הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור

המטרה הכללית של הליך זה היא לדגם תמונות של התפתחות C Allergan באמצעות מיקרוסקופיית גיליאור פלואורסצנטית (fluorescence light sheet microscopy). דבר זה מושג תחילה על ידי הגדרת המיקרוסקופ המבוסס על גיליאור, המורכב ממיקרוסקופ אנכי ומסט קטן של רכיבים אופטומכניים ליצירת גיליאור. השלב השני של ההליך הוא קיבוע העובר.

השלבים האחרונים הם כיוון גיליש האור (light sheet) על העובר והקלטת התפתחותו. התוצאות יכולות להראות את הדינמיקה של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית במהלך התפתחותו של *C. elegans* באמצעות ניתוח של סרטוני תלת-ממד וסרטוני Time-lapse. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית גיליש אור על פני שיטות קיימות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, הם שהיא מאפשרת דימוג מהיר יותר עם פוטוטוקסיות נמוכה יותר.

שלישית, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות האיטום. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרים כגון חולית או דגי זברה. הדגמת הפרוצדורה תהיה ברורה.

שיילס, מהנדס מהמעבדה שלי, ופולין לינאק, מהנדסת מהמעבדה של ואן. סעיף זה מתאר את הרכבת המערך, שניתן להשאירה מורכבת עבור כל הניסויים. לאחר שכל הלייזרים, המסננים, הטלסקופ והפריסקופ מומקמו על השולחן האופטי, קבעו את העדשה הגלילית ליצירת גיליאור.

מכווננים עדשה אחרת עבור המיקוד. נקודת המוקד של עדשת ההארה צריכה לחפוף לנקודת המוקד של האובייקט בעדשת הגילוי. כעת, מקרינים את קרן האור על הקיר או על מסך ומזיזים את עדשת ההארה לאורך ציר הקרן עד שקווי המתאר של ההקרנה הופכים חדים.

שלבו מסנן פליטה של ארבעה קווים (quad line emission filter) ומצלמת E-M-C-C-D במערך המיקרוסקופ. חברו את שלב ההזזה הידני השני לשלב הראשון באופן מאונך. הבריגו את המכלול לשלב המיקרוסקופ הקיים.

לאחר הסרת עדשת הריכוז הגלילית להארה, מקם את המכלול על המיקרוסקופ והחזר את מערכת ההארה למסלול. חבר את מחזיק ה-qve בנקודת ההצטלבות הניצבת של נתיב ההארה ונתיב הגילוי. כעת, בדוק את גיליון האור.

מלאו מבחנה מזכוכית בתמיסת פלואורסצאין והניחו אותה במחזיק שעל הבמה. גיליון האור צריך להיות גלוי. עליו להיות אופקי וממורכז ביחס לעדשת היעד של הגילוי.

בשלב הבא, הסר את העדשה הגלילית. בצע אופטימיזציה של גיליון האור באמצעות הזזה תלת-ממדית של עדשת ההארה, ורכוש תמונה כדי למדוד את עובי גיליון האור. עובי זה תלוי במפתח של עדשת העצם.

לאחר מכן, הקפידו להחליף את העדשה הגלילית. ראשית, חתכו פיסת זכוכית בעובי 1 mm, בממדים של 10 mm על 20 mm. השתמשו בעט סימון יהלום.

לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של poly L lysine לצד אחד, ולאחר שהנוזל התייבש, הצמידו אותו לזכוכית כיסוי שנייה. בעמדה קבועה, הוסיפו טיפה של 5% agar והחליקו אותה באמצעות משקלה של זכוכית כיסוי שלישית המונחת מעל. לאחר ייבוש ה-agar, הסירו את זכוכית הכיסוי השלישית וגזרו את פדי ה-agar במרחק של 3 mm מקצה שתי זכוכיות הכיסוי שנותרו, מעל הזכוכית ללא ה-poly L lysine.

