Name: הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: למד ליצור מטריצה טבעית מתאי פיברובלסטים לחקר פלישת תאי סרטן. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת סוגי תאי סטרומה שונים על התנהגות תאי הגידול במודל תלת-ממדי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

APS נתמך על ידי דברה הבינלאומית וקרן העור הבריטית. YZN נתמך על ידי A * STAR - אוניברסיטת דנדי שותפות PhD התכנית.

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת עקרונות הלסינקי ואושרה על ידי ועדת האתיקה המתאימה. 1. הכנת מדיה וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 200x של מניית 2 פוספט L-חומצה אסקורבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 29 מ&quot;ג L-חומצה אסקורבית 2 פוספט לכל 5 מיליליטר של התמיסה השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) ולסנן דרך 0.22 מיקרומטר סינון הממברנה. חנות כaliquots סטרילי 0.25 מיליליטר ב-20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.25 מיליליטר aliquot של מניית 2 פוספט L-חומצה אסקורבית 200x לכל 50 מיליליטר של תקשורת פיברובלסטים (DMEM עם 1% L-גלוטמין ו10% בסרום שור עוברי) ביום הנדרש, לריכוז סופי של 0.1 מ&quot;מ של L -חומצה אסקורבית 2 פוספט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תקשורת צמיחת keratinocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד והתרבות של קרטינוציטים SCC העיקריים תוארו בעבר 21. הכנה של תקשורת צמיחת keratinocyte מתוארתבו גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, להכין את התקשורת באופן הבא: 300 מיליליטר של DMEM ושל ה-F-12 של שינקין 100 מיליליטר בתוספת 10% FBS 0.4 מ&quot;ג / מיליליטר הידרוקורטיזון 5 מ&quot;ג / מיליליטר אינסולין 10 ng / ml EGF 5 מ&quot;ג / מיליליטר transferrin 8.4 ng / רעלן הכולרה מיליליטר 13 ng / liothyronine מיליליטר פתרון פניצילין, סטרפטומיצין 1x </li></ol></li></ol> 2. במבחנה הבנייה של מטריקס Native נגזר פיברובלסטים בL-חומצה אסקורבית 2-פוספט בתוספת התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים 200,000 fibroblasts היטב לכל 6 צלחות היטב (20,000 תאים / 2 סנטימטר) בתקשורת פיברובלסטים בתוספת של L-חומצה אסקורבית 2 פוספט. Refeed כל 2-3 ימים עם 2-5 מיליליטר של תקשורת. (הערה: תדר ונפח Refeeding עשוי להיות מותאם כך שיתאימו לצרכימים האישיים של תאים שונים ראה &quot;דיונים&quot;.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה עבה של תאים משובצים במטריצה ​​תאית תהווה בסופו של 6 שבועות, גלויים לעין בלתי מזוינת ( <strong&gt; איור 1). לשחרר שכבה זו מצלחת תרבית רקמה, בעדינות לגרד ההיקף של מטריקס עם קצה micropipette 1 מ&quot;ל ולאחר מכן דחף את הקצוות של המטריצה ​​לכיוון מרכז הבאר. זו שכבה של תאים ומטריקס (מטריצה ​​מקורית) צריכה להיות בקלות להסרה מפני שטח הצלחת, ועכשיו כמרחף בתקשורת. מורחים את המטריצה ​​המקורית בתקשורת להימנע מכך מתקפל על עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לצוף מטריצה ​​המקורית ולשפץ במשך 5 ימים, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים. בשל חוזק מתיחה ושיפוץ פנימי בתוך מטריצה, המטריצה ​​תתכווץ באופן דרסטי והפכה מופחת למטריצה ​​מקורית קטנה יותר, אבל עבה יותר, והוא מוכן להיות מנוצל עבור assay פלישה. </li></ol> 3. הפלישה Assay עם גידול SCC קרטינוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את המטריצה ​​המקורית בעדינות עם מלקחיים בוטים ולהעביר לרשת ניילון. פעם אחת ברשת ניילון, להפיץ את מטריקס בעדינות לשכב שטוח ככל האפשר באמצעות micropipette מיליליטר 1טיפ ומלקחיים בוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הגלילים משובטים סטריליים על ידי מריחת כמות קטנה של וזלין סטרילי בקצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הגלילים המשובטים במטריצה ​​המקורית, עם צד זלין למטה. זאת על מנת להבטיח חותם חזק בין מטריקס היליד והטבעות המשובטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תאי CSCC לצילינדרים המשובטים (250,000 תאים בשל תקשורת צמיחת keratinocyte 100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגלילים המשובטים לאחר 6 שעות כאשר תאי CSCC התיישבו על המטריצה ​​המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את רשת ניילון עם המטריצה ​​המקורית ותאי CSCC לממשק אוויר נוזלי על תמיכת רשת תיל פלדה אל חלד מכופפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה צמיחת keratinocyte בתוספת חומצה אסקורבית עד רמת התקשורת נוגעת בחלק התחתון של המטריצה ​​המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת בכל 2-3 ימים וקציר בשעה 7 ו14 ימים שלאחר זריעה של תאי CSCC. </li></ol> 4. קציר של תרבויות 3D והכנה להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן בסעיף 4%לילה aformaldehyde בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את הדגימות ולהטביע בשעווה ללוקים מוטבעים פרפין קבוע פורמלין, עם משטח החיתוך פונה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להטביע את הדגימות נחצו בOCT ו Snap-להקפיא באופן מיידי בחנקן נוזלי ללוקי רקמות קפואים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 4 מיקרומטר סעיפים על microtome וdewax (במידת צורך). כתם באמצעות haematoxylin ו eosin סטנדרטיים. כדי להמחיש את תאי CSCC, נוגדן חד שבטי עכבר נגד קרטין 14 (LL001, בתוך הבית) ניתן להשתמש בצביעת immunohistology. </li></ol>

