Name: Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למדו לקבוע רמות אסקורבט תוך-תאיות וחוץ-תאיות בתרביות תאים באמצעות שיטת מיקרופלייט ספציפית ומהירה. השיטה מספקת כלי יעיל לחקר מטבוליזם תאי ותפקידי האסקורבט בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד&quot;ר סטיבן רובינסון והגב &#39;הניה צ&#39;רבינסקה (אוניברסיטת מונאש) לאספקה ​​הנדיבה של תרבויות astrocyte.

1. קבע Ascorbate תאיים בתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים וקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול השעיה (למשל erythroleukemia האנושי, K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים ראשוניים) באמצעות נהלי תרבות סטנדרטיים 19-21,32,38. הערה: כדי להבטיח תאים מכילים ascorbate, טענו תאים בתרבית עם ascorbate או כascorbate או DHA 33,39. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמצית סלולרית המכיל ascorbate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מספר מתאים של פוספט שנאגרו מלוח השעיה (PBS) דהוי או תאים חסיד עם 450 μl של תא קר כקרח permeabilization הצפת [CPB; 0.1% saponin (w / v) ב-PBS; 4 ° C]. הערה: קבע את מספרם של התאים הנדרשים להשגת ערך הספיגה בטווח ליניארי של assay (ראה להלן) באופן אמפירי על ידי משתמש הקצה. הערה: ניתן להשתמש גם בתמציות רקמה (ראה דיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agitaתאי te על קרח דק 10 כדי להבטיח תמוגה הסלולרית יסודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמצית תאית המכיל ascorbate הובהרה על ידי הסרת פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של lysate הגולמי בגרם × 16,000 במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בקירור (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות 4 x 100 aliquots μl מכל מדגם ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה גם 25 μl / טוב של PBS (&quot;-AO&quot;) בלבד או 25 μl / טוב של 45.5 U / מיליליטר פתרון מניות של L-ascorbate-מונואמין (AO) ב-PBS (&quot;+ AO&quot;). הערה: זה צריך להיעשות במקביל להכנת התקנים (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבנייה סטנדרטית עקומת ascorbate (חייבת להיות בנויה מחדש לכל assay) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של חומצה אסקורבית 10 מ&quot;מ קר כקרח PBS. הערה: בדוק את הריכוז של ascorbate spectrophotometrically באמצעות קובט קוורץ עם 1סנטימטר נתיב באורך ב265 ננומטר (מקדם הכחדה = 14.5 מ&quot;מ -1 סנטימטר -1) 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין בקפידה סדרה של סטנדרטים ascorbate בין 0 ל 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לצעד 1.2.4, להסיר בזהירות 4 × aliquots 100 μl מכל תקן ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה 25 μl / טוב של PBS (&quot;-AO&quot;) או 45.5 פתרון מניות U / מיליליטר של AO ב PBS (&quot;+ AO&quot;). הערה: בסטנדרטים ascorbate מעל 100 μl יכיל 0-2 nmole של ascorbate. שים לב, המטרה של AO היא לשלוט על התרומה של reductants הלא ascorbate לferricyanide הפחתה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ascorbate תאיים - שלב 1: להסיר באופן סלקטיבי ascorbate וכמותית לחמצן ascorbate עם ferricyanide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את צלחת 96 היטב ב550 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך על ידי כיסוי את הצלחת בנייר כסף. הערה: Tהצעד שלו צריך לחמצן כל ascorbate בבארות &quot;+ AO&quot; לDHA. בארות &quot;-AO&quot; אינן צריכות להיות מושפעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 3.5 ferricyanide אשלגן מ&quot;מ (המכונה במסמך בשם &quot;ferricyanide&quot;) ב-PBS לכל הבארות. מ&quot;מ הסופי [ferricyanide] = 1. שים לב: השתמש multipipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את הצלחת ב550 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות נוספות בחושך. הערה: צעד זה אמור לגרום להפחתת ferricyanide לשל ברזל על ידי ascorbate ביחס stoichiometric של 2 מולקולות של ferricyanide מופחתות לכל מולקולה 1 של ascorbate חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף 25 μl של פתרון זה עתה נבנה מכיל 50% (v / v) חומצה אצטית ו30% (w / v) חומצת Trichloroacetic (TCA). שים לב: השתמש multipipettor. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ascorbate תאיים - שלב 2: לכמת את כמות של הברזל נוצרה 37 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון נחישות של ברזל 37 100 μl לדוארACH כן. הערה: פתרון עבודה צריך להיעשות מייד לפני שימוש: 2 מיליליטר של 3 M Na-אצטט (pH 6.0); 0.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית (~ 17.4 M חומצה אצטית); 2 מיליליטר של 0.2 M חומצת לימון; 2 מיליליטר של 3.3 מ&quot;מ FeCl 3 ב0.1 חומצה אצטית M; 1 מיליליטר של 30 מ&quot;מ ferene-S. הנפח הסופי של פתרון עובד זה צריך להיות 7.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את הצלחת בחושך ב550 סל&quot;ד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר (כלומר המקסימום ספיגת של Fe (II) (ferene-S) 3 המורכבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ascorbate תאית כascorbate nmoles למיליון תאים בתחילה על ידי הפחתת 593 ערכי ננומטר לבארות &#39;+ AO&#39; ממקבילים - הבארות &quot;AO&quot; עבור כל דגימה ולאחר מכן ביון מעקומת סטנדרט ascorbate (ראה שלב 1.3 ). בעת בניית עקומת הסטנדרט, עלילה &quot;ערך הבדל&quot; זה עבור כל תקן כנגד הסכום של ascorbאכלתי בכל טוב. </li></ol></li></ol> 2. קביעת Ascorbate-זרימה מתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים וקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול השעיה או תאים חסיד כאמור לעיל (ראה שלב 1.1). הערה: לבצע את assay להלן בפורמט פלאט 24 גם עם השעיה ותאים חסיד לתוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי השעיה resuspend, או כיסוי תאים חסיד, עם 400 μl של מראש חיממתי פתרון שנאגר מלוח HEPES, עם או בלי סידן ומגנזיום, ומכילים 5 מ&quot;מ D-גלוקוז (HBS / D; pH 7.3, 37 מעלות צלזיוס) בבארות של 24 גם צלחת. מוסיף את אותו הנפח של HBS / D לבארות ללא תא שצוינו על כל צלחת 24 גם להיבדק. הערה: יהיה זה האחרון משמש כשולט ללא תא לתגובה הבסיסית (ראה להלן). </li></ol></li></ol> 3. לקבוע את סכום Ascorbate פורסם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צריכים להיות מוכנים פתרונות המניות הבאים מראש: 120U / AO מיליליטר בHBS / D (להכין טרי); 2.4 מ&quot;מ Ferene-S בHBS / D; 120 מיקרומטר FeCl 3 ו600 מיקרומטר Na-ציטראט בHBS / D (להכין באופן מיידי מפתרונות מניות מרוכזים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את תגובת ferrireduction (נפח סופי לכל גם צריך להיות 600 μl), להוסיף הכמויות של חומרים כימיים לבארות בודדות כבר מכילות 400 μl של HBS / D הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של AO (120 U / ml) או HBS / D כדי לזווג בארות בשלושה עותקים. ריכוז AO הסופי צריך להיות 10 U / ml. הערה: לייבל לזווג בארות כ&quot; - AO &quot;ו&quot; + AO &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצלחות עם ערבוב מסלולית עדין במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 2.4 מ&quot;מ ferene-S לכל הבארות. ריכוז ferene-S הסופי צריך להיות 200 מיקרומטר. מערבבים את הצלחות כאמור במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של ציטרט וברזל 120 מיקרומטר מוכן טרי. הברזל הסופי וריכוזי ציטראט צריך להיות 10 ברזל מיקרומטר ו50 ציטראט מיקרומטר. מערבבים היטב. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלוש בארות שליטה בשלושה עותקים, לשאוב את המדיום שמעליה ולהוסיף 600 HBS / D μl מכיל saponin .0.1%. הערה: אלה ישמשו פקדי &quot;100% תא תמוגה&quot; לקטט דהידרוגנז LDH () assay שחרור שנערך במקביל (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 60 דקות בחושך על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של assay ascorbate-בזרימת, במהירות לשאוב 500 μl מכל טוב ולהוסיף לכותרתו כראוי בארות בצלחת 24 גם. הערה: לתאי השעיה, בתחילה להסיר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 aliquots μl של supernatant לצלחת 96 היטב ולאחר מכן קרא ב593 ננומטר. </li></ol> 4. קביעת Ascorbate התאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ascorbate תאי כascorbate nmoles לחלבון מ&quot;ג (או למיליון תאים) כפי שתואר לקביעת ascorbate תאיתבשלב 1.5.4. הערה: למשתמש הקצה צריך לייעל את תנאים, כך ששחרור ascorbate אינו מוגבל על ידי ascorbate תאיים. </li></ol> 5. קביעת שחרור LDH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם 200 μl הנותר של פתרון תאי מכל מדגם לנהל assay שחרור LDH 32,41 כדי לקבוע את מידת תמוגה הסלולרית. הערה: לחשב כ% מLDH releasable המוחלט. לקבוע LDH releasable מהדגימות שטופלו בsaponin .0.1%. </li></ol>

