הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ניטור in vitro של מקבצי תאים לבביים פועמים הגזורים מתאי גזע עובריים אנושיים, בשידור חי בתלת-ממד וברזולוציה מרחבית גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול והתרחבות של תאי גזע עובריים עד ליצירת גופי עוברית (Embry bodies). לאחר מכן, מקבצי התאים הפועמים מבודלים ומונחים על מסנני POLYTETRAFLUOROETHYLENE או PTFE נקבוביים, המאפשרים את תחלוקתם לטווח ארוך בחשיפה לאוויר.

תרביות נוזליות של צבירי תאים פועמים מסומנות עם ננו-חלקיקים הרמוניים כדי לבצע מיקרוסקופיית רב-פוטון בזמן אמת. התוצאים המתקבלים מאפשרים ניתוח של התארכות מרחבית ותדירות של התכווצויות לבביות בקנה מידה מיקרוסקופי. לפיכך, היתרון המרכזי של ננו-חלקיקים אלו הוא שניתן להשתמש בכל אורך גל, ובמיוחד באינפרא-אדום, מה שמאפשר חדירה עמוקה יותר לרקמה, וכן הם יציבים מאוד לאורך זמן.

כך נוכל לנטר את התהליכים הממושכים שלנו לאורך פרקי זמן ארוכים. שיטה זו לתרבית תאי גזע יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח בתחום ההתכווצות התפקודית של קרדיומיוציטים בתלת-ממד, ובמיוחד בהבשלת לב והנדסת רקמות.

משתמשים חדשים בשיטה זו למחלה צריכים להיות מודעים לכך שנוהל הסימון באמצעות ננו-חלקיקים הרמוניים ניתן לשימוש רק עבור מיקרוסקופיה רב-פוטונית ולא ניתן להעבירו לסוגים אחרים של מערכות דימוי. הרעיון להשתמש בננו-חלקיקים הרמוניים עלה לראשונה בשנת 2005. לננו-חלקיקים אלו יש יתרונות ביחס לצבעים פלואורסצנטיים ולנקודות קוונטיות.

למעשה, האות שלהם אינו דועך עם הזמן וניתן להשתמש בהם כדי לנטר דגימות מתפתחות לאורך פרקי זמן ממושכים. הדגמה חזותית של הכנת הדגימה היא קריטית ליעילות ולשחזור של השלבים השונים, במיוחד בעת ביצוע בדיקות תרופות, וניתן להחיל אותה גם על רקמות או מחלות שונות. מידול רקמות.

לאחר גידול והרחבה של תאי גזע עובריים אנושיים (ESCs) בהתאם לפרוטוקול הכתוב ודגירה שלהם עם קולגןאזה חמה, ארבע, למשך 10 דקות, אספו את שברי המושבות לתוך 2 mL של מצע דיפרנציאציה טרי (DM) וסובבו בצנטריפוגה ב-115 ×g למשך שלוש דקות. גדלו את שברי המושבות בתרחיף בלוחות 6 בארות בעלי הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment) למשך ארבעה ימים כדי לאפשר להם להיווצר לגופי עובריים (ebs).

לאחר מכן, זרעו את ה-EBS שנוצרו על פלטות 24 בארות מצופות 0.1% Gelatin למשך 15 עד 30 ימים, עד להופעת מקבצים פועמים. הסירו את ה-PBS ובעזרת acutus, פרקו את המושבות לתאים בודדים לאחר צנטריפוגה ותליה, השהו את התאים במדיום DM, זרעו שני מיליליטר לכל תא באר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך יום אחד.

אספו את ה-EBS שנוצרו לאחרונה וזרוו שלושה לכל באר בלוחות 24 באר מצופים ב-0.1% gelatin לאחר שבועיים עד ארבעה שבועות של תרבית. זהו מקבצי תאי שריר לב (cardiomyocytes) פועמים, ובאמצעות פיפטת פסטור בעלת קצה ארוך וחתוך בחדות, בודדו אותם ידנית. הניחו ארבעה מסנני PTFE לכל אינסרט והניחו כל אחד בבאר של לוח 6 באר.

