעיון.
לאחר מכן, בעזרת מזרק מיקרו, הכנס בזהירות את פיפטת הזכוכית המורכבת לתוך הצינור המכיל את תערובת הפלסמיד. הימנע מלגעת בקצה בשולי הצינור כדי למנוע שבירה. שאב את התמיסה לתוך הפיפטה על ידי חיוג איטי לאחור של חוגת ההעברה.
לאחר טעינת נפח מספיק, חייג קדימה עד שהלחץ יחזור למצב הנייטרלי של אפס. הקטור פסקל. לאחר מכן, הנח את הקצה ליד הזרקת הייחוס והשתמש בדוושת כף הרגל ממזרק המיקרו כדי להוציא נפח אחד.
כוונן את הלחץ עד שהכמות שווה לנפח הייחוס הקודם. לאחר כיול נפח ההזרקה, אחזר את בעלי החיים להזרקת פלסמיד. לאחר אישור עומק ההרדמה, החזיקו את הגור באמצעות האגודל והאצבע המורה של היד הפחות דומיננטית.
השתמש ביד הדומיננטית כדי למקד את האזור הרצוי, חצאי הכדור בקליפת המוח ומבנים שטחיים אחרים כגון הקוליקולי העליון צריכים להיות גלויים בקלות. לאחר זיהוי המיקום הנכון, הכנס את הפיפטה מעבר לעור ולגולגולת. הקפדה על הימנעות מעורקי המוח.
כדי למקד את משטח הקליפה הפסק מיד לקדם את הפיפטה ברגע שהגולגולת חדרה עם קצה הפיפטה במיקום הנכון, הזריק את תמיסת הפלסמיד באמצעות דוושת הרגל של מזרק המיקרו לאחר ההזרקה, הסר בזהירות את הפיפטה. מנע מהקצה להתייבש ולהיסתם בין הזרקות על ידי הנחתו בטיפות הבדיקה הממוקמות על סרט הפרפין. חזור על שלבים אלה עד להזרקת כל הגורים כדי להגביר את המוליכות ולמנוע צריבה של העור.
יש לכסות את ה-TRO של פינצטת פלטינה בגודל שלושה מילימטר בג'ל אלקטרופורציה. לאחר מכן, התאימו את הגדרות האלקטרו להזרקות לקליפת המוח. הנח את הגשושית הטעונה שלילית מעל האזור המוזרק ואת הגשושית הטעונה חיובית סביב האזור הנגדי מתחת לעין.
כיוון האלקטרודה צריך להיות בזווית של 45 עד 60 מעלות ביחס לקו האמצע. השתמש בדוושת הרגל כדי להפעיל את הזרם והחזק את ה-TROs בפינצטה במקומה למשך שלושה עד חמישה פולסים. בהתאם לגיל הגור ולמשקלו, הפולסים צריכים לכוון את ה-DNA לתאי משטח הקליפה הבסיסיים.
ניתן לטאטא את הקוטב השלילי על אזור ההזרקה. בין פולסים או ניתן להשתמש באלקטרודה גדולה יותר כדי להגדיל את שטח האלקטרו מיד לאחר האלקטרופורציה, לנקות בזהירות את הג'ל מגורים ולהניח אותם מתחת למנורת חום למשך כחמש דקות. גורים יאבדו באופן חריף את הזרת האדמדמה הטבעית שלהם בדקות שלאחר האלקטרופורציה עקב ציאנוזה.
התבוננו בגורים לצורך החזרת הצבע הטבעי והתחלת תנועה רגילה לפני החזרתם לכלובים או זריקות לקולוס העליון. אתר את אזור המטרה רק אחורי ורוחבי ללמבדה ובערך בקו האמצע, עקב אחר אותם צעדים שהודגמו זה עתה. עם זריקות מוצלחות, תערובת הפלסמיד ממלאת באופן טבעי את קווי המתאר של הקולוס המעולה.
כאשר אלקטרו פועל לאחר הזרקת קולוס מעולה, הנח את הגשושית הטעונה שלילית של האלקטרודה על האזור המוזרק ואת הגשושית הטעונה חיובית סביב העין, החוטם או הסנטר. במקרה זה, כיוון האלקטרודה הוא בזווית של 25 עד 40 מעלות ביחס לקו האמצע. תמונה זו מציגה את קליפת המוח הצדדית הגבית לאחר אלקטרופורציה של פלסמידים מדווחים פלואורסצנטיים המבטאים תלתן מתויג ממברנה בירוק ותג bfp.
שני חלבונים גרעיניים מוצגים כאן בפסאודו-צבע אדום. דנדריטים נרחבים נמצאים בתא העצב הבין-קורטיקלי הזה כחודשיים לאחר האלקטרופורציה. תאים חיוביים ל-EGFP הם חיוביים ל-BRDU מה שמצביע על כך שהם התפשטו במהלך הליך האלקטרופורציה.
כאשר מנסים טכניקה זו, חשוב להתמקד במיקוד נכון של משטח הקליפה על מנת למנוע הפרעה בקליפת המוח הבסיסית ו/או בכלי הדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור התאי הגזירים העצביים על פני השטח הפיאלי (pial surface) במערכת העצבים המרכזית. הטכניקה כוללת אלקטרופורציה כדי לאפשר מחקרים תאיים ומולקולריים של שושלות תאי גזירים ומסלולי דיפרנציאציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- מניפולציה גנטית
רקע
- השכבה הפייאלית (pial surface) משמשת כאזור פרוגניטורי ייחודי במערכת העצבים המרכזית.
