הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן
March 18th, 2014
מטריצה מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.
המטרה הכוללת של ההליך הבא היא ליצור מטריצה מקורית מפיברובלסטים להערכת פלישת תאי הגידול. זה מושג תחילה על ידי גידול פיברובלסטים על פלסטיק במדיה מועשרת בחומצה סורבית כדי ליצור את המטריצה המקורית. בשלב השני, המטריצה המקורית מנותקת ומשתחררת ממשטח הגידול הפלסטי, ואז מטריצה זו נזרעת בתאי גידול ומורמת לממשק נוזל האוויר לאחר תקופה קבועה.
תרביות תלת מימד אלה נקצרות לניתוח היסטולוגי של פלישת תאי הגידול. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההשפעות של מטריצת הפיברובלסטים המקורית על פלישת תאי הגידול על ידי ניתוח היסטולוגי חיסוני. אז היתרון של טכניקה זו ליצירת תרביות טיפוסיות תלת מימדיות הוא שאנו יכולים להעריך מטריצה מקומית המיוצרת על ידי פיברובלסטים עצמם בהיעדר מצעים סינתטיים או זרים, כגון קולגן מסוג אחד התחל בזריעת 200,000 פיברובלסטים לבאר בשש צלחות באר במדיה של פיברבלסטים, בתוספת חומצת IC שהוכנה טרייה.
שני פוספטים מחדשים את התאים כל יומיים-שלושה עם שניים עד חמישה מיליליטר של מדיה טרייה. שכבה עבה של תאים המוטמעת במטריצה חוץ-תאית הנראית לעין בלתי תיווצר בתום שישה שבועות. בהתאם לתאים המשמשים, המטריצה הנראית לעין עשויה להיווצר במוקדם או במאוחר ועשויה להתחיל להתנתק מהצלחת כפי שניתן לראות כאן.
כדי לשחרר שכבה זו מצלחת תרבית הרקמות, יש לגרד בעדינות את היקף המטריצה בעזרת קצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד, ואז לדחוף את שולי המטריצה לכיוון מרכז הבאר. התאים והמטריצה המקורית אמורים להתנתק בקלות משטח הצלחת וכעת לצוף במדיה. פזרו את המטריצה המקורית בתוך המדיה כדי למנוע ממנה להתקפל לתוך עצמה.
תן למטריצה המקורית לצוף ולעצב מחדש במשך חמישה ימים, והמשיך להחליף את המדיה כל יומיים-שלושה עקב חוזק מתיחה ושיפוץ מהותי. המטריצה תתכווץ באופן דרסטי ותצטמצם למטריצה מקורית קטנה יותר אך עבה יותר, ואז היא תהיה מוכנה לשימוש. לבדיקת הפלישה.
לבדיקת הפלישה. ראשית השתמש במלקחיים קהים כדי להעביר את המטריצה המקורית בעדינות לרשת ניילון. לאחר הרשת, השתמש בקצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד ומלקחיים קהים כדי לפזר בעדינות את המטריצה כך שתשכב שטוחה ככל האפשר.
לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של וזלין על קצה אחד של גליל משובט סטרילי אחד לכל מטריצה. לאחר מכן הנח את הצילינדרים על המטריצות המקוריות וזלין כלפי מטה כדי להבטיח אטימה הדוקה בין המטריצה המקורית לטבעות המשובטים. כעת הוסף לגלילים 250,000 קרצינומה של תאי קשקש עוריים או תאי SCC במצע גידול באתר קראט.
לאחר שתאי ה-SCC העוריים התיישבו על המטריצה המקורית, הסר את הצילינדרים, ואז הרם את מטריצת רשת הניילון המקורית ותאי ה-SEC העוריים לממשק נוזל האוויר, ועל תמיכת רשת תיל נירוסטה כפופה. לבסוף, הוסף את מצע הגידול של קרטינוציטים, בתוספת חומצה סורבית עד שרמת המדיה נוגעת בתחתית המטריצה המקורית, החלפת המדיה כל יומיים-שלושה וקטיף בשבעה ו-14 ימים לאחר הזריעה של תאי ה-SCC העוריים. טכניקה זו פותחת את האפשרות לבחון ולהשוות את ההתנהגות הפולשנית של תאי גידול בסביבות סטרומליות תלת-ממדיות שונות.