<ol><li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albert+Szent-Gy%C3%B6rgyi%3A+vitamin+C+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li>
<li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li>
<li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+%28factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2%29+on+ascorbate+and+other+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li>
<li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li>
<li>Asard, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsard%2C+H+%22Redox+Biochemistry%22">Redox Biochemistry</a>. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).</li>
<li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+vascular+bed%3A+Importance+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li>
<li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li>
<li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase%2C+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li>
<li>Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChallem%2C+JJ+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22">Free Radic. Biol. Med</a>. 25, 130-132 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase%2C+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li>
<li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((recycling+and+degradation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vitamin+C+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li>
<li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants%3A+lipid+peroxidation%2C+a-tocopherol%2C+and+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li>
<li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li>
<li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Med.+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes%3A+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+%28DMT1%29+plus+an+independent+route+for+ferric+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li>
<li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li>
<li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease%3A+uptake%2C+storage%2C+transport%2C+and+molecular+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li>
<li>Grünewald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li>
<li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+function+in+the+brain%3A+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li>
<li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vitamin+as+neuromodulator%3A+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li>
<li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+view+at+C%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li>
<li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid%3A+Chemistry%2C+biology+and+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li>
<li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%3A+response+to+glutamate+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutamate+aspartate+transporter+%28GLAST%29+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li>
<li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-sensitive+organic+osmolyte%2Fanion+channels+in+cancer%3A+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li>
<li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li>
<li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Na%2B%2FH%2B+exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li>
<li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li>
<li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li>
<li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li>
<li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li>
<li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במאמר זה אנו מציגים שני מבחני microplate colorimetric מהירים, ספציפיים ורגישים יחסית לקביעת ascorbate נגזר מתאי התוך וחוץ תאיים בתאים בתרבית. ניתן להשלים מבחני עם גישה לציוד מעבדה סטנדרטית וחומרים כימיים. מגיב רק יקר באופן מתון הנדרש לassay הוא AO, שהוא חיוני כפי שהוא מקנה גבוהה מידת הספציפיות אנליטי כלפי L-ascorbate. מבחני הם גם מתאימים לשני תאי השעיה (למשל K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים מכרסמים עיקריים HepG2 או), וכבר מועסקי...