- הבנת אזור זה חיונית להשגת תובנות לגבי התפתחות עצבית.
- טכניקות של מניפולציה גנטית יכולות לשפר את המחקר בנושא התמיינות תאים.
- אלקטרופורציה היא שיטה בעלת ערך להחדרת DNA לתאים.
מטרת המחקר
- לסימון גנטי ולמניפולציה של תאי אב עצביים על פני השטח של הפיאל (pial surface).
- לחקירת מסלולי השיגנלינג המעורבים בדיפרנציאציה של תאים.
- להבהיר את גורלן ואת תכונותיהן של תאי הבת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החדרה של פיפטת זכוכית מלאה בתמיסת DNA של פלסמיד לאזור פני השכבה הפיאלית (pial surface).
- הזרקה של DNA לחלל הקרומי המכסה את פני השכבה הפיאלית.
- מיקום של אלקטרודות להעברת זרם אל פני השכבה הפיאלית.
- הפעלת זרם כדי לבצע אלקטרופורציה של DNA לתוך תאי פרוגניטור.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת מניפולציה גנטית יעילה של תאי פרוגניטור עצביים.
- ניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות למחקרים מקיפים.
- מקלה על חקירת השכפול, הנדידה וההתמיינות של תאי פרוגניטור.
- משפרת את ההבנה של הגורמים המולקולריים בהתפתחות העצבית.
מסקנות
- שיטת אלקטרופורציה זו היא כלי מבטיח למחקרי מדעי המוח.
- היא מספקת תובנות לגבי הדינמיקה של תאי מוצא עצביים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו להבנה מעמיקה יותר של התפתחות ה-CNS.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חקירה גנטית של תאי פרוגניטור על פני השטח של הפיאה (pial surface) נותנת מענה לפער קריטי בביולוגיה ההתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית (CNS), ומאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות הנוגעות לתאי גזע עצביים. שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי אספקת גישה מהירה וכלכלית לבחינת תרומתם של תאי הפרוגניטור לנוירוגנזה וגליוגנזה. היא מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפיכת מעקב השושלת (lineage tracing) ומניפולציה תפקודית לאפשריים, ללא עיכובים הנובעים מייצור ויראלי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות בנוגע לתפקידם של תאי פרוגניטור במשטח הפיה (pial surface) בהיסטגנזה של רקמות ובתפקוד מעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: מספק חלופה חוסכת זמן לטרנסדוקציה ויראלית, ובכך מונע את השלבים של ייצור ואריזה של וירוסים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של יעדי פרוגניטור באמצעות סימון גנטי ישיר ומניפולציה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצרים הניתנים להערכה כמותית, כגון מדדי התרבות, נדידה והתמיינות של תאי אביים.
- ערך תפעולי: משתמש בפרמטרי אלקטרופורציה סטנדרטיים (למשל, זווית אלקטרודה של 45–60°, 3–5 פולסים) להעברה עקבית בין דגימות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של מערכות ביולוגיות מאומתות לסריקת תרכובות או מסלולים בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלות באמצעות מעקב אחר גורל תאי פרוגניטור (progenitor) בהקשרי נוירוגנזה וגליוגנזה perinatal ושל מבוגרים.
- ערך תפעולי: מאפשר שילוב עם טכניקות משלימות (למשל, סימון BrdU) כדי לתקף תוצאות של שגשוג ודיפרנציאציה.
- ערך אסטרטגי: משפר את ההלימה של ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור מניפולציה של תאי פרוגניטור לגורמים מולקולריים הקובעים את התפתחות ה-CNS.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת שיפור איטרטיבי של אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאי פרוגניטור.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי תרומתם של תאי פרוגניטור להיסטוגנזה ולתפקוד המעגלים באמצעות מניפולציה גנטית ישירה.
- סריקה: מספקת מערכות מוכנות לבדיקה עם תוצאות מדידות של proliferasie ונדידה של תאי פרוגניטור לאחר electroporation.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של משתנים תלויים, כגון קו-לוקליזציה של תאי BrdU+ וביטוי של רפורטר פלואורסצנטי לצורך השוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול התנהגות תאי פרוגניטור בהקשרי CNS פרינטאליים ובמבוגרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר עבור חקירה גנטית על פני שלבי התפתחות ומודלים של פציעות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהיפותזות המכוונות לתאי פרוגניטור באמצעות גישה גנטית ישירה.
- ערך תפעולי: מציע סטנדרטיזציה וגמישות בהשוואה לשיטות ויראליות, ללא צורך בייצור חלקיקים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות לוולידציה מהירה וחסכונית של מטרות באוכלוסיות פרוגניטור של ה-CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכון של מטרות פרוגניטור בהתבסס על תוצאות של מניפולציה פונקציונלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוכירורגיה ובטיפול בבעלי חיים בשלבים עובריים ואחרי הלידה לצורך מיקום מדויק של הפ pipette.
- תלוי בציוד אלקטרופורציה ובפינצטות פלטינה מצופות ג'ל להעברת זרם.
- מחייב סטנדרטיזציה של נפח ההזרקה ושל זווית האלקטרודות (25–60° ביחס לקו האמצע) בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה לגילאים, משקלים ואזורי מטרה שונים של הגורים (למשל, קורטקס לעומת גבעולות עליונות).
- מוגבל על ידי הצורך להימנע מהרס כלי דם ומנזק קורטיקלי במהלך חדירה לרקמות שטחיות.