לאחר הוספת מיליליטר אחד של DM לכל אחד, הניחו צביר פועם מנותח אחד על כל מסנן PTFE. כדי לסמן את הצבירים, העבירו את מסנני ה-PTFE עם הצבירים הפועמים לכלי זכוכית עם תחתית שטוחה בקוטר 3.5 סנטימטרים. הוסיפו מיליליטר אחד של ננו-חלקיקי second harmonic generation בריכוז של 50 µg/mL והדגירו למשך 30 דקות ב-37 °C לצורך ביצוע דימות אופטי לא-ליניארי.

לאחר העברת HEBs מסומנים או מקבצי תאים לבביים פועמים לתא דמיון, השתמשו בדימוי שדה רחב תחת תאורת אור לבן כדי לזהות מבנים רלוונטיים בתוך EBS מובחנים או מקבצים פועמים פעילים. בצעו סריקה תלת-ממדית מהירה ברזולוציה נמוכה כדי לשחזר את המורפולוגיה הכללית של המקבץ הלבבי, ובחרו מישור תמונה בתוך נפח המקבץ שבו נראים מספר ננו-חלקיקים של second harmonic generation למעקב בזמן אמת. התכווצויות המקבץ הלבבי קובעות את מצב הסורק האופטי של המיקרוסקופ למצב המהיר ביותר, המאפשר רכישת תמונות דו-ממדיות בתדר של מספר הרץ.

נתחו את התמונות באמצעות תוכנת MATLAB בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שהודגם כאן לפני הערכת פעילות הפעימות. מאפיינים של התגובה האופטית הבלתי ליניארית של מסנני ה-PTFE מבוצעים כדי להבטיח שהפלואורסצנציה של המצע החשוף לפוטונים חלשה מאוד ואינה מונעת את מדידת הדגימות הביולוגיות הרלוונטיות, וכי ניתן להשיג בקלות את הפליטה מננו-חלקיקים של יצירת הרמוניה שנייה (Second harmonic generation) על ידי דימוי דרך המצע במצב גילוי epi.

באיור זה מוצגים מבני לב ו-EBS המסומנים על ידי ננו-חלקיקים המייצרים גל הרמוני שני. הצבעים האדום, הצהוב והירוק תואמים לאוטופלואורסצנציה של NADH, בעוד שהנקודות הכחולות העזות של הגל ההרמוני השני נובעות מננו-חלקיקים מבודדים המייצרים גל הרמוני שני. שימו לב לניגודיות האופטית הטובה ולסימון הדליל יחסית בהשוואה לנקודות קוונטיות או ננו-חלקיקים להמרה כלפי מעלה.

איור זה מציג מבט חתך של מקבץ תאי לב פועמים המסומן על ידי ננו-חלקיקי יצירת הרמוניה שנייה. כפי שמוצג בסרטון זה, המבנים התלת-ממדיים מוקלטים במהירות גבוהה כדי לנטר את דפוס ההתכווצות בתא השני. ננו-חלקיקי יצירת הרמוניה מצטברים כדי לשמור על קצב רכישה גבוה לצורך רזולוציה של תנועת ה-NP.

רגישות הרכישה הכוללת לא הייתה מספקת כדי להקליט אוטופלורסצנציה של תאים עם פליטה של הרמוני שני מתוך יצירת הרמוני שני. ניתוח תמונות של ננוחלקיקים שבוצע על פריימים של סרטון מצביע על כך שבתוך אותו צביר לבבי, ההעתקים הם בסדר גודל של מספר מיקרומטרים, והתדירות קבועה עבור תנועת ננוחלקיקים של יצירת הרמוני שני בתוך המישור ומחוצה לו. כאשר שולטים בטכניקת הכנת התאים, ניתן לבצע את דיסקציית צביר הרשת, את תרבית האוויר-נוזל ואת הדיגום בתוך 24 עד 36 שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי.

במיוחד בטכניקה זו, יש להימנע ממגע עם האוויר כדי למנוע זיהומים. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כגון רישומים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות מערכים של אלקטרודות מרובות, במטרה לענות על שאלות נוספות, כמו התאמה בין פרופילי פוטנציאל פעולה לתדירות הפעימות בתלת-ממד. הטכניקה החדשנית שלנו, המבוססת על זיהוי אות לא-ליניארי על ידי ננו-חלקיקים הרמוניים, יכולה להתפתח ללימודי in vivo, שכן אורכי הגל המשמשים לדימוג מאפשרים חדירה עמוקה יותר לרקמות.

פיתוח אפשרי אחד עשוי להיות מעקב אחר שילוב של מבנה המופק מתאי גזע ליישומי רפואה רגנרטיבית.