הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן
18 במרץ 2014
מטריצה מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.
המטרה הכוללת של ההליך הבא היא ליצור מטריצה מקורית מפיברובלסטים להערכת פלישת תאי הגידול. זה מושג תחילה על ידי גידול פיברובלסטים על פלסטיק במדיה מועשרת בחומצה סורבית כדי ליצור את המטריצה המקורית. בשלב השני, המטריצה המקורית מנותקת ומשתחררת ממשטח הגידול הפלסטי, ואז מטריצה זו נזרעת בתאי גידול ומורמת לממשק נוזל האוויר לאחר תקופה קבועה.
תרביות תלת מימד אלה נקצרות לניתוח היסטולוגי של פלישת תאי הגידול. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההשפעות של מטריצת הפיברובלסטים המקורית על פלישת תאי הגידול על ידי ניתוח היסטולוגי חיסוני. אז היתרון של טכניקה זו ליצירת תרביות טיפוסיות תלת מימדיות הוא שאנו יכולים להעריך מטריצה מקומית המיוצרת על ידי פיברובלסטים עצמם בהיעדר מצעים סינתטיים או זרים, כגון קולגן מסוג אחד התחל בזריעת 200,000 פיברובלסטים לבאר בשש צלחות באר במדיה של פיברבלסטים, בתוספת חומצת IC שהוכנה טרייה.
שני פוספטים מחדשים את התאים כל יומיים-שלושה עם שניים עד חמישה מיליליטר של מדיה טרייה. שכבה עבה של תאים המוטמעת במטריצה חוץ-תאית הנראית לעין בלתי תיווצר בתום שישה שבועות. בהתאם לתאים המשמשים, המטריצה הנראית לעין עשויה להיווצר במוקדם או במאוחר ועשויה להתחיל להתנתק מהצלחת כפי שניתן לראות כאן.
כדי לשחרר שכבה זו מצלחת תרבית הרקמות, יש לגרד בעדינות את היקף המטריצה בעזרת קצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד, ואז לדחוף את שולי המטריצה לכיוון מרכז הבאר. התאים והמטריצה המקורית אמורים להתנתק בקלות משטח הצלחת וכעת לצוף במדיה. פזרו את המטריצה המקורית בתוך המדיה כדי למנוע ממנה להתקפל לתוך עצמה.
תן למטריצה המקורית לצוף ולעצב מחדש במשך חמישה ימים, והמשיך להחליף את המדיה כל יומיים-שלושה עקב חוזק מתיחה ושיפוץ מהותי. המטריצה תתכווץ באופן דרסטי ותצטמצם למטריצה מקורית קטנה יותר אך עבה יותר, ואז היא תהיה מוכנה לשימוש. לבדיקת הפלישה.
לבדיקת הפלישה. ראשית השתמש במלקחיים קהים כדי להעביר את המטריצה המקורית בעדינות לרשת ניילון. לאחר הרשת, השתמש בקצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד ומלקחיים קהים כדי לפזר בעדינות את המטריצה כך שתשכב שטוחה ככל האפשר.
לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של וזלין על קצה אחד של גליל משובט סטרילי אחד לכל מטריצה. לאחר מכן הנח את הצילינדרים על המטריצות המקוריות וזלין כלפי מטה כדי להבטיח אטימה הדוקה בין המטריצה המקורית לטבעות המשובטים. כעת הוסף לגלילים 250,000 קרצינומה של תאי קשקש עוריים או תאי SCC במצע גידול באתר קראט.
לאחר שתאי ה-SCC העוריים התיישבו על המטריצה המקורית, הסר את הצילינדרים, ואז הרם את מטריצת רשת הניילון המקורית ותאי ה-SEC העוריים לממשק נוזל האוויר, ועל תמיכת רשת תיל נירוסטה כפופה. לבסוף, הוסף את מצע הגידול של קרטינוציטים, בתוספת חומצה סורבית עד שרמת המדיה נוגעת בתחתית המטריצה המקורית, החלפת המדיה כל יומיים-שלושה וקטיף בשבעה ו-14 ימים לאחר הזריעה של תאי ה-SCC העוריים. טכניקה זו פותחת את האפשרות לבחון ולהשוות את ההתנהגות הפולשנית של תאי גידול בסביבות סטרומליות תלת-ממדיות שונות.
כפי שניתן לראות בתמונות אלה, הפלישה של קרטינוציטים SCC עוריים RDEB התעכבה משמעותית ב-C 7 על פני ביטוי מטריצות מקוריות בפאנלים הימניים בהשוואה ל-C שבע בקרות RDEB חסרות בפאנלים השמאליים. פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים להעריך ישירות את ההשפעה של מטריצה מקורית המיוצרת על ידי פיברובלסטים על תהליכי תאי גידול כגון פלישה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת מטריצה טבעית מפיברובלסטים לצורך חקר פלישת תאי גידול. המתודולוגיה מאפשרת להעריך את השפעתם של סוגים שונים של תאי סטרומה על הביולוגיה של תאי הגידול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסת רקמות
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- מטריצות המופקות מפיברובלסטים מספקות סביבה טבעית לצמיחת תאים.
