Name: הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור בטוטו הדמיה של ג elegans פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למד כיצד להגדיר מיקרוסקופ גיליון אור לדימות פיתוח עוברי C. elegans בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת צילום תלת-ממדי מהיר עם פגיעה פוטוטוקסית מינימלית בחומרים פלואורסצנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי Lenne ומעבדות ברטרנד, בפרט אוליבייה בלאן לפיתוח תוכנה וג&#39;רמי Capoulade לדיון. אנו מודים גם למתקן PICsL-IBDM ההדמיה, בפרט קלוד מורטי ורייס Detailleur לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מATIP CNRS (לפ-FL ו-VB), Labex להודיע ​​מענק (לפ-FL ו-VB) ומענק מSanofi-Aventis (לVB). אנו מכירים בתשתית צרפת-bioimaging נתמכת על ידי Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR-10-InSb-04-01, מכנים &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. הגדרת גיליון האור ונתיב איתור איור 1 נותן תכנית כללית של ההתקנה האופטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולתקן את המיקרוסקופ והלייזרים על השולחן האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלב לייזרים 488 ננומטר, 561 ננומטר וננומטר 405 עם מראות dichroic המתאימות. אחרי מראות dichroic, הלייזרים צריכים להיות דווקא לשתף מיושרים. שים לב כי הבחירה של אורכי גל הלייזר, מראות dichroic, ומסננים אופטיים נקבעת מספקטרום הספיגה של תוויות ניאון הספציפיות המשמשות בניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסנן אקוסטי האופטי מתכונן (AOTF). השתמש בגיליון הבדיקה המסופק על ידי הספק כדי להתאים את התדירות והעצמה של AOTF. כאשר מיושר היטב, על 90% מכוח הלייזר מועברים בכוונון מרבי, כפי שנמדדו על ידי powermeter. שים לב שחלק הלייזרים ניתן לשלוט באופן מלא על ידי תוכנה, אשר יכול להפוך את AOTF מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולתקןטלסקופ. שים לב שהטלסקופ מורכב משתי עדשות המרחיבות את הקרן לרוחב שווה או גדול יותר מהקוטר של הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית התאורה. העדשה עם אורך המוקד הקטן ביותר צריכה לבוא קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום, ליישר ולתקן את פריסקופ להביא כלפי מעלה הנתיב האופטי קרוב יותר לצמצם האחורי של העדשה הגלילית. שים לב ששתי המראות של פריסקופ הם רכובים באופן שהציר הארוך שלהם מנחית על הנטייה של המראה על מנת לשקף את הקרן הרחיבה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העדשה הגלילית בסמוך ליציאת פריסקופ. שים לב שהעדשה הגלילית מתמקדת הקרן בכיוון אחד ומשאירה אותו collimated בכיוון האחר, וכך יוצר גיליון אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולמקד את גיליון אור וכתוצאה מכך על ידי שימוש בעדשה אובייקטיבית התאורה. שים לב שנקודת המוקד של התמונה אובייקטיבי התאורה צריכה לחפוף עם מוקד האובייקט של מטרת זיהוי. להקרין את הקרןעל מסך (למשל קיר) במרחקים ארוכים. הזז את מטרת התאורה לאורך ציר אלומת התאורה להשיג בקווי המתאר החדים המסך של גיליון האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הקו מרובע (405/488/561/638) פליטה לסנן במקום שמורות במיקרוסקופ (הקובייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה EMCCD בנמל פלט מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את שלב התרגום הידני הראשון על הבמה מיקרוסקופ על ידי ברגים בחורים שנקדחו בבמת מיקרוסקופ. שים לב שקצה הבמה התרגום צריך להיות ממוקם בכ -2 ס&quot;מ ממרכז הבמה מיקרוסקופ, כך שקובט מרוכז מתחת לעדשת מטרת זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את שלב התרגום הידני השני על הראשון. הכיוונים של שני שלבים צריכים להיות בניצב (תרגומי X ו-Y). