Name: הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למדו הכנת הידרוג'לים מפוליאקרילמיד מקושרי-DNA לחקר השפעת קשיחות הרקמה על תפקוד תאים. השיטה מאפשרת מודולציה דינמית של תכונות המטריצה החוץ-תאית ללא קרינת UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ל: ד&quot;ר פרנק ג&#39;יאנג, ד&quot;ר דוד לין, ד&quot;ר ברנרד Yurke וד&quot;ר עודאי Chippada על תרומתם בפיתוח טכנולוגית ג&#39;ל DNA; ד&quot;ר Norell Hadzimichalis, סמיט השאה, קימברלי פיטרמן, רוברט Arter להערות והעריכות של כתב היד הזה שלהם; מקורות מימון כולל ועדת ניו ג&#39;רזי על חוט השדרה המחקר (גרנט # 07Â-019-SCR1, מעבדת המאיץ הלאומי) וניו ג&#39;רזי Neuroscience מכון (MLP); ומוציאים לאור של הנדסת רקמות, חלק א &#39;לאישור להדפיס מחדש איורים 2 ו 4 וBiomaterials רשות להדפיס מחדש את איור 3.

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li>
<li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li>
<li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li>
<li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+a+reversible%2C+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
<li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li>
<li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li>
<li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

היכולת של ג&#39;לי DNA כדי לרכך או להקשיח לפני ואחרי הידבקות התא הופכת אותם למודל אידיאלי כדי ללמוד את התפקיד של קשיחות רקמה דינמית על תפקוד תא. כל שלושה העיצובים שנעשו שימוש במחקרים מכאניים וביולוגיים. עם זאת, יש את כל שלושת העיצובים גמישויות דומות בשיעורי crosslink שונים, המצביעים על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג&#39;ל DNA (טבלה 2). בניגוד לכך, ריכוז acrylamide משפיע גמישות. עיצובים אלו עשויים להיות שונים בקינטיקה crosslinking מאז נטיות התפוצצות ג&#39;ל...