<ol><li>Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+tissue+formed+in+vitro+and+accepted+as+skin-equivalent+tissue+of+full+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness.</a> Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).</li>
<li>Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis+and+induction+of+the+67+kD+keratin+polypeptide+by+culture+of+human+keratinocytes+at+the+liquid-air+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.</a> Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).</li>
<li>Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).</li>
<li>Prunieras, M., Régnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+culturing+human+epidermal+cells+on+allogenic+or+xenogenic+skin%3A+preparation+of+recombined+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chir.+Plast%22%5BJournal%5D)">New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts.</a> Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-%CE%BAB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+collagen+and+other+proteins+of+the+skin+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits.</a> Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).</li>
<li>Ehrmann, R. L., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+cells+on+a+transparent+gel+of+reconstituted+rat-tail+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen.</a> J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+active+growth+factors+in+basement+membrane+Matrigel+suggests+caution+in+interpretation+of+cellular+activity+related+to+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components.</a> Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BD+Biosciences+-+Discover+Labware%5BTitle%5D)+AND+%22SPC-356230+Rev+5.0+at+Rev+5.0%22%5BJournal%5D)">BD Biosciences - Discover Labware.</a> SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://SPC-356230 Rev 5.0">http://SPC-356230 Rev 5.0</a> Forthcoming.</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Predisposition+to+Cutaneous+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+human+type+VII+collagen.+Complete+primary+sequence+of+the+alpha+1%28VII%29+chain+and+identification+of+intragenic+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms.</a> J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).</li>
<li>Hovnanian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+to+the+type+VII+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).</li>
<li>Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+type+VII+collagen+%28COL7A1%29+to+dominant+dystrophic+epidermolysis+bullosa+in+families+with+abnormal+anchoring+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils.</a> J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).</li>
<li>Ng, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-derived+dermal+matrix+drives+development+of+aggressive+cutaneous+squamous+cell+carcinoma+in+patients+with+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).</li>
<li>Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+15%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 15.</a> Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+human+skin+produced+in+vitro+and+grafted+on+athymic+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice).</a> Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+squamous+cell+carcinoma+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines.</a> Methods Biol. 731, 151-159 (2011).</li>
<li>Pinnell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+collagen+biosynthesis+by+ascorbic+acid%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review.</a> Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).</li>
<li>Hata, R., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+2-phosphate+stimulates+collagen+accumulation%2C+cell+proliferation%2C+and+formation+of+a+three-dimensional+tissuelike+substance+by+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts.</a> J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בשל אופייה של ניסוי זה, את הסך כל הזמן הנדרש להשלמה יכול להיות עד חודשים. במשך כל הזמן הזה, שיטות טיפול ותרבות רקמת סטרילית עליונה חייבים להיות מועסקות על מנת למנוע זיהום חיידקים. מלבד תפקידה כcofactor בסינתזה של hydroxyproline וhydroxylysine של collagens, חומצה אסקורבית מגרה ביטוי קולגן הספציפי mRNA בfibroblasts 22. החומצה אסקורבית של...

