הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ניטור חוץ גופי של אשכולות חרוזי לב שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בזמן אמת תלת מימדי וברזולוציה מרחבית גבוהה. זה מושג על ידי תרבית והרחבה של תאי גזע עובריים עד שהם יוצרים גופי אמברי. לאחר מכן, אשכולות הפעימות מנותחים ומצופים על מסננים נקבוביים POLYTETRAFLUOROETHYLENE או PTFE, המאפשרים לשמור עליהם כאוויר לטווח ארוך.

תרביות נוזליות ואז אשכולות פועמים מסומנים בננו-חלקיקים הרמוניים על מנת לבצע מיקרוסקופיה מרובת פוטונים בזמן אמת. התוצאות המתקבלות מאפשרות ניתוח של התארכות מרחבית ותדירות התכווצויות לב בקנה מידה מיקרוסקופי. אז היתרון העיקרי של הננו-חלקיקים האלה הוא שאתה יכול להשתמש בכל אורך גל, במיוחד אינפרא אדום, כך שאתה יכול להיכנס עמוק יותר לתוך הרקמה והם גם יציבים מאוד לאורך זמן.

כך שנוכל לעקוב אחר התהליכים הארוכים שלנו לאורך מסגרות זמן ארוכות. שיטת תרבית תאי גזע זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתכווצות התפקודית של קרדיומיוציטים בתלת מימד. בפרט, התבגרות לב והנדסת רקמות.

אנשים שיטת מחלה חדשה צריכים להיות מודעים לכך שהליך התיוג עם ננו-חלקיקים הרמוניים יכול לשמש רק למיקרוסקופיה מרובת פוטונים ולא ניתן להעבירו למערכות הדמיה מסוג אחר. הרעיון להשתמש בננו-חלקיקים הרמוניים עלה לראשונה בשנת 2005. ננו-חלקיקים אלה מציגים יתרונות ביחס לצבעים פלואורסצנטיים ונקודות קוונטיות.

למעשה, האות שלהם אינו דוהה עם הזמן וניתן להשתמש בהם כדי לנטר דגימות מתפתחות לאורך תקופות זמן ארוכות. הדגמה חזותית של הכנת הדגימה היא קריטית ליעילות ולשחזור של השלבים השונים, במיוחד בעת ביצוע בדיקות תרופות וניתן ליישם אותה גם על רקמות או מחלות שונות. מידול רקמות.

לאחר תרבית והרחבה של תאי גזע עובריים אנושיים או תאי גזע עובריים אנושיים על פי פרוטוקול הטקסט והדגירה שלהם עם קולגנאז חם, ארבעה למשך 10 דקות, אספו את שברי המושבה בשני מיליליטר של התמיינות טרייה, בינונית או DM וצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 115 למשך שלוש דקות. תרבות, שברי המושבה בתרחיף בחיבורים נמוכים במיוחד. שש צלחות באר למשך ארבעה ימים כדי לאפשר להם ליצור גופי עובר או ebs.

לאחר מכן צלחו את ה-EBS החדש שנוצר על 24 לוחות באר מצופים ג'לטין 0.1% למשך 15 עד 30 יום עד להופעת אשכולות פועמים. הסר את ה- PBS ובאמצעות אקוטוס, פרק את המושבות לתאים בודדים לאחר צנטריפוגה והחייאה, והשהה את התאים בצלחת בינונית DM שני מיליליטר לכל אגרו. תא באר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.

אוספים את ה-EBS החדש שנוצר וצלחת שלוש לבאר על 24 צלחות באר מצופות ג'לטין 0.1% לאחר שבועיים עד ארבעה שבועות בתרבית. זהה אשכולות של קרדיומיוציטים פועמים ובעזרת פיפטת משחה מוארכת חתוכה בחדות, נתח אותם ידנית. הפקידו ארבעה מסנני PTFE לכל תוספת והניחו כל אחד מהם בבאר של צלחת שש בארות.

לאחר הוספת מיליליטר אחד של DM לכל אחד, הוסף היטב אשכול פעימות מנותח אחד לכל מסנן PTFE. כדי לתייג את האשכולות, העבירו את מסנני ה-PTFE עם אשכולות הפעימות לתבנית תחתית זכוכית בגודל 3.5 סנטימטר. הוסף מיליליטר אחד של ננו-חלקיקים מהדור ההרמוני השני ב-50 מיקרוגרם למיליליטר ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לבצע הדמיה אופטית לא ליניארית.