גילוי האופי הכימי של חומצה אסקורבית (ויטמין C), וזיהוי שלה בתור &quot;הגורם אנטי scorbutic&quot; המיוחל, על ידי אלברט Szent-ג&#39;ורג&#39;י ואחרים במאמרים שפורסמו 1928-1934 1 היה אירועי ציון דרך בהיסטוריה לביוכימיה. ואכן, תגליות אלה תרמו לSzent-ג&#39;ורג&#39;י שזכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1937. החבילה המתרחבת של תפקידים לascorbate בפיזיולוגיה של בעלי חיים וצמחים, כמו גם על בריאות אדם, תמשיך להיות הנושאים מדעיים פעילים חקירה ומחלוקת. L-Ascorbate הוא reductant פיסיולוגי בשפע ואנזים cofactor במערכות יונקים, ותורם לתגובות אנזימטיות מוגדרות היטב רבות מעורבים הידרוקסילציה קולגן, קרניטין וביוסינתזה נוראפינפרין, חילוף חומרים טירוזין והורמון פפטיד amidation 2. מסקרן, evide הרכבהNCE עולה כי ascorbate משחק תפקיד בגירוי dioxygenases ברזל תלוי אחר, כגון hydroxylases prolyl וasparaginyl המעורב בהידרוקסילציה ומיקוד של גורמי היפוקסיה מושרה 1α (HIFs) ו2α 3. דו&quot;ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שascorbate משחק תפקיד בהבשלת תאי T המשפיע על דרך demethylation הכרומטין באמצעות פעילותו במגרת hydroxylases הגרעיני, Jumonji C חלבוני תחום (JmjC); האחרון שבם מופיעים לדרוש ascorbate לפעילות מלאה 4. ואכן, הגירוי של אנזימים כגון על ידי ascorbate נראה להתרחש על ידי מנגנון דומה לגירוי על ידי ascorbate של hydroxylases HIF וקולגן. בין השפעות קלאסיות אחרות, ascorbate תורם באופן משמעותי לantioxidation הסלולרי כמחסל 5 רדיקלי מסיסים במים שבירת שרשרת ולמחזור של קרום הפלזמה α-טוקופרול (ויטמין E) באמצעות ההפחתה של α-tocopheroxyl 6 רדיקלי, Which חשוב בהגנה מפני חמצון של שומנים בממברנה 7. חשוב מכך, למרות שרוב היונקים מסוגלים סינתזה כבדית דה נובו של ascorbate מD-גלוקוז, פרימטים גבוהים יותר, שרקנים ועוד כמה עטלפים תלויים במקורות תזונתיים של הוויטמין 8. זאת בשל איון של גן GULO, orthologues אשר ביונקים מושפעים לקודד האנזים, γ-gulono-lactone מונואמין 9-13. אנזים זה נדרש לתגובה האחרונה בביוסינתזה ascorbate מ13 גלוקוז. בעקבות קליטה בתיווך טרנספורטר מלומן מעיים בבני אדם, ascorbate מופץ בכל הגוף על ידי מערכת הדם. הוויטמין נמצא בדרך כלל בצורה המצומצמת שלה בmillimolar ריכוזים intracellularly (עם החריג הבולט של אריתרוציטים שבריכוזים הם בדרך כלל דומים לריכוז הפלזמה הרווח), ובקונצרט כלשהו מייקרוentrations (למשל 50-200 מיקרומטר) ברוב הנוזלים תאיים 14,15. בתנאים פיסיולוגיים, ascorbate בדרך כלל עובר חמצון אחד אלקטרונים הפיכים לרדיקלי ascorbyl בחינם (AFR; הידוע גם בmonodehydroascorbate או semidehydroascorbate). בעוד AFR הוא 16 רדיקליים יציבים יחסית, בהיעדר הירידה המהירה שלה מאלקטרון אחד האנזימטית חזרה לascorbate, שתי AFRs יכול לקדם dismutate לascorbate אחד וdehydroascorbate אחד (DHA) 9,13,17. בתוך הפנים של התא, מוצר חמצון שני אלקטרונים של ascorbate, DHA, ניתן להפחית במהירות בחזרה לascorbate ידי גלוטתיון וNAD (P) H האנזימטית תלויות ותגובות אינן אנזימטית 13. בזמן שהוא קיבל באופן קלאסי שהתפקיד המשמעותי היחיד של ascorbate במטבוליזם של ברזל הוא כדי לעורר ספיגה תזונתית של ברזל מהמקור צמחי 18, אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות שלtrongly מצביע ascorbate שמשחק תפקיד התרחב מאוד בחילוף החומרים של מתכת זו. ראשית, ascorbate כי הוא שוחרר על ידי תאי ascorbate-גדוש מופיע לשחק תפקיד חשוב בויסות הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאים 19,20, וראיות מאוד לאחרונה עולה כי ascorbate גם מודולציה את הספיגה של ברזל בכריכת transferrin על ידי תאים 21, האחרון שבם מתאים למסלול פיסיולוגי עיקרי ברזל ספיגת 22. Ascorbate הוא חיוני לתפקוד תקין של מערכת עצבים מרכזי ביונקי 23,24. יחד עם luteum קליפת המוח, בלוטת יותרת המוח, בלוטת התימוס, הרשתית וקורפוס יותרת הכליה, המוח מכיל ריכוזים גבוהים של ascorbate יחסית לרקמות אחרות בגוף 23,25-27. בנוסף, החשיפה של שני האסטרוציטים 28,29 ותאים כמו נוירון 30 לגלוטמט ידוע כדי לעורר את שחרורו של ascorbate לתוך חלל החוץ תאי, שם ascorbatהוא חשב דואר כדי לעזור להגן על נוירונים נגד תפקוד עצבי הנגרם גלוטמט ביום 31. בעוד המנגנון של שחרור ascorbate-Induced גלוטמט מהאסטרוציטים המדויק אינו ידוע, יש לנו לאחרונה סיפקנו ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי נפיחות נגרמת על ידי ספיגת גלוטמט על ידי גלוטמט astrocyte וטרנספורטר aspartate (GLAST; איזופורם הידוע גם חומצת אמינו מעוררת טרנספורטר 1 [EAAT1 ] בבני אדם) והפעלה הסוגר של osmolyte ואניון ערוצי נפח רגיש (VSOACs) שהם חדירים לאניונים אורגניים קטנים כגון ascorbate 32. הזהויות מולקולריות של תעלות קרום הפלזמה מעורבות בהיווצרות VSOAC להישאר להיות מזוהות 33,34. למרות מבחני רבים פותחו לקביעת ascorbate בדגימות ביולוגיות, הכוללות מבחני spectrophotometric, fluorometric וchromatographic 35,36, יש הרבה גיוון בסגולי, רגישות, interferencדואר על ידי מזהמים כימיים, טווח ליניארי אפקטיבי ויציבות של אנליטי נקודת הקצה. בנוסף, גורמים משמעותיים נוספים המשפיעים על הבחירה של assay הם מהירות, קל שימוש וגישה לציוד יחסית מיוחד כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מנגנון (HPLC). כאן אנו מציגים assay microplate colorimetric פשוט ומאוד ספציפי לקביעת ascorbate תאית בתאים בתרבית, כמו גם assay נפרד לקביעת ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית. Assay האחרון נועד לעקוף את הבעיה של הערכה נמוכה מדי של שחרור ascorbate מהתאים עקב ספיגה מחדש מהירה של ascorbate שפורסם על ידי מובילי נתרן תלוי ascorbate (SVCTs). למרות ששתי השיטות האלה הופיעו בחלק מהפרסומים הקודמים שלנו 19,20,32,37,38, כתב היד הזה מספק סט מפורש של הוראות והנחיות לביצוע היעיל שלהם.