מצעים סטטי ודינמיים שתי קטגוריות של חומרים ביולוגיים שפותחו כדי לחקור את ההשפעות של גמישות רקמות או נוקשות בתפקוד תא. מצעי סטטי אינם מסוגלים לשנות את התכונות הפיזיות שלהם אחרי שהם מפוברקים ו / או פעם תאים מצופה. Polyacrylamide ג&#39;לים (הרשות הפלסטינית) היו מצעים הראשונים דו ממדים, סטטי שהיו מסונתזים לחקירות mechanobiology 5,17. ג&#39;לי הרשות הפלסטינית הם קל להכנה, זול, תכליתי, והוא יכול להיות מפוברק עם מגוון רחב של moduli אלסטי. למרות יתרונות הטכניים אלה הופכים את הרשות הפלסטינית ג&#39;לי מצע נפוץ מיושם, מצעי סטטי אינם מעידים על האופי הדינמי של מטריצת חוץ תאית (ECM) וסביבה סלולרית המקיפה in vivo. לדוגמא, ECM עובר שינויי נוקשות כתוצאה מפגיעה, פיתוח, או מחלה. מצעים דינמיים ולכן הם העדיפו כמודלים מצע מחקה רקמות במחקרי mechanobiology <sup&gt; 22,24,25. סינטטי רב, דו ממדי חומרים ביולוגיים טבעיים,, תלת ממדים, סטטי, ודינמיים פותחו כדי לחקות רקמות נוקשות 1,3,6,16,23,26. כמה מצעים דינמיים דורשים חום, UV, זרם חשמלי, יונים, ושינויי pH לשנות התכונות מכאניות שלהם 2,4,7,8,12,15,16, אך גירויים אלה יכולים להגביל ביו היישום של הידרוג&#39;ל. הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide (ג&#39;לים DNA) הם מצעי אלסטי דו ממדים דינמיים. crosslinks DNA מאפשר לאפנון מרחב, בזמן, והפיך של ג&#39;ל DNA נוקשות על ידי תוספת של DNA חד גדילים (ssDNA) לתקשורת או חיץ 9-11,13,14,18,21. שלא כמו ג&#39;לי הדינמי האמור שבו גירויים מוחלים לאפנון של גמישות, ג&#39;לים DNA מסתמך על דיפוזיה של ssDNA שימושי לשינוי של גמישות. לכן, המשטח העליון ג&#39;ל, שבו תאים גדלים, הוא האזור הראשון המווסת בגלל o השיעוראפנון גמישות f תלוי בעובי ג&#39;ל. ג&#39;לי DNA דומה לעמיתיהם ג&#39;ל הרשות שביש להם עמוד שדרה polyacrylamide, לעומת זאת crosslinks bis-acrylamide מוחלף בcrosslinks המורכב מדנ&quot;א (איור 1). שתי ssDNAs (SA1 וSA2) להכליא עם גדיל crosslinker (L2) כדי לפצות crosslinks DNA של ג&#39;ל. SA1 וSA2 יש רצפים שונים ששניהם מכילים שינוי Acrydite בסוף 5&#39;להתאגדות אפקטיבית לרשת של הרשות הפלסטינית. להכנת ג&#39;לי, SA1 וSA2 הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה של הרשות הפלסטינית ו, לאחר מכן, SA1 וSA2 polymerized מעורבבים יחד. L2, crosslinker, מתווסף לSA1 ותערובת SA2. רצף בסיס L2 הוא משלים לשני רצפי SA1 וSA2 וL2 hybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks DNA. גמישות ראשונית, ג&#39;ל DNA נקבעה על ידי שני ריכוזי L2 וcrosslinking (לוחות 1 </strong&gt; ו2). ג&#39;לי DNA המכיל כמויות stoichiometric שווה של L2, SA1, וSA2 הוא ג&#39;לי הנוקש בגלל SA1 וSA2 100% crosslinked ידי L2 (מיועד כג&#39;לי 100%). ריכוזים נמוכים של תוצאת L2 בשיעור נמוך יותר של crosslinking DNA, ולכן, ג&#39;לים DNA רך יותר. ג&#39;לים נמוך כמו 50% crosslinked (מיועד כג&#39;לי 50%) נבנה 9-11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> איור 1 crosslinking ג&#39;ל DNA ו9-11,13,14,18,21 סכמטי uncrosslinking שלב 1:. SA1 (אדום) וSA2 (כחול) הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה polyacrylamide (שחור). לאחר פילמור, פתרונות polymerized SA1 וSA2 מעורבבים יחד. שלב 2: L2 (ירוק) הוא הוסיף וhybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks של ג&#39;ל. שלב 3: R2 hybridizes עם tהוא דריסת הרגל של L2. שלב 4: הכלאת דריסת רגל של R2 מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2. שלא כמו ג&#39;לי הרשות הפלסטינית, ג&#39;לים DNA יכול להקשיח ולרכך לאחר סינתזה. מסיבה זו, תאים שגודל על ג&#39;לי DNA יכולים להיות נתונה לשינויים קשיחות דינמיות. כדי להקשיח ג&#39;לי תא חסיד, ניתן להוסיף L2 לתקשורת והתרבות של ג&#39;לים אחוז הנמוך כדי להגדיל את האחוז של crosslinks. כדי לרכך ג&#39;לי תא חסיד, ניתן להסיר L2 כדי להקטין את אחוז crosslinks 10,13,21. יש L2 רצף דריסת רגל נוסף בסוף 3&#39;לאפשר L2 לuncrosslink מSA1 וSA2 (טבלת 1). הסרת L2 מושגת על ידי הכלאה של גדיל היפוך נקרא R2. R2 הוא משלים לכל אורכו של L2 וhybridizes ראשון עם דריסת רגל L2. הכלאה דריסת רגל מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2, אשר מבטל את crosslink ומפחית את נוקשות ג&#39;ל. בדוח זה ו<html> וידאו, צעד אחר צעד הוראות ניתנות להכנת התקשות וריכוך ג&#39;לי DNA. בעוד הכנות ג&#39;ל 100% ו80% ​​מתוארים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ליצור ג&#39;לים DNA של אחוזי crosslinked הראשוניים וסופיים אחרים. באופן כללי, ג&#39;לי 100% ו80% ​​מוכנים, משותק על תלושי כיסוי זכוכית, פונקציונליות, וזרע עם תאים. L2 מתווסף לתקשורת של 80 ג&#39;לי% וR2 מתווסף לתקשורת של 100 ג&#39;לי%, 48 שעות לאחר ציפוי. התוספת של L2 לתקשורת מקשיחה 80 ג&#39;לי% ל100% crosslinked, ואילו התוספת של R2 לתקשורת מרככת 100 ג&#39;לי% 80% crosslinked. ג&#39;לים התקשח יועדו כ80 → 100 ג&#39;לי% וג&#39;לים התרכך יועדו כ100 → 80 ג&#39;לי% בטקסט. לשליטה או ג&#39;לים סטטי, ssDNA בהיקף של Ts או כפי שנמסר למערכת נוספת של 100% ו80 ג&#39;לי%. לאחר מינימום של שני ימים הבאים אפנון גמישות, יכולים להיות מעובד תאים ונותחו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:k</html style=";text-align:right;direction:rtl">יפ-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> crosslink DNA </td><td rowspan="2"> # של בסיסים </td><td> רצף (דריסת רגל) </td><td rowspan="2"> שינוי </td><td rowspan="2"> (T מ &#39;, ° C) טמפרטורת התכה </td><td rowspan="2"> תגובות </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> עיצוב 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>רצף דריסת רגל 10 נ&quot;ב כלול. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> TAG CAA GTG CGC ACC TTT gcg TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 הוא משלים לL2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> עיצוב 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> דריסת רגל רצף נ&quot;ב 12 כלולה. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 הוא משלים לL2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> TAG GCT CAT GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> דריסת הרגל אינה כלולה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> בקרה </td><td rowspan="2"> בקרה </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (וכו &#39;) או </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (וכו &#39;) </td></tr></tbody></table> .1 רצפי בסיס השולחן לssDNA 9-11,13,14,18,21. נייד ומחקרים מכאניים נצלו כמה דעיצובי crosslink ifferent ליצור ג&#39;לי DNA עם מגוון רחב של תכונות מכאניות סטטי ודינמיות. הפרמטרים מווסת בעיצוב crosslink הם רצף בסיס ואורך רצף או אורך crosslink. גופנים מודגש ונטויים להמחיש זיווג בסיס בין SA1 וL2 ובין SA2 וL2, בהתאמה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> עיצוב </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> ריכוז acrylamide (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 בתוספת SA2 הכלאה לL2 (% crosslinked) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; אלסטיות (kPa, ממוצע ± SEM) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> לוח 2: מודול יאנג (E) של ג&#39;לים DNA 9-11,13,14,18,21. ריכוז Acrylamide, אחוז crosslink, ואורך crosslink יכול להיות מווסת בג&#39;לים DNA. יש עיצובים 1, 2, ו -3 20, 28, ו40 אורכי crosslink נ&quot;ב, בהתאמה. יש לי 100 ג&#39;לי% עבור כל העיצובים moduli דומה המצביע על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג&#39;ל. עם זאת, שינויים בריכוז acrylamide לשנות גמישות ג&#39;ל DNA.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>אין מערבולת ssDNA. הפוך בעדינות את הבקבוקון ו/או תמיסת הפיפטה לערבוב.</td></tr><tr><td>PBS עם סידן ומגנזיום</td><td></td><td></td><td>כל מותג.</td></tr><tr><td>100x Tris-EDTA buffer (מאגר TE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE הוא רעלן רבייה.</td></tr><tr><td>תמיסת 40% אקרילאמיד</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה)BP14021</td><td></td> <td>אקרילאמיד הוא רעלן.</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיוס, מיזורי)</td><td>A3678</td><td>הכן תמיסה של 2% במאגר TE. APS הוא רעלן ומרגיז.</td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>הכן תמיסה של 20% במאגר TE. TEMED הוא דליק, מאכל ורעלן.</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 12 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>דבק אופטי נורלנד</td><td>72 מוצרי נורלנד (קרנברי, ניו ג'רזי) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> תרבית רקמות 24 בארות <td>כל מותג.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>כל מותג.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem או Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com או thermofisher.com</td><td>C111 או 22589</td><td>הכינו תמיסה של 0.315 מ"ג/מ"ל במים מיד לפני השימוש. מתמוסס ב-37 מעלות; C ומסנן לעקר. זה נורמלי לצפות בסולפו-SANPAH לא מומס במסנן. Sulfo-SANPAH רגיש לאור ולכן יש להגן על התמיסה מפני אור עד לחשיפה ל-UV.</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין (PDL)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיוס, מיזורי)</td><td>P6407</td><td>הכינו תמיסה של 0.2 מ"ג/מ"ל במים ומסננים לעקר.</td></tr><tr><td>קולגן סוג I</td><td>אפימטריקס (סנטה קלרה, קליפורניה) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>הכן תמיסה של 0.2 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.2 N. התמיסה צריכה להישאר קרה כל הזמן כדי למנוע פילמור. חומצה אצטית היא חומר דליק, רעיל וקורוזיבי.</td></tr><tr><td>22 x 60 כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה עם תזוזה חיובית</td><td>Gilson, Inc (מידלטאון, ויסקונסין) gilson.com F148504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>מקור</td><td></td><td></td> אור UV <td>מקם ג'לים קרוב ככל האפשר לאור ה-UV. אור UV עלול לגרום לפגיעה בעור או בעיניים.</td></tr><tr><td>מדחום</td><td></td><td></td><td>כל מותג.</td></tr><tr><td>גז חנקן</td><td>GTS-Welco (פלמינגטון, ניו ג'רזי) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת-crosslinked dna polyacrylamide הידרוג