לאחר העברת HEBs מסומנים או אשכולות פעימות לב לתא הדמיה, השתמש בהדמיית שדה רחב תחת תאורת אור לבן כדי לזהות מבנים מעניינים בתוך EBS מובחן או אשכולות פעימות פעילים. בצע סריקה תלת מימדית מהירה ברזולוציה נמוכה כדי לבנות מחדש את המורפולוגיה הכוללת של אשכול הלב ובחר מישור תמונה בתוך נפח האשכול עם מספר ננו-חלקיקים מהדור ההרמוני השני הגלויים לניטור בזמן אמת. התכווצויות אשכול הלב מגדירים את הסורק האופטי של המיקרוסקופ במצב המהיר ביותר, ומאפשרים רכישה מרובת הרץ של תמונות דו מימדיות.

ניתוח התמונות באמצעות תוכנת MATLAB על פי פרוטוקול הטקסט כפי שמודגם כאן לפני הערכת פעילות ההכאה. אפיון התגובה האופטית הלא ליניארית של מסנני ה-PTFE מתבצע על מנת להבטיח שהמצע החשוף לפלואורסצנציה של פוטונים חלש מאוד ואינו יכול למנוע מדידת הדגימות הביולוגיות הרלוונטיות והפליטה מבודדת. ניתן לרכוש בקלות ננו-חלקיקים מהדור ההרמוני השני על ידי הדמיה דרך המצע במצב זיהוי אפי.

באיור זה, ננו-חלקיקים מהדור השני המסומנים במבני לב ו-EBS מוצגים להב. הצבעים האדום, הצהוב והירוק תואמים לאוטופלואורסצנציה של NADH בעוד שהכתמים ההרמוניים השניים הכחולים האינטנסיביים נובעים מננו-חלקיקים מבודדים מהדור השני של הדור השני. שימו לב לניגודיות האופטית הטובה ולתיוג הדליל יחסית בהשוואה לנקודות קוונטיות או ננו-חלקיקי המרה למעלה.

איור זה ממחיש תצוגת פרוסה של ננו-חלקיקים מהדור השני של ההרמוניה המסומנים באשכול פעימות לב. כפי שמוצג בסרט זה, המבנים התלת-ממדיים מוקלטים במהירות גבוהה כדי לנטר את דפוס ההתכווצות בתא השני. ננו-חלקיקים מהדור ההרמוני מצטברים כדי לשמור על קצב מהירות רכישה גבוה לפתרון תנועת ה-NP.

רגישות הרכישה הכוללת לא הספיקה כדי לתעד אוטופלואורסצנטיות של תאים עם פליטה הרמונית שנייה מהדור ההרמוני השני. ניתוח תמונה של ננו-חלקיקים המבוצע על מסגרות סרטים מצביע על כך שבתוך אותו אשכול לב תזוזה הם בסדר גודל של כמה מיקרומטרים, והתדר קבוע עבור תנועת ננו-חלקיקים מהדור ההרמוני השני הרגיל והחוצה. כאשר שולטים בטכניקת הכנת התאים, אשכול ההימורים מנתח את תרבית נוזל האוויר וניתן לבצע את ההטלה תוך 24 עד 36 שעות אם מבוצע כראוי.

במיוחד בטכניקה זו, יש להימנע ממגעים באוויר הפתוח כדי למנוע זיהומים. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערכי אלקטרודות מרובים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מתאם פרופילי פוטנציאל פעולה עם תדירות פעימה בתלת מימד. הטכניקה החדשנית שלנו המבוססת על זיהוי האות הלא ליניארי על ידי ננו-חלקיקים הרמוניים יכולה להיות מפותחת עוד יותר עבור מחקרים in vivo מדביקים את אורכי הגל המשמשים להדמיה ומאפשרים חדירה עמוקה יותר לרקמות.

התפתחות אפשרית אחת יכולה להיות בעקבות שילוב של מבנה נגזר של תאי גזע ליישומי רפואה רגנרטיבית.