<table><tbody><tr><td>צלחות תחתונות שטוחות Nunc 96 באר</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>ניתן להשתמש בכל צלחת עם תחתית שטוחה של 96 בארות</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה ספסל מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>ניתן להשתמש גם במיקרוצנטריפוגה לא מקוררת שאוזנה לטמפרטורה בחדר קירור</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסל מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>דלי</td></tr> <tr><td>נדנדהBio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות המסוגל לקרוא ב-593 ננומטר ומומלץ. אם נעשה שימוש בקורא לוחות מבוסס מסנן, בחר את אורך הגל הקרוב ביותר האפשרי והשתמש בשיטת העקומה הסטנדרטית.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (מערבל אורביטלי מיקרופלייט)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>זהו מערבל מיקרו-פלטות רב תכליתי ואמין מאוד ועובד טוב מאוד עבור מבחנים אלה</td></tr><tr><td>מאגרים</td><td></td><td></td><td></td>לשימוש כללי</tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), תמיסת מלח חוצצת MOPS pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MBS); 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 15 מ"מ MOPS-Na+, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 מ"מ D-גלוקוז (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת HEPES + 5 מ"מ D-גלוקוז (HBS/D); 137 מ"מ NaCl, 5.2 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl2&bull; 2 H2O, 0.8 mM MgSO4&bull; 7 H2O, 5 מ"מ D-גלוקוז, 20 מ"מ HEPES-Na+, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חוצץ חדירות תאים (CPB; 0.1% ספונין ב-PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים</td><td></td><td></td><td></td>כלליים</tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית או נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td>' <td>יש להשיג דימר</td></tr><tr><td>חומצה דהידרו-L-אסקורבית (DHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>תמיסות מימיות מניבות תיאורטית 2 שומות של מונומר DHA לכל שומה של דימר DHA</td></tr><tr><td>ציטוכלזין B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>תמיסות מלאי שהוכנו ב-DMSO או אתנול</td></tr><tr><td>אסקורבט אוקסידאז (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>ניתן להכין תמיסות מלאי (120 U/ml) ב-PBS או MBS ולאחר מכן להקפיא במכסות</td></tr><tr><td>אשלגן פריציאניד (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>טריהידראט</td></tr><tr><td>פרן-S (3-(2-פירידיל)-5,6-די(2-פוריל)-1,2,4-טריאזין-5&פריים;,5&פריים; &פריים;-חומצה דיסולפונית מלח דיסודיום)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>נתרן L-גלוטמט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47036</td><td>הכן תמיסת מלאי של 0.1%</td></tr><tr><td>פתרונות מלאי לבדיקת</td><td></td><td></td><td></td>קביעת אסקורבט תוך תאית</tr><tr><td>3 M נתרן אצטט (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td><td></td>אצטית קרחונית</tr><tr><td>0.2 M חומצת</td><td></td><td></td><td></td>לימון</tr><tr><td>3.3 מ"מ FeCl<תת>3 ב-0.1 M חומצה</td><td></td><td></td><td></td>אצטית</tr><tr><td>30 מ"מ ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (v/v) חומצה אצטית + 30% (w/v) חומצה טריכלורואצטית (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פתרונות מלאי לבדיקת</td><td></td><td></td><td></td>אסקורבט-פליטה</tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>2.4 מ"מ פרן-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.12 מ"מ FeCl<תת>3 ב-0.6 מ"מ נתרן-ציטראט</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microplate assay מהיר והספציפי לקביעת ascorbate intra-ותאי בתאים בתרבית