- הבנת פלישת תאי גידול היא קריטית למחקר הסרטן.
- תרביות בתלת-ממד יכולות לדמות תנאי in vivo באופן מדויק יותר מאשר תרביות בדו-ממד.
- מטריצות טבעיות מונעות את הסיבוכים הכרוכים בתשתיות סינתטיות.
מטרת המחקר
- ליצירת מטריקס טבעית המופקת מפיברובלסטים.
- להערכת ההשפעות של מטריקס זו על התנהגות תאי גידול.
- לשיפור ההבנה של האינטראקציות בין הגידול לסטרומה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיברובלסטים גודלים במצע מועשר בחומצה סורבית.
- המטריקס הטבעי מופרד ממשטח הפלסטיק.
- תאי גידול נזרעים על המטריקס.
- תרביות תלת-ממדיות נבדקות היסטולוגית כדי לאתר פלישת גידול.
תוצאות עיקריות
- המטריקס הטבעי תומך בשגשוג של תאי גידול.
- ניתוח היסטולוגי חושף תובנות לגבי דפוסי פלישה של הגידול.
- סוגים שונים של תאי סטרומה משפיעים על התנהגות תאי הגידול.
- שיטה זו מספקת מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לצורך מחקר.
מסקנות
- המטריקס המופק מפיברובלסטים הוא כלי בעל ערך למחקר הסרטן.
- הוא משפר את ההבנה של מיקרו-סביבות של גידולים.
- גישה זו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו מאפשרת הערכה ישירה של השפעת המטריקס החוץ-תאי המופרש מפיברובלסטים על פלישת תאי גידול, ובכך מספקת מודל רלוונטי פיזיולוגית לאינטראקציות בין הסטרומה לגידול. על ידי ביטול השימוש בתשתיות סינתטיות, היא משפרת את רמת הוודאות החיזויית בתיקוף מטרות פרה-קליני ובצמצום סיכונים מכניסטיים של טיפולים מווסתים-סטרומה. גישה זו תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים המתמקדים בתרומת הסטרומה להתקדמות הסרטן.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של רכיבי מטריקס ממקור סטורמלי במערכי בדיקה של פלישה גידולית.
- ערך תפעולי: מספק מערכת תרבית תלת-ממדית רלוונטית לבני אדם לצורך הפחתת סיכונים בבחינת מטרות סטורמליות.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מולקולות סטורמליות, כגון type VII collagen, בוויסות התנהגות גידולית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת מטריצות טבעיות סטנדרטיות עבור קריאות ניתנות לשחזור של פלישת תאי גידול.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה היסטולוגית כמותית של עומק ותבנית הפלישה לאורך זמן.
- ערך מדעי: מקל על השוואת הפלישה בין תנאי סטרומה המוגדרים גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה רצף בין גידול לרקמה תומכת (סטרומה) אנושית באמצעות פיברובלסטים המופקים ממטופלים.
- ערך תפעולי: תומך בניתוח פלישה אורכי ביום ה-7 וה-14 לאחר הזריעה.
- ערך מדעי: מקשר בין הרכב המטריקס הסטרומלי לבין פנוטיפ פולשני בקרצינומה של תאי קשקשת.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות בסטרומה ועד לתיקוף תפקודי במבחני פלישה בתלת-ממד (3D), ובכך היא מספקת מידע לבחירת מועמדים מובילים לסוכנים המווסתים את הסטרומה.
- ביולוגיה של גילוי: בחינת השערות לגבי השפעת המטריקס הסטרומלי על מסלולי פלישה אפיתליאליים.
- סריקה: ביצוע בדיקות פלישה עם מטריקסים סטנדרטיים שנוצרו על ידי פיברובלסטים לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליזה: אספקת נקודות קצה היסטולוגיות לכימות הפלישה תחת תנאים סטרומליים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: שימוש בפיברובלסטים המופקים מחולים למידול תרומות סטרומליות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור ביולוגיה סטרומלית על פני סוגים שונים של גידולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד השפעות המטריקס הסטרומלי מסובסטרטים חיצוניים.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור סטנדרטי של מטריקס והקמת בדיקה אחידה בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי חשיפת תלויות סטרומליות בפלישת גידולים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים המכוונים לסטרומה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית פיברובלסטים ראשוניים ובהנדסת רקמות בתלת-ממד.
- תלוי בתרבית לטווח ארוך (עד שישה שבועות) להשקעת מטריקס טבעית.
- מחייב טיפול סטרילי להסרת המטריקס, לזריעת תאי גידול ולתרבית בממשק אוויר-נוזל.
- כולל עיבוד היסטולוגי ודימוג לצורך ניתוח פלישה.
- מוגבל בשל לוחות הזמנים הממושכים להבשלת המטריקס, דבר המשפיע על התפוקה.