כפי שניתן לראות בתמונות אלה, הפלישה של קרטינוציטים SCC עוריים RDEB התעכבה משמעותית ב-C 7 על פני ביטוי מטריצות מקוריות בפאנלים הימניים בהשוואה ל-C שבע בקרות RDEB חסרות בפאנלים השמאליים. פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים להעריך ישירות את ההשפעה של מטריצה מקורית המיוצרת על ידי פיברובלסטים על תהליכי תאי גידול כגון פלישה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור מטריצה טבעית מפיברובלסטים לחקר חדירת תאי הגידול. המתודולוגיה מאפשרת הערכת ההשפעה של סוגים שונים של תאי סטרומה על ביולוגיה של תאי הגידול.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- ביולוגיה של תאים
- אונקולוגיה
רקע
- מטריצות שמקורן בפיברובלסטים מספקות סביבה טבעית לצמיחת תאים.
- הבנת חדירת תאי הגידול חיונית למחקר סרטן.
- תרבויות תלת-ממדיות יכולות לחקות תנאים in vivo בצורה מדויקת יותר מאשר תרבויות דו-ממדיות.
- מטריצות טבעיות נמנעות מהסיבוכים של מצעים סינתטיים.
מטרת המחקר
- ליצור מטריצה טבעית שמקורה בפיברובלסטים.
- להעריך את ההשפעות של מטריצה זו על התנהגות תאי הגידול.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות גידול-סטרומה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיברובלסטים מתורבתים במדיום מועשר בחומצה סורבית.
- המטריצה הטבעית מנותקת ממשטח הפלסטיק.
- תאי גידול נזרעים על המטריצה.
- תרבויות תלת-ממדיות מנותחות היסטולוגית לחדירת גידול.
תוצאות עיקריות
- המטריצה הטבעית תומכת בהתרבות תאי הגידול.
- ניתוח היסטולוגי חושף תובנות לגבי דפוסי חדירת הגידול.
- סוגי תאי סטרומה שונים משפיעים על התנהגות תאי הגידול.
- שיטה זו מספקת מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית למחקר.
מסקנות
- המטריצה שמקורה בפיברובלסטים היא כלי חשוב למחקר סרטן.
- היא משפרת את ההבנה של מיקרו-סביבות הגידול.
- גישה זו יכולה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This technique enables direct assessment of fibroblast-derived extracellular matrix on tumor cell invasion, providing a physiologically relevant model for stromal-tumor interactions. By eliminating synthetic substrates, it improves predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking of stroma-modulating therapies. The approach supports early discovery workflows focused on stromal contribution to cancer progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stromal-derived matrix components in tumor invasion assays.
- Operational Value: Provides a human-relevant 3D culture system to de-risk stromal targets.
- Scientific Value: Supports functional validation of stromal molecules like type VII collagen in modulating tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized native matrices for reproducible tumor cell invasion readouts.
- Operational Value: Enables quantitative histological assessment of invasion depth and pattern over time.
- Scientific Value: Facilitates comparison of invasion across genetically defined stromal conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human tumor-stroma continuity using patient-derived fibroblasts.
- Operational Value: Supports longitudinal invasion analysis at 7 and 14 days post-seeding.
- Scientific Value: Links stromal matrix composition to invasive phenotype in squamous cell carcinoma.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from stromal target identification to functional validation in 3D invasion assays, informing lead selection for stroma-modulating agents.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about stromal matrix influence on epithelial invasion pathways.
- Screening: Delivers invasion assays with standardized, fibroblast-generated matrices for compound or genetic screening.
- Analytics: Provides histological endpoints for quantifying invasion under defined stromal conditions.
- Translational Research: Uses patient-derived fibroblasts to model disease-relevant stromal contributions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for stromal biology across tumor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating stromal matrix effects from exogenous substrates.
- Operational Value: Enables standardized matrix production and assay setup across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal dependencies in tumor invasion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stroma-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture and 3D tissue engineering.
- Depends on long-term culture (up to six weeks) for native matrix deposition.
- Necessitates sterile handling for matrix detachment, tumor cell seeding, and air-liquid interface culture.
- Involves histological processing and imaging for invasion analysis.
- Limited by the extended timeline for matrix maturation, affecting throughput.