השימוש בחומר ביולוגי בתרבית רקמת 3D אפשר לחוקרים ללמוד על התנהגות תא במעבדה בתנאים פיסיולוגיים דומים יותר לסביבת in vivo מזה של אחד סכם עם הידבקות 2D ומצע פלסטיק. בפרט, צעדים גדולים קדימה נעשו בדוגמנות epithelia מרובדת עם האימוץ של שיטות תרבות 3D בממשק האוויר הנוזלי 1-4. טכניקות כגון נאמנות לחקות בידול keratinocyte ופלישת תאים סרטניים המאפשרת גמישות רבה יותר ונאמנות לחוקרים לומדים תהליכים אלה. הבחירה של מצע ביולוגי לחקות את סביבת סטרומה הייתה כרוכה בעיקר השימוש בסוג אני קולגן, מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל והדרמיס דה epidermized. לדוגמא, fibroblasts הסרטן קשור הוכחו לתרום לפלישת סרטן 5, ייזום, והתקדמות באמצעות אינטראקציות סטרומה אפיתל 6,7 when גדל במצעים כאלה. תקן הזהב עבור מחקה את סביבת סטרומה בעור, האפיטל מרובדת הגדול ביותר והנחקר ביותר תוך שימוש בטכניקות כגון, נחשב להיות דה epidermized הדרמיס אנושי (DED). הכנת DED כוללת את ההסרה של האפידרמיס באמצעות trypsinization או התנערות פיזית מ3,4 עור גופת אדם. עם זאת, גישה לעור כזה יכול להיות קשה מאוד למעבדות אינן קשורות למוסדות קליניים, והדרמיס החולה הוא כמעט בלתי אפשרי להשגה. כחלופה, מעבדות לעתים קרובות להשתמש בשילוב של סוג אני קולגן (מבודד מזנבות עכברים) ו / או מטריצת סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל. לאחר הגילוי, בשנת 1927 Nageotte 8 קולגן שיכול בקלות להיות מבודד באמצעות חומצה אצטית ומשקעי מלח, היישום שלה לתרבית רקמה היה חלוץ לאחר מכן על ידי Huzelלה ולעמיתי 9. ציפוי קולגן הוכיח שהוא עדיף על זכוכית לתרבית תאים של 29 זנים וexplants רקמות כנחקרו על ידי אהרמן ו -9 גיי. נכון לעכשיו, הסוג העיקרי של הקולגן המשמש בתרבית רקמה מבודד מגידי עכברוש זנב, והוא בדרך כלל קנה ממקורות מסחריים. עם זאת, החסרון לשחזור מצע נאמן הוא כי קולגן זנב החולדה אינו זהה לקולגן אנושי, או הדרמיס האנושי, שבו אני והסוג III collagens נמצאים כמרכיבים עיקריים, וקולגן זנב חולדה המבודד הוא תמיד מקוטע. מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל הוא תערובת חלבונים דביקה מופרש על ידי תאי סרקומה העכבר בתרבית