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology הוא תחום מדעי מתפתח העוסק בתפקיד הקריטי של רמזים פיזיים בהכוונת מורפולוגיה תא ותפקוד. לדוגמא, ההשפעה של גמישות רקמות בתפקוד תא הוא אזור מרכזי של מחקר mechanobiology כי רקמות נוקשות מודולציה עם מחלה, פיתוח, ופציעה. חומרי סטטי מחקה רקמות, או חומרים שלא ניתן לשנות את קשיחות פעם תאים מצופה, המשמשים ברובה כדי לחקור את ההשפעות של רקמות נוקשות בפונקציות תא. בעוד שהמידע שנאסף ממחקרי סטטי הוא בעל ערך, מחקרים אלה אינם מעידים על האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי in vivo. כדי לטפל טוב יותר את ההשפעות של קשיחות דינמית על תפקוד תאים, שפיתחנו מערכת crosslinked DNA הידרוג&#39;ל polyacrylamide (ג&#39;לים DNA). שלא כמו מצעים דינמיים אחרים, יש לי ג&#39;לי DNA היכולת להגדיל או להקטין בקשיחות לאחר הייצור ללא גירויים. ג&#39;לים DNA מורכב מcrossl DNAסוגי הדיו שpolymerized לתוך עמוד השדרה polyacrylamide. הוספה והסרה של crosslinks באמצעות משלוח של גדילי דנ&quot;א יחיד מאפשרת מרחב, בזמן, ושליטה הפיכה של גמישות ג&#39;ל. שהראינו בדוחות קודמים שאפנון דינמי של גמישות ג&#39;ל DNA משפיע פיברובלסטים ונוירון התנהגות. בדוח זה ווידאו, אנו מספקים סכמטי המתאר את מנגנוני crosslinking ג&#39;ל DNA והוראות צעד אחר צעד על ג&#39;לי DNA ההכנה.