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

ויטמין C (ascorbate) ממלאת תפקידים רבים חשובים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם יצאו לאור רק בשנים האחרונות. לדוגמא, בתוך המוח, ascorbate פועל באופן הגנה עצבי וneuromodulatory שכרוך רכיבה על אופניים ascorbate בין הנוירונים והאסטרוציטים vicinal - מערכת יחסים שנראה כחיוני להומאוסטזיס ascorbate המוח. בנוסף, יש ראיות המתעוררות מראות כי יש ascorbate תפקיד התרחב מאוד בויסות חילוף חומרים של ברזל תאי ומערכתיים יותר מוכר בסגנון קלאסי. ההכרה הגוברת בתפקיד נפרד של ascorbate בפיזיולוגיה תאית והאורגניזם נורמלי וחוסר פיקוח ממשלתי דורשת מגוון של טכניקות אנליטיות בינונית תפוקה ורגישות גבוהה שיכולות להתבצע ללא הצורך בציוד מומחה יקר מאוד. כאן אנו מספקים הוראות מפורשות למדיום תפוקה, assay microplate הספציפי וזול יחסית לקביעת בוascorbate התוך תאי וה בתרבית תאים.

קביעת Ascorbate תאית בתאי השעיה מתורבתים ב assay הראשון (איור 1), ascorbate תאיים נקבע, בעקבות ascorbate ספציפי הפחתה (AO רגיש כלומר) של ferricyanide לשל ברזל, תוך שימוש בנחישות רגישה מאוד של של ברזל על ידי הליך שפורסם בעבר 37. זיהוי של ascorbate מבוסס על קלאציה colorimetric של ברזל ברזל שנוצר על ידי הפחתת ascorbate תלוי של ferricyanide לשל ברזל, ואחריו הירידה של ברזל ברזל ברזל ע...

Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את רמות האסקורבט התוך-תאיות או החוץ-תאיות בתאים מתרבטים או מבודדים. דבר זה מושג על ידי דגירה של תמריות תאים או תאים שלמים עם score oxidase כדי לדלל באופן סלקטיבי score BA בשלבים הבאים. בשיטה הראשונה, תמריות תאים מדגגות עם ציאניד כדי להפיק ferro cyanide באופן התלוי באסקורבט, מה שמעניק ייצוג ישיר לכמות האסקורבט בתמריות.בשלב הבא, נקבעת כמות הפרוציאניד (ferro cyanide) שנוצרה בתמריות התאים על ידי חמצון כמותי של הפרוציאניד באמצעות הוספת ברזל פריאי (ferric iron) ליצירת ברזל פריס (ferris iron), וזאת כדי להפיק קומפלקס כרומוגני של ברזל שני ו-ferne S שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי. בשיטה השנייה, כל התאים מדגריים ישירות עם הכלטור של ברזל שני, ferne S, ועם ציטראט ברזל פריאי. התוצאות מראות הבדלים ברמות אסקורבט תוך-תאיות או חוץ-תאיות, בהתבסס על החזרתיות הכמותית והספציפית של קומפלקסים של ברזל חוץ-תאי שניתן לזיהוי.בשיטה ספקטרומטרית. היתרון המרכזי של הטכניקה הנוכחית על פני שיטות קיימות, כגון זיהוי מבוסס HPLC, הוא שניתן לבצע בדיקת מיקרו-פלטה ספציפית זו במהירות רבה, וניתן לעבד את כל הדגימות והתמיסות הסטנדרטיות במקביל ולא באופן סדרתי. לפני תחילת הליך זה, יש לגדל תאי סספנסיות K 5 62 ולהכין תמצית תאית בריכוז ידוע.לאחר מכן, הכין תמיסת סטוק של 10 millimolar חומצה אסקורבית ב-PBS קר בקרח. לאחר מכן, הכין בזהירות סדרה של סטנדרטים של אסקורבט בריכוזים שבין אפס ל-20 micromolar. העבר בזהירות ארבעה אליקוטים של 100 microliter מכל סטנדרט והוסף אותם לרצף אופקי של בארות.בפלטה בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה המכילה 25 µL לבאר של PBS או תמיסת סטוק של L ascorbate oxidase או AO ב-PBS בריכוז 45.5 units per mL, כסו את הפלטה בעלת 96 הבארות בנייר אלומיניום ועזרו בערבוב אורביטלי במהירות של 550 RPM בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.בסיום, הוסף 50 µL של potassium Ferris cyanide בריכוז 3.5 mM ב-PBS לכל הבארות, כדי להגיע לריכוז סופי של Ferris cyanide של 1 mM לאחר ערבוב אורביטלי של פלטת 96 הבארות, באותם תנאים כפי שבוצעו קודם לכן. הוסף מיד 25 µL של תמיסה שהוכנה טרי שמכילה 50% acetic acid ו-30% trichloroacetic acid. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת Pharaoh cyanide determination שהוכנה טרי לכל בארה באורביטאל.ערבבו את הפלטה בחושך במהירות של 550 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, קראו את ערכי הבליעה של הבארים באורך גל של 593 ננומטר. כדי להתחיל את הבדיקה.ראשית, חמצנו אסקורבט חוץ-תאי בבארות נבחרות על ידי הוספה של 50 µL של AO או HBSD בריכוז של 120 units/mL לבארות מזווגות בשלוש חזרות, לקבלת ריכוז סופי של 10 units/mL של AO. לאחר מכן, סמנו את הבארות המזווגות כ-minus AO וכ-plus AO. לאחר ערבוב של הפלטות בערבוב אורביטלי עדין למשך חמש דקות ב-37 °C, הוסיפו 50 µL של Ferne S בריכוז 2.4 mM לכל הבארות לקבלת ריכוז סופי של 200 µM של Ferne S, וערבבו את הפלטות כפי שמתואר לעיל למשך חמש דקות ב-37 °C.בשלב הבא, הוסיפו 50 µL של ferric citrate בריכוז 120 µM שהוכן טרי לכל הבארות, כדי להגיע לריכוזים סופיים של 10 µM ברזל ו-50 µM ציטראט, בהתאמה. ערבבו היטב בסיום בדיגת ה-ascorbate FLX. שאבו במהירות את המצע העליון מכל בארה והעבירו אותו לבארות מסומנות כראוי בפלטה של 24 בארות.לאחר מכן, העבירו מנות של 3 µL מהעל-נוזל (supernatant) לפלטה בעלת 96 בארות כדי לקבוע את רמת האסקורבט החוץ-תאי. מדדו את ערכי הבליעה של הבארות באורך גל של 593 nm באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרו-פלטה. לבסוף, חשבו את כמות האסקורבט החוץ-תאי כ-m ascorbate לכל מיליגרם חלבון המוצג.