Engelbreth-Holm-נחיל 10. המרכיבים העיקריים הם laminin, קולגן הסוג IV, proteoglycan סולפט הפרין, entactin וnidogen והיחסים של חלבונים אלה המדויקים ישתנו מיצוו כדי אצווה. מלבד פרו מבנייםteins, מטריצה ​​זו מכילה גם רמות משמעותיות של גורמי גדילה כגון הפיכת β גורם גדילה, גורם גדילה באפידרמיס, גורם גדילה דמוי אינסולין 1, גורם גדילה פיברובלסטים שור, ונגזר גורם גדילה של טסיות דם אשר היה לשנות את התנהגות 11,12 סלולרית. והצביע לעבר המורכבות העצומה של מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל, סך של 1,851 חלבונים זוהו במחקר proteomic האחרון 13. לאור הטבע העשיר ומורכב של מטריצה ​​זו, זהירות כבר יעצה כאשר לפרש ומשווה ניסויים שונים עם השימוש בו 11. יש המעבדות שלנו עניין רב במחלות עור גנטיות, בעיקר אלו עם נטייה לפיתוח קרצינומה של תאים קשקשיים עורית (CSCC) 14. במקרה של ולוזה רצסיבי epidermolysis dystrophic (RDEB), מחלה שלפוחיות חמורה עם מוטציות בתאי מין בגן COL7A1 <sעד&gt; 15-17, יש לנו קבענו כי microenvironment עורי בחולים אלו הוא גידול קידום 18. במהלך מחקר זה היינו להעריך את הגידול בקידום נכסים של fibroblasts עורי מוטבע בתוך מטריצת הקולגן סרקומה עכבר אני / Engelbreth-Holm-נחיל וחקר דרכים להערכת מטריקס הילידים, &quot;התאים שלו. כדי להשיג זאת, אנו שונה בטכניקה קודמת מהמעבדה של לוסי ז&#39;רמן עובד על עור אנושי ושווי 19,20. הטכניקה של ז&#39;רמן הצליחה לשחזר עור אנושי עם קרום במרתף מאורגן היטב באמצעות תרביות keratinocyte ופיברובלסטים האנושיים ראשוניות בהעדר פיגום סינטטי או מת. עמ &#39;במאמר זה את הצעדים המשמשים לשחזר microenvironment עורית סטרומה גידול (מטריצה ​​מקורית) נגזרים באופן ישיר מfibroblasts סטרומה העיקרי במבחנה מתוארות 18. מטריצות שפת אםroduced ידי תרבות לטווח הארוך של fibroblasts שמשו עורי שווה ערך לassay לפלישת תא CSCC. אנו מציגים נתונים באמצעות מטריצה ​​מקורית נגזרה משתי המטריצה ​​תאית מופרש על ידי fibroblasts RDEB (חסר בסוג VII קולגן (C7)) או מfibroblasts RDEB retrovirally transduced עם קולגן סוג VII להביע לבנות ולהדגים את ההשפעה העמוקה של קולגן יחיד על גידול תא פלישה.