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השלב פיזואלקטריים Z בחלק העליון של שני השלבים הקודמים. שים לב ששלב ממונע יכול לשמש במקומו של השלב פיזואלקטריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן holde קובטr (ראה איור 2) בחלק העליון של השלבים. קובט יהיה ובכך להיות ממוקם בצומת של דרך ההארה ודרך זיהוי, שהם ניצבים זה לזה. </li></ol> 2. בדיקת גיליון האור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא קובט זכוכית עם פתרון ניאון, ולמקם אותו על בעל המדגם בצומת של שני נתיבים אופטיים. גיליון האור וכך גלוי לעין. זה חייב להיות אופקי, וסימטרי / מרוכז ביחס לעדשת מטרת זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העדשה הגלילית ולרכוש תמונה כדי למדוד את העובי של גיליון האור. שים לב שהעובי של גיליון האור תלוי בצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית התאורה (כ 3-4 מיקרומטר לNA = 0.3). שים לב שעבור עדשה נתון, העובי של אור גיליון יכול להיות מוגבר על ידי הקטנת הגודל של הקרן נכנסת בגב הצמצם עם שסע. שימו לב שזעיר מניאון יכול לשמש כדי למדוד את הגרזןרזולוציה ial ורוחב של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את העדשה הגלילית לפני תחילת הניסוי. </li></ol> 3. ההרכבה של ג elegans עוברים השלבים הבאים הם בתמונה באיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט סימון יהלומים כדי לחתוך חתיכת זכוכית שקופית של מ&quot;מ 10 x 20 x 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5% bacto-אגר במים, להרתיח אותו ולתחזק אותו בבלוק דוד ב60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פולי-L-ליזין בצד אחד של פיסת השקופית לחתוך, לאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ על הספסל ולתקן את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים בסמוך פיסת השקופית לחתוך עם השקופית קבועה ולהוסיף טיפה של אגר נמסו בחלקו העליון. לסחוט את אגר באמצעות אחר שקופית מיקרוסקופ נקייה כדי לקבל משטח אגר דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר למשטח אגר להתייבש לפני הסרת השקופית העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את משטח אגר בצד של השקופית קבועה על מנת להשאיר עודף של כ 3 מ&quot;מ oאגר ו ולהסיר בעדינות את השקופית קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פולי-L-ליזין על אגר ולתת לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תולעים הרה להולדת במדיום M9 בזכוכית שעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את התולעים ברמה של הפות עם אזמל כדי לשחרר את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת משקפת לזהות את העוברים בשלב של עניין ולאסוף אותם באמצעות פיפטה microcapillary. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים על חלק מאגר מצופה פולי-L-ליזין שבולט מחתיכת השקופיות לחתוך. מניחים את העוברים רק בסמוך לגבול של השקופית. אל תציב את העוברים בגבול של אגר, כי הם לא יהיו יציבים מספיק. הסר בעדינות את הנוזל כך שהעוברים ידבקו על שכבת פולי-L-ליזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ליישר את העוברים, כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף לחתוך בצלחת פטרי פלסטיק ובעדינות להוסיף בינוני M9 כדי לכסות את השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת משקפת שהביצים עדיין תקועות על אגר. </li&gt; </ol> 4. הקלטה של ג פיתוח elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ההכנה הקודמת (שקופיות לחתוך, אגר בתוספת עוברים) בבעל המדגם ולמקם אותו בקובט. איור 4 מתאר את בעל תוצרת בית ואיור 5 מראה נוף של קובט בהקשר תצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את קובט על הבמה פיזואלקטריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את מיקומו של עובר עם תאורה בשדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת תוצרת בית השליטה AOTF, את המצלמה ואת הבמה פיזואלקטריים. שים לב שתוכנה חופשית, כגון micromanager, יכולה לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הקו והכוח (AOTF) הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום של גיליון האור באמצעות שלב 3 כיווני תמיכה העדשה הגלילית ועדשת התאורה. להזיז את הבמה יחד בכיוון לרוחב (X) כדי לקבל את האות הבהירה. התאם אז Z מיקום של גיליון האור, ואת מיקום האורך (Y) כדי להשיג הדואר האות הטוב ביותר יחס רעש. שים לב שהעמדה של מוקד גיליון האור ייתכן שתצטרך להיות מותאמת מעובר אחד למשנו כדי לתקן את ההבדלים באורכים נתיב אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת זמן לשגות תמונות, לבחור את זמן החשיפה, להשיג, זמן בין שתי תמונות, כמו גם את מספר התמונות שרכשו, ואת כוח הלייזר. לרכישה 2 צבע, בחר קו לייזר שני. שתי תמונות צבע נרכשות ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש מחסנית AZ, בחר גם את המרחק בין שתי פרוסות, והתחלה ואת סוף העמדות של פיזואלקטריים. </li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li>
<li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר התקנה קלה של מיקרוסקופיה גיליון אור לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים. האלמנטים אופטיים הדרושים כדי ליצור וליישר את גיליון האור, כוללים לייזרים, הרחבה קרן, collimation ועדשות מיקוד, יכולים להיות מותקן בקלות על ספסל אופטי. בשילוב עם מיקרוסקופ זקוף לדרך האיתור והמצלמה, זה מספק פתרון פשוט להתקנה מיקרוסקופ גיליון אור. גיאומטריה זו הופכת את הסביבה לדוגמא פשוטה. דגימת החיים ממוקמת בקובט זכוכית, המוחזקת, מיקומו ועבר על ידי קבוצה קטנה של חתיכות מכאניות. מיקרוסקופיה תאורת גיליון היא טכניקת שדה רחבה עם חתך יכולת, תנועה היחידה ציר יחיד ממונעות נדרש להדמית 3D. זה מגביל את הדרישה של סנכרון לאלמנט סריקה בודד ומאפשר פיתוח תוכנה. לעומת 6 iSPIM geomet הזקוף שלנור&quot;י מאפשר השימוש בעדשה אובייקטיבית NA גבוהה לצורך זיהוי. בהשוואה להגדרות SPIM עם עדשות אובייקטיביות במישור האופקי ההרכבה של מדגם וההדמיה מסדרה של עוברים הן יותר קלה. בסך הכל, את היישום של טכניקה זו הוא פשוט וניתן להשיג עם מומחיות קטנה בתחום האופטיקה. זוהי אלטרנטיבה זולה יותר למיקרוסקופי confocal עם היתרונות של מהירות גבוהה יותר וphototoxicity אבל חסרון של רזולוציה צירית נמוכה מופחתים. אנחנו גם פיתחנו דרך קלה ולשעתק לעלות ג עוברי elegans לin vivo הדמיה באמצעות מערכת זו. הליך ההרכבה הוא מהיר (15 דקות) והוא מתאים לניסויים יומיומיים. לג הדמיה elegans, היתרונות של ההתקנה הפשוטה הזה לפחות שני קפלים: (i) בתחום ההדמיה טוטו אפשרית ללא סיבוב ובכך שחזור 3D הוא פשוט; (Ii) הרכבת מדגם קלה ועוברים מרובים יכולים להיות צילמו ברצףבאותה השקופית. הראינו דוגמאות של זמן לשגות סרטים עם רזולוציה של זמן מספיק כדי לבחון חלוקות תא ושינויי צורת תא. כוחה של מיקרוסקופיה גיליון אור ללמוד ג פיתוח elegans יש גם מאויר לאחרונה על ידי אחרים 6, 7, 8. לכן, טכניקה זו תהיה שימושית מאוד ללמוד המורפוגנזה ודפוסים של ג עובר elegans. מערכת זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של אורגניזמים מודל אחרים? חשוב להכיר בכך שהיישום של מיקרוסקופיה תאורת גיליון לאורגניזם קטן ושקוף כמו ג elegans הוא פחות חמור משל אורגניזמים גדולים יותר, כמו עוברי דרוזופילה. בהדמית טוטו של דרוזופילה בדרך כלל דורש סיבוב ושחזורים רב להציג 9, 10. עירור משני צדדים עם עדשות אובייקטיביות עירור קוליניאריות יכולים גם הפחית את תופעות הצל שנגרמו על ידי attenuatיון של 11 אור. עם זאת, ההגדרה שהוצגה כאן היא עדיין מותאמת לצד תמונה אחד מעוברי דרוזופילה, עם הלבנת נמוכה וphotoxicity הנמוך. גם הגדרה זו יכולה להיות שימושית לעוברי תמונה קטנים ושקופים כגון ascidians או דג הזברה.

