Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע רמות אסקורבט תוך-תאיות או חוץ-תאיות בתאים מתורבתים או מבודדים. זה מושג על ידי דגירה של תמציות תאים או תאים שלמים עם ציון אוקסידאז כדי לרוקן באופן סלקטיבי ציון BA בשלבים הבאים. בשיטה הראשונה, תמציות תאים מודגרות בציאניד כדי לייצר פרו ציאניד באופן תלוי אסקורבט, מה שנותן ייצוג ישיר של כמות האסקורבט בתמציות.

לאחר מכן, כמות הברזל ציאניד הנוצרת בתמציות התאים נקבעת על ידי חמצון כמותי של הברזל ציאניד בתוספת ברזל ברזל ליצירת ברזל ענק על מנת ליצור קומפלקס ברזל כרומוגני שני שרכים S שניתן לכמת ספקטרו באופן פוטומטרי. בשיטה השנייה, כל התאים מודגרים ישירות עם הברזל שני כלאטור פרן S וברזל ציטראט. התוצאות מראות הבדלים ברמות אסקורבט תוך-תאיות או חוץ-תאיות בהתבסס על הפחתה כמותית וספציפית של קומפלקסי ברזל חוץ-תאיים שניתן לזהות.

ספקטרו מטרי. היתרון העיקרי של הטכניקה הנוכחית על פני שיטות שכבר קיימות כמו זיהוי מבוסס HBLC הוא שניתן לבצע בדיקת מיקרו-פלטות ספציפית מאוד זו במהירות רבה וניתן לעבד את כל הדגימות והתקנים במקביל ולא באופן סדרתי לפני תחילת הליך זה. תרבית K 5 62 תאי תרחיף וליצור בציון BA המכיל תמצית תאים.

לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי של חומצה אסקורבית של 10 מילי-מולרית ב-PBS קר כקרח. לאחר מכן הכינו בזהירות סדרה של תקני אסקורבט בין אפס ל -20 מיקרומולר. הסר בזהירות ארבעה אליקוטים של 100 מיקרוליטר מכל תקן והוסף אותם לרצף אופקי של בארות.

בצלחת תחתונה שטוחה של 96 באר המכילה 25 מיקרוליטר לבאר PBS או 45.5 יחידות למיליליטר. תמיסת מלאי של L אסקורבט אוקסידאז או AO ב-PBS מכסים את צלחת 96 הבאר בנייר כסף ואורביטל. מערבבים אותו בחום של 550 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בסיום, הוסף 50 מיקרוליטר של 3.5 מילי-מולרי אשלגן פריס ציאניד ב-PBS לכל הבארות כדי לתת ריכוז סופי של פריס ציאניד של מילי-מולר אחד לאחר ערבוב מסלולי של צלחת 96 הבארות, תוך שימוש באותם תנאים כמו קודם. הוסף מיד 25 מיקרוליטר של תמיסה טרייה המכילה 50% חומצה אצטית ו -30% חומצה טריכלורואצטית. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קביעת פרעה ציאניד טרייה שהוכנה לכל מסלול באר.

מערבבים את הצלחת בחושך בחום של 550 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן קרא את ערכי הספיגה של הבארות ב-593 ננומטר. כדי להתחיל את הבדיקה.

ראשית יש לחמצן אסקורבט חוץ-תאי בבארות נבחרות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של 120 יחידות למיליליטר AO או HBSD לבארות מזווגות במשולש כדי לתת ריכוז AO סופי של 10 יחידות למיליליטר. בעקבות תווית זו, הבארות הזוגיות הן מינוס AO ופלוס AO. לאחר ערבוב הצלחות בערבוב אורביטלי עדין במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 2.4 מילי-מולרי Ferne S לכל הבארות כדי לתת ריכוז שרך סופי של 200 מיקרומולר, ערבבו את הלוחות כאמור במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של 120 ציטראט ברזל מיקרו-מולרי טרי לכל הבארות כדי לתת ריכוזי ברזל וציטראט סופיים של 10 ברזל מיקרו-מולרי ו-50 מיקרו-ציטראט בהתאמה. מערבבים היטב בסוף בדיקת האסקורבט FLX. שאפו במהירות את המדיום שמעל מכל באר והוסיפו לבארות המסומנות כראוי בצלחת 24 בארות.

לאחר מכן, הוסף שלוש אליקוטות מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת באר 96 כדי לקבוע אסקורבט חוץ-תאי. קרא את ערכי הספיגה של הבארות ב-593 ננומטר בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה. לבסוף, חשב את כמות האסקורבט החוץ-תאי כ-m ascorbate לכל מיליגרם חלבון המוצג.