<table><tbody><tr><td>L-חומצה אסקורבית 2-פוספט</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם L-גלוטמין, 4,500 מ"ג/ליטר D-גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100x פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>וזלין</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>צילינדרים משובטים</td><td>סיגמא</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>ניילון נטו מסנן דיסק הידרופילי 100 & #956; מ 25 & #956; קוטר m 100/pk</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>תמיכת רשת תיל נירוסטה כפופה</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>המידות נעשו כך שהרשת תתאים לצלחות 6 בארות</td></tr></tbody></table>

הנדסת רקמות של גידול סטרומה microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

תרבויות organotypic 3D של תאי האפיתל במטריצה ​​משובצת עם תאי mesenchymal נמצאות בשימוש נרחב ללמוד התמיינות תאי אפיתל ופלישה. סוג הזנב של עכברוש אני קולגן ו / או מטריצה ​​שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל כבר מועסק באופן מסורתי כמצעים למודל המיקרו מטריקס או סטרומה שלתוכו תאי mesenchymal (בדרך כלל fibroblasts) מאוכלסים. למרות שניסויים באמצעות מטריצות כאלה הם מאוד אינפורמטיבי, ניתן לטעון כי בשל נוכחות מכרעת של חלבון יחיד (כמו בסוג אני קולגן) או תכולה גבוהה של רכיבי קרום במרתף וגורמי גדילה (כמו במטריקס נובע מעכבר תאי סרקומה), מצעים האלה לא הטובים ביותר משקפים את תרומתו להרכב מטריצה ​​שנעשתה על ידי תאי סטרומה בעצמם. ללמוד מטריצות ילידים המיוצרים על ידי fibroblasts עורי הראשוני בודד מחולים עם גידול הפרעת שלפוחיות גנטית (dystrophic נוטה, רצסיביולוזה epidermolysis), יש לנו להתאים פרוטוקול מטריצה ​​מקורי קיים ללמוד פלישת תא גידול. Fibroblasts מושר לייצר מטריצה ​​שלהם על פני תקופה ממושכת בתרבות. מטריצה ​​מקורית זה היא אז מנותק ממנת התרבות ותאי אפיתל הם זורעים על זה לפני כל coculture מועלה לממשק אוויר הנוזלי. בידול ו / או פלישה נייד אז ניתן להעריך לאורך זמן. טכניקה זו מספקת את היכולת להעריך אינטראקציות תא אפיתל-mesenchymal בסביבת 3D ללא הצורך במטריצה ​​סינתטית או זרה עם החסרון היחיד להיות תקופה הממושכת של זמן הנדרש כדי לייצר את המטריצה ​​המקורית. כאן אנו מתארים את היישום של טכניקה זו על מנת להעריך את יכולתה של מולקולה בודדת לידי ביטוי על ידי fibroblasts, סוג VII קולגן, כדי לעכב את הפלישה של תאים סרטניים.

<html> טכניקה זו פותחת את האפשרות לבחון ולהשוות את ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים (במקרה זה CSCC) תחת סביבות סטרומה 3D שונות. באמצעות טכניקה זו, לא רק מטריצות ילידי C7-לקויים שנכנעו שוב לסביבת עורי RDEB יכולות להיות שנוצרו, אלא גם מטריצות נוספות שעברו הנדסה גנטית כדי C7-מעל מפורש 18. כפי שניתן לראות בתרשים 2, פלישה לקרטינוציטים RDEB CSCC היה מפגרת באופן משמעותי במטריצות ילידי C7-ביתר לעומת שליטת RDEB C7-לקויה. פלישה זו היא מדמיין באמצעות שיטות היסטולוג...