היווצרות ועיצובה של האורגניזם כרוך תנועות תא, שינויים בצורת תא, חלוקת תא והתמיינות תאים. הבנת ההתקדמות ותיאום של תהליכים אלה דורשים כלי הדמיה מהירים עם יכולת תלת ממדים ורזולוציה subcellular. בין הטכניקות עם in vivo יכולות הדמיה אלה, מיקרוסקופיה תאורת גיליון אור הנקראת גם מיקרוסקופיה יחידה / תאורת מטוס סלקטיבית יש את היתרון הייחודי של הפקת אפקטים נמוכים phototoxic ונמוך photobleaching 1,2. במיקרוסקופיה תאורת גיליון, המדגם הוא מואר מהצד בגיליון אור, אשר מבצע חתך האופטי. נתיב ההארה ואת נתיב הגילוי הוא ניצבים זה לזה וגיליון האור מיושר יעלה בקנה אחד עם מטוס מוקד האובייקט של העדשה האובייקטיבית זיהוי. המדגם ממוקם בצומת של שני נתיבים,nd ניתן להעביר לאורך ציר זיהוי כדי לאפשר הדמיה 3D. רק המטוס של עניין הוא מואר ואת כל הנקודות של המטוס הזה מתגלות באותו הזמן. זה מגדיל באופן משמעותי את מהירות הרכישה ומפחית photobleaching כמו גם phototoxicity בהשוואה למיקרוסקופיה confocal 3. למעשה, מיקרוסקופיה תאורת גיליון היא קלה להתקנה וalign: עבור שתי הדמיה ממדית, אין סריקה היא הכרחית לא לחלק זיהוי, ולא לחלק התאורה; כטכניקת שדה רחב עם חתך יכולת, ניתן לקבל הדמיה תלת ממדית על ידי תנועת ציר יחידה של הבמה מחזיקה את המדגם. כאן אנו מציגים את הקמת מיקרוסקופ פשוט אור גיליון ויישומה בתחום הדמיה לטוטו של ג elegans עוברים. ג elegans עוברים מתאימים גם לחיות בvivo הר&quot;יגינג בשל שקיפותם, שושלת בלתי משתנה וסטריאוטיפית תא עמדות 4,5. גיליון התקנת האור פותחה מבוססת על מיקרוסקופ הזקוף סטנדרטי לגילוי. הפרוטוקול המובא להלן מפרט כיצד לבנות וליישר את עירור מודול / נתיב, לבדוק ולאפיין את גיליון האור ולעלות את המדגם עבור ההדמיה 3D. הוא גם מספק דוגמאות של הזמן לשגות סרטים שנרכשו עם ההתקנה על זנים שונים להביע סמני ניאון.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">זיהוי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W אובייקט (NA 1.1, W.D. 2.5 מ"מ)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD מואר אחורי</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>לייזר תאורה 488 ננומטר / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam לייזר חכם</td><td></td></tr><tr><td>405 ננומטר / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam לייזר חכם</td><td></td></tr><tr><td>561 ננומטר / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; להדמיית זמן, 50 או 100mW מספיקים</td></tr><tr><td>מסנן פס דחיית לייזר מרובע קו ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr> עדשת <tr><td>מראה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ</td><td>THORLABS</td><td></td><td>טלסקופ 5X</td></tr><tr><td>עדשה 200 מ"מ</td><td>טלסקופ THORLABS</td><td></td><td>5X</td></tr><tr><td>פריסקופ</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>עדשה גלילית f=100 מ"מ</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton דיקינסון</td><td>214010</td><td>5%</td></tr><tr><td>בתמיסת פולי-ליזין במים&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>נימים GC100F-10, 1.0 מ"מ OD, 0,58 מ"מ ID, 100 מ"מ L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>צינור שאיפה (פיפטה בפה)</td> <td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 בינוני:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>KH2PO4 (3 גרם / ליטר)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6 גרם / ליטר)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5 גרם / ליטר)</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 מ"מ סופי)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיק קובטה</td><td>תוצרת בית תוצרת</td><td></td><td>ברייס Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>מחזיק לדוגמא</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>תוצרת קלוד מורטי&nbsp;</td></tr><tr><td>x שלב</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי 50x20x1 מ"מ</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>חתוך ואז ב-10x20x1 מ"מ</td></tr><tr><td>piezo חשמלי stage עם מגבר/בקר</td><td>PI</td><td>P-622. ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>קובטה 40 מ"מ x 40 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 מ"מ -</td><td></td>10 מ"מ</tr><tr><td>גבוה יהלום נקודת זכוכית סימון עיפרון</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >תוכנה</td></tr><tr><td>C++ (Qt) תוכנה ביתית</td><td></td><td></td><td>שפותחה על ידי אוליבייה בלאן וקלייר צ'ארד &egrave; s, זמין על פי בקשה. פתרונות חלופיים: מיקרו-מנג'ר או labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

טכניקות הדמיה phototoxic מהירה ונמוכות הן תנאי מוקדם כדי ללמוד את ההתפתחות של אורגניזמים בטוטו. מיקרוסקופיה מבוססת גיליון אור מפחיתה צילום הלבנה ואפקטי phototoxic השוואה למיקרוסקופיה confocal, תוך מתן תמונות 3D עם הרזולוציה subcellular. כאן אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של מיקרוסקופ אור גיליון מבוסס, שמורכבת ממיקרוסקופ זקוף וקבוצה קטנה של אלמנטי אופטו מכאני עבור הדור של גיליון האור. הפרוטוקול מתאר כיצד לבנות, ליישר מיקרוסקופ ולאפיין את גיליון האור. בנוסף, הוא מפרט כיצד ליישם את השיטה להדמית טוטו של ג elegans עובר באמצעות תא תצפית פשוט. השיטה מאפשרת את לכידתו של הזמן לשגות סרטי שני צבעים 3D מעל כמה שעות של פיתוח. זה אמור להקל על המעקב של צורת תא, חלוקות תא וחלבונים מתויגים על פני תקופות זמן ארוכות.

שלושה ניסויי הקלטת הזמן לשגות 3D משלושה ג שונה elegans זנים להמחיש את סוג הנתונים שניתן להשיג באמצעות התקנת מיקרוסקופ אור הגיליון שתוארה לעיל. בדקנו כי בתנאים אלה עוברים לפתח במהירות רגילה ולשרוד את ההדמיה, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המצביעים על כך ההדמיה SPIM גורמת לרמות נמוכות phototoxicity רק בג elegans עוברי 6,7. הזן הראשון מבטא היסטון התמזגו GFP (zuIs178; stIs10024). הקלטה בוצעה במהלך 2 שעות עם ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל שניות 37. איור 6 ממחיש מישור אחד של המחסנית בנקודות זמן שונה. שני גרעיני interphasic (חץ) והכרומטין תמצית המיטוטי (ראש חץ) נראים בבירור. הזן השני מבטא טובולין התמזגו GFP (ruIs57) והיסטוןהתמזגו mCherry (itIs37; stIs10226). הקלטה בוצעה במהלך 16 דקות עם ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל שניות 105. איור 7 ממחיש מישורים שונים של המחסנית ונקודות זמן שונה. הסרט קשור 1 המציג 3D שחזורים ב3 נקודות זמן רצופות. במהלך החלוקה, ציר mitotic (הירוק) והכרומוזומים מרוכזים (אדום) נראה בבירור המאפשר המעקב של אוריינטציות חלוקת תאים במהלך התפתחות. הזן השלישי מבטא את אפוליפופרוטאין VIT-2 התמזגו GFP (pwIs23) וקרום מחויב mCherry (ltIs44). הקלטה בוצעה במהלך 25 דקות עם ערימה של 10 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל 30 שניות. איור 8 ממחיש מישורים שונים של המחסנית ונקודות זמן שונה. התנועות מהירות של החלקיקים ליפופרוטאין בחלמון (ירוק) בתוך התאים יכולות להיות בקלותאחריו. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: התקנה אופטית SPIM המורכב מיחידות התאורה וזיהוי, קדמית ונוף תחתית. ביחידת התאורה, הלייזרים בשילוב ידי מראות dichroic להיכנס AOTF, השולט בכוחו של כל אחד הלייזר באופן עצמאי. לאחר מכן, טלסקופ מגדיל את הגודל של הקרן על ידי פי 4 ופריסקופ מביא אותו לגובה של המיקרוסקופ. העדשה הגלילית מהווה את גיליון האור, אשר מקד מחדש על ידי מטרת ההארה. יחידת האיתור משולבת במיקרוסקופ הזקוף, והוא מורכב בעיקר על ידי עדשת האיתור, הסינון, עדשת הצינור וEMCCD. המדגם ממוקם בצומת שבין נתיבי התאורה וזיהוי. שלב פיזואלקטריים מאפשר התקות אנכיות (Z) של המדגם<html> לרכישת 3D. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:. בעל קובט בעל כולל 3 פלטות אלומיניום ומוברג על הבמה פיזואלקטריים. קובט הזכוכית מוחזק על ידי אביב (באדום). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: התקנת פרוטוקול של ג עוברי elegans לניסויי SPIM. חתיכת הזכוכית לחתוך מצופה פולי-L-ליזין. כרית של אגר ממוקמת על המשטח המצופה. פולי-L-ליזין הוא הוסיף לאחר מכן על הכרית אגר. לבסוף, ג elegans עוברים מיושרים על משטח אגר מצופה פולי-L-ליזין. ther.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4: בעל מדגם. בעל מתאים לממדים הפנימיים של קובט הזכוכית. שתי מעיינות (באדום) מחזיקות שקופיות הזכוכית (מתוארות באיור 3). בעל זה ואז לשים בתוך קובט הזכוכית. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5:... בעל מדגם בהקשר תצפית עוברים הם משותקים בשקופית הזכוכית לפי הפרוטוקול סיכם באיור 3 השקופיות מוחזקות על ידי בעל המדגם המתואר באיור 4 בעל המדגם מוכנס בקובט הזכוכית, הוחזק על ידי המחזיק המתואר באיור 2. גיליון האור הוא אופקי ואניlluminates העוברים מהצד. עדשת מטרת זיהוי היא אנכית, מעל למדגם. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6: הקלטה של ג עובר elegans להביע היתוך היסטון :: ה-GFP תמונות מטוס יחידה של עובר מהונדס מבטא היסטון :: GFP היתוך (zuIs178; stIs10024) בנקודות זמן שונות תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D:.. ערימות עשויות 20 פרוסות ( מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר); זמן חשיפה לכל פרוסה: 30 אלפיות שניים; מרווח זמן בין ערימות: 37 שניות; זמן כולל רכישה: 2 שעות. חץ: גרעין interphasic, ראש חץ: הכרומטין המיטוטי מרוכז. בזמן t = 0 דקות העובר הוא בשלב 2 התאים ובt = 120 דקות העובר מכיל כ 70 תאים כצפוי על פי סעיף התפתחותית נורמליהשתין (שים לב שרק את התאים כלולים במישור אחד נראים בתמונות ולא בכל התאים של העובר). כוחה של תאורה היה 30 μW ב488 ננומטר (נמדד ביציאה של מטרת התאורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7: הקלטה של ג עובר elegans להביע :: GFP היתוך טובולין והיסטון :: היתוך mCherry. תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D של ג עובר elegans להביע :: היתוך טובולין GFP (ruIs57) והיסטון :: היתוך mCherry (itIs37; stIs10226). תנאי הקלטה: רכישת ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1מיקרומטר) בכל שנייה 105; סה&quot;כ זמן רכישה: 16 דקות; זמן חשיפה: 200 אלפיות שני לכל ערוץ. לוח תערוכות 10 פרוסות אותה הערימה. לוח ב &#39;מציג את אותו פרוסה כל שניות 210. כוחה של תאורה היה 30 μW ו300 μW, ל488 ו561 לייזרי ננומטר, בהתאמה (שנמדדו ביציאה של מטרת התאורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8: הקלטה של ג עובר elegans להביע GFP היתוך VIT-2 :: וממוקד קרום mCherry. תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D של ג עובר elegans להביע היתוך VIT-2 :: GFP (PWIs23) וmCherry ממוקד קרום (ltIs44). תנאי הקלטה: רכישת ערימה של 10 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) כל 30 שניות; סך הכל זמן רכישה: 25 דקות; זמן חשיפה לכל ערוץ: 200 אלפיות שניים. לוח מציג 5 פרוסות הראשונות של אותה הערימה. לוח ב &#39;מציג את אותו פרוסה כל 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של מיקרוסקופ גיליון אור ויישומה לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים.