להלן עקומת סטנדרט טיפית עבור סדרת סטנדרטים של אסקורבט, מ-0 עד 20 מיקרומולארי או מ-0 עד שני nmol אסקורבט לכל באר. בלוחית בעלת 96 בארות, למרות שאינו מוצג כאן, הלינאריות נשמרת עד שמונה nmol אסקורבט לכל באר, מה שמתאים לריכוז אסקורבט של כ-80 מיקרומולארי בדגימה. ניתן להשתמש במבחן כדי לזהות בהצלחה רמות אסקורבט הנמוכות מ-0.25 nmol אסקורבט לכל באר.תאי K 5 62 צוברים במהירות אסקורבט תוך-תאי מדהידרו-L-אסקורבית חוץ-תאית, אך לא מאסקורבט. בניסוי מייצג זה, תאי K 5 62 שנשטפו ב-PBS דגרו ב-PBS עם 500 micromolar של אסקורבט, דהידרו-L-אסקורבית, דהידרו-L-אסקורבית בתוספת 50 micromolar cyto B, אסקורבט בתוספת five millimolar של ציאניד, או אסקורבט בתוספת 50 units per milliliter AO למשך 30 דקות ב-37 degrees Celsius. רמת האסקורבט התוך-תאי נקבעה כפי שתיאר בעבר.ספיגת dehydro L ascorbic acid על ידי תאי K 5 62 מתבצעת באמצעות הובלה המתווכת על ידי נשאי גלוקוז פסיביים (glute); כדי להעריך את מעורבותם של ה-glutes בספיגת dehydro L ascorbic acid, בניסוי מייצג זה, תאי K 5 62 דגרו עם ריכוזים עולים של cyto B או dihydro cyto B לפני הדגירה עם dehydro L ascorbic acid. חשוב לציין כי בעוד שגם cyto callin B וגם dihydro cyto B מעכבים תהליכים ניידיים בריכוזים מיקרומולריים, רק cyto callin B, הנבדל מ-dihydro cyto B בנוכחותו של קשר כפול בודד, מעכב הובלה תלוית-glute בריכוזים מיקרומולריים נמוכים.לפיכך, מכיוון שספיגת dehydro L ascorbic acid נבלמה על ידי cyto B עם IC 50 של פחות מ-2.5 micromolar, אך לא נבלמה על ידי dihydro cyto. B, סביר להניח שספיגת dehydro. L ascorbic acid מתבצעת באמצעות transport מתווך על ידי glute.לחלופין, תאים שטופים נחשפו לריכוזים עולים של אנלוג הגלוקוז 3-O-methyl D-glucose, הניתן להובלה על ידי GLUT אך אינו ניתן למטבוליזם, או לאיזומר הסטריאואיזומר של הגלוקוז L-glucose, שאינו ניתן להובלה על ידי GLUT, במהלך אינקובציה עם dehydro L-ascorbic acid. שוב, התוצאות מעידות על מעורבות של GLUT ביבוא של dehydro L-ascorbic acid, שכן עיכוב של הצטברות אסקורבט תוך-תאית התרחש רק בנוכחות האנלוג של הגלוקוז הניתן להובלה על ידי GLUT. במדידה השנייה.ניתן לקבוע את קצב הדיפוזיה החוצה (efflux) של אסקורבט מתאים בתרבית. בדיקה ספציפית זו חשובה כיוון שנראה כי שחרור אסקורבט מהתאים הוא קריטי לספיגה התאית של ברזל שאינו קשור לטרנספרין (non transferrin bound iron), המהווה תהליך מווסת על ידי אסקורבט. ספיגת ברזל שאינו קשור לטרנספרין נחשבת לרלוונטית לפתופיזיולוגיה של הפרעות עומס יתר של ברזל, כגון המוכרומטוזיס, וכן לחילופי ברזל להומאוסטזיס בין אסטרוציטים לנוירונים במוח של יונקים.ואכן, הנוירוטרנסמיטר המעורר העיקרי L glutamate גורם לשחרור ascorbate מאסטרוציטים באופן התלוי ב-L glutamate, בספיגה על ידי glia, וככל הנראה על ידי GLT one, ובנפיחות תאית עוקבת המפעילה את שחרור ה-ascorbate על ידי VSOs משוערים. באופן אנלוגי, ניתן לעורר שחרור ascorbate מאסטרוציטים הטעונים ב-ascorbate באמצעות החומצה האמינוית המעוררת L aspartate, אך לא באמצעות החומצה האמינוית שאינה מעוררת L glutamine. אפקט זה מוצג כאן, ומראה עקומות תגובה למינון עבור גירוי של שחרור ascorbate על ידי aspartate ו-glutamine מתרביות ראשוניות של אסטרוציטים של עכבר הטעונים ב-ascorbate לאחר שהתהליך נשלט.ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים בלבד אם היא מבוצעת באופן נכון.