מטריצה ​​מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא לייצר מטריצה טבעית מפיברובלסטים לצורך הערכת פלישה של תאי גידול. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול פיברובלסטים על פלסטיק במצע עשיר בחומצה סורבית כדי לייצר את המטריצה הטבעית. בשלב השני, המטריצה הטבעית מופרדת ומשוחררת ממשטח הגידול הפלסטי, ולאחר מכן זורעים על מטריצה זו תאי גידול ומרימים אותה לממשק אוויר-נוזל לאחר פרק זמן קבוע.תרביות תלת-ממדיות אלו נאספות לצורך אנליזה היסטולוגית של פלישת תאי הגידול. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעות המטריקס של הפיברובלסטים הטבעיים על פלישת תאי הגידול באמצעות אנליזה אימונוהיסטולוגית. לפיכך, היתרון של טכניקה זו ליצירת תרביות תלת-ממדיות טיפיות הוא היכולת להעריך מטריקס טבעית המיוצרת על ידי הפיברובלסטים עצמם, ללא תסמיכים סינתטיים או זרים, כגון קולגן מסוג 1 ממין אחר. התחל בזריעה של 200,000 פיברובלסטים לבאר בלוחיות שש בארות במצע גידול לפיברובלסטים, בתוספת IC acid שהוכן טרי.יש להאכיל את התאים בכל יומיים עד שלושה ימים באמצעות 2 עד 5 מיליליטר של מצע טרי. בשלהי ששת שבועות תיווצר שכבה עבה של תאים השקועים במטריקס חוץ-תאי הנראית לעין. בהתאם לסוג התאים שנעשה בהם שימוש, המטריקס הנראה עשוי להיווצר מוקדם או מאוחר יותר, ועשוי להתחיל להיפרד מהצלחת כפי שנראה כאן.כדי לשחרר שכבה זו ממעטפת תרבית הרקמה, גרדו בעדינות את היקף המטריקס באמצעות טיפ של מיקרו-פיפט של 1 ml, ולאחר מכן דחפו את קצוות המטריקס לעבר מרכז הבאר. התאים והמטריקס הטבעי אמורים להיפרד בקלות מפני השטח של המעטפת ולצוף כעת במצע הגידול. פרסו את המטריקס הטבעי בתוך המצע כדי למנוע ממנו להתקפל לתוך עצמו.הניחו למטריקס הטבעי לצוף ולעבור עיצוב מחדש (remodel) במשך חמישה ימים, תוך המשך החלפת המדיום מדי יומיים עד שלושה ימים בשל חוזק המתיחה והעיצוב המחדש הפנימי. המטריקס יתכווץ באופן משמעותי ויצטמצם למטריקס טבעי קטן יותר אך עבה יותר, ובשלב זה הוא יהיה מוכן לשימוש עבור בדיקת הפלישה (invasion assay).עבור בדיקת הפלישה (invasion assay). ראשית, השתמשו בפינצטה קהה כדי להעביר בעדינות את המטריקס הטבעי לרשת ניילון. לאחר ההעברה לרשת, השתמשו בקצה של מיקרופיפט של 1 mL ובפינצטה קהה כדי לפרוס בעדינות את המטריקס כך שיהיה שטוח ככל האפשר.בשלב הבא, מרחו כמות קטנה של וזלין על קצה אחד של צילינדר קלונאלי סטרילי אחד לכל מטריצה. לאחר מכן, הניחו את הצילינדרים על המטריצות הטבעיות כאשר צד הוזלין פונה כלפי מטה, כדי להבטיח איטום הדוק בין המטריצה הטבעית לטבעות הקלונאליות. כעת, הוסיפו לצילינדרים 250,000 תאי קרצינומה של תאי קשקש עוריים או תאי SCC במצע גידול carat site.לאחר שתאי ה-SCC העוריים שקעו על המטריקס הטבעי, הסר את הגלילים, ולאחר מכן הרם את המטריקס הטבעי מרשת הניילון ואת תאי ה-SEC העוריים לממשק אוויר-נוזל, ועליהם תמיכת רשתית מחוט פלדת אל-חלד כפוף. לבסוף, הוסף מצע גידול לקראטינוציטים, המועשר בחומצה סורבית, עד שגובה המצע יגעה בתחתית המטריקס הטבעי; החלף את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים ובצע קציר ביום השביעי וביום ה-14 לאחר זריעת תאי ה-SCC העוריים. טכניקה זו פותחת את האפשרות לבחון ולהשוות את התנהגות הפלישה של תאי גידול תחת סביבות סטורמליות תלת-ממדיות שונות.כפי שניתן לראות בתמונות אלו, הפלישה של קרטינוציטים מ-SCC עורי של RDEB עוכבה באופן משמעותי בתאי C seven המבטאים ביתר על מטריצות טבעיות (בפאנלים הימניים) בהשוואה לבקרי RDEB של C seven חסרים (בפאנלים השמאליים). הפיתוח של טכניקה זו אפשר לחוקרים להעריך באופן ישיר את השפעת המטריצה הטבעית המיוצרת על ידי פיברובלסטים על תהליכים של תאי גידול, כגון פלישה.

tissue-engineering-tumor-stromal-microenvironment-with-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים סרטניים.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של שימוש במטריצה טבעית לחקר פלישת תאי גידול. הטכניקה המשמשת בבדיקה זו מספקת את היכולת להעריך אינטראקציות תאים אפיתליאליים-מזנכימליים בסביבה תלת-ממדית ללא צורך במטריצה סינתטית או זרה.

בדיקת פלישת תאי גידול: שיטה תלת-ממדית מבוססת מטריצה טבעית במבחנה להערכת אינטראקציות תאים אפיתל-מזנכימליים

שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

למד ליצור מטריצה טבעית מתאי פיברובלסטים לחקר פלישת תאי סרטן. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת סוגי תאי סטרומה שונים על התנהגות תאי הגידול במודל תלת-ממדי.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

גלה סרטונים נוספים