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לדגם תמונות של התפתחות C Allergan באמצעות מיקרוסקופיית גיליאור פלואורסצנטית (fluorescence light sheet microscopy). דבר זה מושג תחילה על ידי הגדרת המיקרוסקופ המבוסס על גיליאור, המורכב ממיקרוסקופ אנכי ומסט קטן של רכיבים אופטומכניים ליצירת גיליאור. השלב השני של ההליך הוא קיבוע העובר.השלבים האחרונים הם כיוון גיליש האור (light sheet) על העובר והקלטת התפתחותו. התוצאות יכולות להראות את הדינמיקה של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית במהלך התפתחותו של *C. elegans* באמצעות ניתוח של סרטוני תלת-ממד וסרטוני Time-lapse. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית גיליש אור על פני שיטות קיימות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, הם שהיא מאפשרת דימוג מהיר יותר עם פוטוטוקסיות נמוכה יותר.שלישית, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות האיטום. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרים כגון חולית או דגי זברה. הדגמת הפרוצדורה תהיה ברורה.שיילס, מהנדס מהמעבדה שלי, ופולין לינאק, מהנדסת מהמעבדה של ואן. סעיף זה מתאר את הרכבת המערך, שניתן להשאירה מורכבת עבור כל הניסויים. לאחר שכל הלייזרים, המסננים, הטלסקופ והפריסקופ מומקמו על השולחן האופטי, קבעו את העדשה הגלילית ליצירת גיליאור.מכווננים עדשה אחרת עבור המיקוד. נקודת המוקד של עדשת ההארה צריכה לחפוף לנקודת המוקד של האובייקט בעדשת הגילוי. כעת, מקרינים את קרן האור על הקיר או על מסך ומזיזים את עדשת ההארה לאורך ציר הקרן עד שקווי המתאר של ההקרנה הופכים חדים.שלבו מסנן פליטה של ארבעה קווים (quad line emission filter) ומצלמת E-M-C-C-D במערך המיקרוסקופ. חברו את שלב ההזזה הידני השני לשלב הראשון באופן מאונך. הבריגו את המכלול לשלב המיקרוסקופ הקיים.לאחר הסרת עדשת הריכוז הגלילית להארה, מקם את המכלול על המיקרוסקופ והחזר את מערכת ההארה למסלול. חבר את מחזיק ה-qve בנקודת ההצטלבות הניצבת של נתיב ההארה ונתיב הגילוי. כעת, בדוק את גיליון האור.מלאו מבחנה מזכוכית בתמיסת פלואורסצאין והניחו אותה במחזיק שעל הבמה. גיליון האור צריך להיות גלוי. עליו להיות אופקי וממורכז ביחס לעדשת היעד של הגילוי.בשלב הבא, הסר את העדשה הגלילית. בצע אופטימיזציה של גיליון האור באמצעות הזזה תלת-ממדית של עדשת ההארה, ורכוש תמונה כדי למדוד את עובי גיליון האור. עובי זה תלוי במפתח של עדשת העצם.לאחר מכן, הקפידו להחליף את העדשה הגלילית. ראשית, חתכו פיסת זכוכית בעובי 1 mm, בממדים של 10 mm על 20 mm. השתמשו בעט סימון יהלום.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של poly L lysine לצד אחד, ולאחר שהנוזל התייבש, הצמידו אותו לזכוכית כיסוי שנייה. בעמדה קבועה, הוסיפו טיפה של 5% agar והחליקו אותה באמצעות משקלה של זכוכית כיסוי שלישית המונחת מעל. לאחר ייבוש ה-agar, הסירו את זכוכית הכיסוי השלישית וגזרו את פדי ה-agar במרחק של 3 mm מקצה שתי זכוכיות הכיסוי שנותרו, מעל הזכוכית ללא ה-poly L lysine.לאחר מכן, הסיר את השקף המקובע, כך שיישאר בליט של אגר. כסה את האגר ב-20 µL של poly L lysine והמתן לייבושו. כעת, העבר תולעי GR לפטריית שעון מלאה בתווך M9 תחת מיקרוסקופ דיסקציה.