לפני המחקרים שלנו, אינטראקציות התא-ECM נצפו בחומרים ביולוגיים תואמים סטטי או על מצעים דינמיים בלתי הפיכים וחד כיווני. מצעים אלו אינם משקפים את האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי. העבודה שלנו מסיטה את פרדיגמות טכניות הקיימות על ידי מתן מודל פיסיולוגי יותר לחקר אינטראקציות תא ECM על ריכוך והתקשות חומרים ביולוגיים דינמיים. במחקרים קודמים, שנתחנו את ההשפעות של מצעים דינמיים בתאים על ידי בחינת מורפולוגיות תא שונות ופנוטיפים על ג&#39;לים אלה. בדוגמא אחת, אנו קובעים את ההשפעות של ה...

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג&#39;ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד מקושרים על ידי DNA, שיכולים להתקשח או להתרכך באמצעות פיפט של DNA גדילי-בודד אל תוך מצע התרבית לאחר זריעת תאים על פניהם. דבר זה מושג תחילה על ידי השעיה מחדש של DNA גדילי-בודד ליאופיליזים של SA one, SA two, L two, R two וביקורת בבופר, ופולימריזציה נפרדת של תמיסות SA one ו-SA two לתוך שלד של פוליאקרילאמיד. השלב השני הוא ערבוב של תמיסות ה-SA one וה-SA two הפולימריות עם תמיסת L two ליצירת ג'ל ה-DNA.בשלב הבא, תמיסת ג'ל ה-DNA מקובעת על כיסויי זכוכית באמצעות דבק אופטי. השלב הסופי הוא פונקציונליזציה של הג'לים על ידי טיפול ב-sul sampa ולאחר מכן ב-PDL. לבסוף, תאים נזרעים על ג'לי ה-DNA, וגמישות הג'ל מותאמת על ידי הוספה של R two L two או DNA גדילי יחיד (control single stranded DNA) כדי לרכך, להקשיח או לא לשנות את גמישות הג'ל, בהתאמה.תוצאות ניסויים אלו מראות כי הטבע הדינמי של התשתית הבסיסית מכוון את התנהגות התאים. היתרון בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות אחרות כגון CROs, lingo, ו-ball hydrogels, הוא שג'לי DNA אינם דורשים גירוי כגון UV כדי לווסת את הגמישות שלהם. במקום זאת, ג'לי DNA מוקשחים או מרוככים באמצעות דיפוזיה של L two או R two, DNA גדיל-סבבי, דרך הג'ל בהתאמה. ראשית, סבבו בצנטריפוגה DNA גדיל-סבבי SA one ליופיליזד ב-2000 GS למשך

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות...

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

למדו הכנת הידרוג'לים מפוליאקרילמיד מקושרי-DNA לחקר השפעת קשיחות הרקמה על תפקוד תאים. השיטה מאפשרת מודולציה דינמית של תכונות המטריצה החוץ-תאית ללא קרינת UV.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

גלה סרטונים נוספים