לאחר מכן, הסיר את השקף המקובע, כך שיישאר בליט של אגר. כסה את האגר ב-20 µL של poly L lysine והמתן לייבושו. כעת, העבר תולעי GR לפטריית שעון מלאה בתווך M9 תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

חתכו את התולעים באמצעות סקלפל בגובה הוולבה (vulva), ובכך שחררו את הביצים. לאחר מכן, זהו את העוברים שנמצאים בשלב המעניין ואספו אותם באמצעות פיפט מיקרו-קפילרית. העבירו את העוברים אל בליטת האגר (agar overhang) של השקופית המוכנה, ממש לצד קצה השקופית, ולא על שולי האגר.

לאחר מכן, יישרו את העוברים באמצעות פיפטת מיקרו-קפילרית תוך כדי הוצאת הנוזל. באמצעות שאיבה, העוברים יידבקו לפולי-ליזין. חשוב מאוד למקם את העוברים היטב כדי להשיג הקלטה טובה, דבר הדורש קפילרה עם פתח מתאים.

אם הגודל יהיה קטן מדי, יהיה קשה לשחרר את העוברים. אם הגודל יהיה גדול מדי, יהיה קשה לשלוט באופן הדוק בזרימה הדולפת ולהיישר את העוברים. כסו את העגילה בתוך צלחת פטרי עם מצע M nine ואשרו באמצעות הגדלה שהעוברים עדיין צמודים לאגר. כעת, קבעו את העגילה המוכנה עם העוברים למחזיק הדגימות המתאים ל-vete.

המחזיק הוא התקן שהוכן במעבדה ומתוכנן להתאימה ל-vete. לאחר מכן, קבע את ה-vete לבמה פיזו-אלקטרית (Pizo electric stage) ואתר עובר תחת תאורת שדה בהיר (brightfield illumination). כעת הפעל את חבילת התוכנה השולטת ב-acoustic optic tuneable.

סננו את המצלמה ואת הבמה. תוכנה זו נכתבה בבית, אך ניתן להשתמש גם בתוכנה החינמית micromanager. ראשית, בחרו את קו הלייזר.

בשלב הבא, כוון את הבמה לאורך ציר x עד שדף האור יהיה בבהירותו המקסימלית. לאחר מכן, כוון את שני הממדים האחרים, Y ו-Z, עד שיחס signal to noise יהיה במיטבו. ייתכן שיהיה צורך לחזור על פעולה זו עבור כל עובר.

מפתח זה לאופטימיזציה של יחס הסיגנל לרעש להשגת הקלטה טובה מתרגם את שלב החופש, תמיכה ב-וביטול המטרה כאשר אני פשוט מערכת יחסים להשגת סימולציה רציפה של העובר והניגודיות הטובה ביותר. כעת, לצורך רכישת תמונות time lapse, הגדירו את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, ההגבר (gain) ומרווחי הצילום בהתאם לרמת הפלואורסצנציה של העובר ולמהירות התהליך הביולוגי הנבדק. עבור Zack.

בדימות נקבע המרחק בין הפרוסות ומיקומי ההתחלה והסיום שלהן בתאי elgan המבטאים מבנה היסטון-GFP. דימות time-lapse למשך שעתיים בוצע באמצעות מחסניות של 20 פרוסות שנלקחו מדי 37 שניות. חלוקות תאים היו גלויות בבירור בזן המבטא tubulin המחובר ל-GFP והיסטון המחובר ל-m cherry. ההקלטות בוצעו למשך 16 דקות מדי 105 שניות.

רינדורים בתלת-ממד מוצגים בשלוש נקודות זמן. כישורי המיטוזה והכרומוזומים המעובים נראים בבירור וניתנים למעקב קל לאורך חלוקות התאים. בזן שלישי, בו APO lipoprotein vit two היה מאוחד ל-GFP, בוצע דימוי עם סימון mCherry של ממבנה התא.

במהלך 13 דקות, נלקחו 10 ערימות פרוסות בכל 27 שניות. חלקיקי ליפופרוטאין בעלי תנועה מהירה היו קלים למעקב. כאן אנו משתמשים בגילי אור שנוצר בשיטות מורכבות יותר.

ניתן ליישם את גישת גילי האור (light sheet) כדי לשפר עוד יותר את הרזולוציה המרחבית.