חתכו את התולעים באמצעות סקלפל בגובה הוולבה (vulva), ובכך שחררו את הביצים. לאחר מכן, זהו את העוברים שנמצאים בשלב המעניין ואספו אותם באמצעות פיפט מיקרו-קפילרית. העבירו את העוברים אל בליטת האגר (agar overhang) של השקופית המוכנה, ממש לצד קצה השקופית, ולא על שולי האגר.לאחר מכן, יישרו את העוברים באמצעות פיפטת מיקרו-קפילרית תוך כדי הוצאת הנוזל. באמצעות שאיבה, העוברים יידבקו לפולי-ליזין. חשוב מאוד למקם את העוברים היטב כדי להשיג הקלטה טובה, דבר הדורש קפילרה עם פתח מתאים.אם הגודל יהיה קטן מדי, יהיה קשה לשחרר את העוברים. אם הגודל יהיה גדול מדי, יהיה קשה לשלוט באופן הדוק בזרימה הדולפת ולהיישר את העוברים. כסו את העגילה בתוך צלחת פטרי עם מצע M nine ואשרו באמצעות הגדלה שהעוברים עדיין צמודים לאגר. כעת, קבעו את העגילה המוכנה עם העוברים למחזיק הדגימות המתאים ל-vete.המחזיק הוא התקן שהוכן במעבדה ומתוכנן להתאימה ל-vete. לאחר מכן, קבע את ה-vete לבמה פיזו-אלקטרית (Pizo electric stage) ואתר עובר תחת תאורת שדה בהיר (brightfield illumination). כעת הפעל את חבילת התוכנה השולטת ב-acoustic optic tuneable.סננו את המצלמה ואת הבמה. תוכנה זו נכתבה בבית, אך ניתן להשתמש גם בתוכנה החינמית micromanager. ראשית, בחרו את קו הלייזר.בשלב הבא, כוון את הבמה לאורך ציר x עד שדף האור יהיה בבהירותו המקסימלית. לאחר מכן, כוון את שני הממדים האחרים, Y ו-Z, עד שיחס signal to noise יהיה במיטבו. ייתכן שיהיה צורך לחזור על פעולה זו עבור כל עובר.מפתח זה לאופטימיזציה של יחס הסיגנל לרעש להשגת הקלטה טובה מתרגם את שלב החופש, תמיכה ב-וביטול המטרה כאשר אני פשוט מערכת יחסים להשגת סימולציה רציפה של העובר והניגודיות הטובה ביותר. כעת, לצורך רכישת תמונות time lapse, הגדירו את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, ההגבר (gain) ומרווחי הצילום בהתאם לרמת הפלואורסצנציה של העובר ולמהירות התהליך הביולוגי הנבדק. עבור Zack.בדימות נקבע המרחק בין הפרוסות ומיקומי ההתחלה והסיום שלהן בתאי elgan המבטאים מבנה היסטון-GFP. דימות time-lapse למשך שעתיים בוצע באמצעות מחסניות של 20 פרוסות שנלקחו מדי 37 שניות. חלוקות תאים היו גלויות בבירור בזן המבטא tubulin המחובר ל-GFP והיסטון המחובר ל-m cherry. ההקלטות בוצעו למשך 16 דקות מדי 105 שניות.רינדורים בתלת-ממד מוצגים בשלוש נקודות זמן. כישורי המיטוזה והכרומוזומים המעובים נראים בבירור וניתנים למעקב קל לאורך חלוקות התאים. בזן שלישי, בו APO lipoprotein vit two היה מאוחד ל-GFP, בוצע דימוי עם סימון mCherry של ממבנה התא.במהלך 13 דקות, נלקחו 10 ערימות פרוסות בכל 27 שניות. חלקיקי ליפופרוטאין בעלי תנועה מהירה היו קלים למעקב. כאן אנו משתמשים בגילי אור שנוצר בשיטות מורכבות יותר.ניתן ליישם את גישת גילי האור (light sheet) כדי לשפר עוד יותר את הרזולוציה המרחבית.

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.

הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

למד כיצד להגדיר מיקרוסקופ גיליון אור לדימות פיתוח עוברי C. elegans בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת צילום תלת-ממדי מהיר עם פגיעה פוטוטוקסית מינימלית בחומרים פלואורסצנטיים.

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור

גלה סרטונים נוספים