להלן עקומה סטנדרטית טיפוסית לקבוצה של תקני אסקורבט, אפס עד 20 מיקרומולר או אפס עד שניים אסקורבט NMO לבאר. מתוך לוח 96 הבארות, למרות שאינו מוצג כאן, הליניאריות נשמרת עד שמונה אסקורבט NMO לבאר, המקביל לריכוז אסקורבט דגימה של כ-80 מיקרומולר. ניתן להשתמש בבדיקה כדי לזהות בהצלחה רמות אסקורבט מתחת ל-0.25 אול אסקורבט לבאר.

תאי K 5 62 צוברים במהירות אסקורבט תוך-תאי מחומצה אסקורבית חוץ-תאית דהידרו L, אך לא אסקורבט. בניסוי מייצג זה, PBS שטוף K 5 62 תאים הודגרו ב-PBS עם 500 מיקרומולרית של אסקורבט דהידרו L חומצה אסקורבית דהידרו L חומצה אסקורבית בתוספת 50 מיקרומולרית ציטו B אסקורבט בתוספת חמישה מילי-מולרי ציאניד או אסקורבט בתוספת 50 יחידות למיליליטר AO למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. אסקורבט תוך-תאי נקבע כמתואר קודם לכן.

ספיגת חומצה אסקורבית של דהידרו L על ידי תאי K 5 62 מתרחשת על ידי הובלה מתווכת גלוקוז מקלה כדי להעריך את המעורבות של גלוטס בספיגת חומצה אסקורבית דהידרו L. בניסוי מייצג זה, תאי K 5 62 הודגרו עם ריכוזים הולכים וגדלים של ציטו B או דיהידרו ציטו B לפני הדגירה עם חומצה אסקורבית דהידרו L. חשוב לציין, בעוד שגם cyto callin B וגם dihydro cyto B מעכבים תהליכים תנועתיים בריכוזים מיקרומולריים, רק cyto callin B, השונה מדיהידרו ציטו B על ידי נוכחות של קשר כפול יחיד מעכב הובלה תלויה בגלוטה בריכוזים מיקרומולריים נמוכים.

לכן, מכיוון שספיגת חומצה אסקורבית דהידרו L עוכבה על ידי ציטו B עם IC 50 של פחות מ-2.5 מיקרומולר, אך לא עוכבה על ידי דיהידרו ציטו. ב דהידרו. ספיגת חומצה אסקורבית L מתרחשת ככל הנראה על ידי הובלה בתיווך גלוטה.

לחלופין, תאים שטופים נחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של גלוקוז הגלוקוז הניתן להעברה אך לא מטבולית שלוש גלוקוז O מתיל D או איזומר סטריאו גלוקוז L גלוקוז שאינו ניתן להעברה במהלך הדגירה עם חומצה אסקורבית דהידרו L. שוב, התוצאות מצביעות על מעורבות גלו בייבוא חומצה אסקורבית דהידרו L שכן עיכוב הצטברות אסקורבט תוך תאי מתרחש רק בנוכחות אנלוגי הגלוקוז הניתן להעברה של העכוז. בבדיקה השנייה.

ניתן לקבוע את קצב פליטת האסקורבט מתאים מתורבתים. בדיקה ספציפית זו חשובה מכיוון שנראה כי שחרור אסקורבט מהתאים חיוני לספיגה התאית המווסתת של אסקורבט של ברזל שאינו קשור לטרנספרין על ידי התאים. ספיגת ברזל שאינו קשור לטרנספרין נחשבת רלוונטית לפתופיזיולוגיה של הפרעות עומס יתר של ברזל, כגון המוכרומטוזיס, כמו גם לחילופי ברזל של נוירונים אסטרוציטים והומאוסטזיס במוח היונקים.

ואכן, המוליך העצבי המעורר העיקרי L גלוטמט מעורר שחרור של אסקורבט לאסטרוציטים באופן שתלוי ב-L גלוטמט, ספיגה על ידי זכוכית, וכנראה GLT אחד ונפיחות תאית שלאחר מכן המעוררת שחרור של אסקורבט על ידי VSOs משוערים. באנלוגיה, שחרור באט בציון A מאסטרוציטים טעונים בציון A B יכול להיות מגורה על ידי חומצת האמינו המעוררת L אספרטט, אך לא חומצת האמינו הלא מעוררת L גלוטמין. אפקט זה מתואר כאן, המציג עקומות תגובת מינון לגירוי שחרור אסקורבט על ידי אספרטט וגלוטמין מתרביות ראשוניות של אסטרוציטים עכברים טעוני אסקורבט לאחר ששולטים בהם.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים בלבד אם היא מבוצעת כהלכה.