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

סרטון זה מדגים טכניקת כימות עבורCO2 המשתחרר במהלך חמצון המצע באמצעות 14מצעים בעלי תווית רדיו C. 14CO2 ששוחרר לכוד בתמיסה בסיסית ומכומת על ידי מונה נצנצים. חמצון של מצעים שונים משתנה בין רקמות ומשקף את המצב הפתופיזיולוגי של הרקמה.

בדיקת חמצון המצע בתאים בתרבית: בדיקת מבחנה לכימות חמצון המצע בתאים על ידי מדידת אותות רדיואקטיביים מ- CO2 לכוד

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה בתאי יונקים. התאים נחשפים לרעלן חיידקי היוצר נקבוביות, היוצר נקבוביות בקרום התא. בנוכחות יוני סידן חוץ-תאיים, הנקבובית גורמת לזרימת סידן, וגורמת לאירועים של איטום מחדש של הממברנה. יעילות האיטום מחדש מוערכת באמצעות צבע פרופידיום יודיד קושר DNA, אשר נכנס רק לתאים ללא קרום אטום מחדש.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות חוץ גופית למדידת יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

גליקוליזה היא סמן מטבולי מגדיר במערכות ביולוגיות מרובות. ניטור גליקוליזה על ידי מדידת השטף החוץ-תאי של H+ הוא נפוץ, אך דורש תיקון כמותי וחד משמעי. כאן, אנו מדגימים כיצד לאסוף ולתקן נתוני שטף חוץ-תאי כדי להבחין בין מקורות נשימתיים וגליקוליטיים של החמצה חוץ-תאית.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

למדו לקבוע רמות אסקורבט תוך-תאיות וחוץ-תאיות בתרביות תאים באמצעות שיטת מיקרופלייט ספציפית ומהירה. השיטה מספקת כלי יעיל לחקר מטבוליזם תאי ותפקידי האסקורבט בביולוגיה.

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים