ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הזנק של אוניברסיטת סיימון פרייזר.

1. ממברנות הקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ hypotonic (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 10 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על תא גלולה (~ 10 8 תאים) ו דגירה של 15-30 דקות על קרח. Lyse התאים על ידי העברת הדגימה באמצעות מחטי מזרק (5-10 עובר) או שמאחד את המדגם על ידי homogenizer Dounce (15-30 שבץ). השתמש hemocytometer וכתמי כחולי trypan כדי לבדוק את היעילות של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שבריר microsomal ידי צנטריפוגה ההפרש של lysate ב3,000 דקות 15 GX ולאחר מכן ב100,000 GX 2 שעות. צנטריפוגה הראשונה משיגה גלולה שהוא שבריר הגרעיני, וצנטריפוגה הבאה של supernatant מייצרת גלולה שנייה, המהווה את חלק microsomal המכיל קרום הפלזמה, כמו גם האברונים קרום הנכנס 8. Supernatant הסופי הוא שבריר cytosolic. אחסן את השברים microsomal במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך analys נוסףהוא כמפורט להלן. </li></ol> 2. ממיסים, לפגל, וחלבונים בממברנה Digest <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את חלקיק microsomal במאגר denaturation (40 מ&quot;מ טריס, 10 mM EDTA, 10 מ&quot;מ TCEP, 0.5% Rapigest, pH 8) ולאחר מכן דגירה הפתרון ב100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את הפתרון המחומם לטמפרטורת חדר, להוסיף אבקת אוריאה גבוהה במיוחד טוהר לפתרון ל8 ריכוז סופי M ודגירה המדגם ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון מניות iodoacetamide למדגם ל15 מ&quot;מ ריכוז סופי, ודגירת הפתרון בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לalkylate thiols בחינם במדגם. הוספת פתרון מניות DTT המדגם לריכוז סופי 10 מ&quot;מ ודגירת הפתרון עוד 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להרוות את iodoacetamide המוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 10x הפתרון שהושג עם 40 חיץ מ&quot;מ טריס ב-pH 8, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדוגמא ביחס 1:20 של trypsin לחלבון בסך הכל. שמור את תגובת מערכת העיכול בלילה בתנור 37 ° C כדי להבטיח התגובה הושלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את מערכת העיכול על ידי acidifying פתרון המדגם ל-pH 1 עם HCl, מצב זה גם מפרק את חומרי הניקוי, כלומר Rapigest. לבזות את Rapigest ב-C ° 37 עבור שעה 1, ולהסיר את המשקעים שפותחו על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את supernatant המכיל פפטידים מדגם על ידי מחסנית C-18 מיצוי שלב מוצק (SPE) ולייבש את הדגימה המתקבלת על ידי speedvac. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח SDS-PAGE של דגימות לפני ואחרי טריפסין עיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. </li></ol> 3. לכידת glycopeptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את פפטידים ניקו בחיץ הצימוד (אצטט 100 מ&quot;מ נתרן, pH 5.5). הוספת periodate נתרן לתוך תמיסת פפטיד בריכוז 10 מ&quot;מ סופי ל30 דקות בחושך, בטמפרטורת חדר. זה יהיה לחמצן קבוצות cis-דיאול בglycans לאלדהידים, המאפשרת glycans לבני זוג השרף דרך הכימיה hydrazide. להרוות את periodate המופרז על ידי סולפיט נתרן בריכוז 20 מ&quot;מ סופי וה-pH 5 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שרף derivatized hydrazide לתוך תמיסת פפטיד ביחס של 1:4 (שרף לפתרון) לזוג glycopeptides לשרף. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עם סיבוב מקצה לקצה עבור צימוד שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פפטידים מאוגדים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 מיליליטר של כל אחד מאלה: המים DI, 1.5 M NaCl, מתנול ואצטוניטריל 80%. לבסוף, לשטוף 3x השרף עם 1 מיליליטר של 100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3 ב-pH 8 להחליף את החיץ של המערכת ל100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant והשוטף לניתוח של פפטידים מאוגדים (אופציונליים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את N-glycopeptides מהשרף על ידי PNGase F בדגירת לילה בשעה 37 ° C עםn מקצה לקצה רוטציה. לאסוף את הפפטידים שפורסמו על ידי צנטריפוגה ולשטוף אצטוניטריל 80%. ייבש את הפתרון שהתקבל בspeedvac לניתוח LC-MS. </li></ol> 4. היפוך חלוק נוסף (אופציונאלי) כדי לפשט את מורכבות מדגם נוסף, fractionate N-glycopeptides מתקבל. לדוגמא, redissolve פפטידים המיובשים לתוך formate האמוניה 10 מ&quot;מ, pH 3 עם אצטוניטריל 20% ולהשתמש בתמורת קטיון חזקה כרומטוגרפיה (SCX) לfractionate פפטידים. ייבש את eluent שהושג, ולאחר מכן לנתח את שברי פפטיד מתקבלים על ידי הפוך השלב LC-MS 8,17,18. 5. ניקוי של N-glycopeptides פורסם (אופציונלית) אם חששות לעלות לזיהום הפוטנציאלי של פפטידים, redissolve פפטידים המיובשים לתוך 0.1% חומצה פורמית ולהשתמש בעמודת MCX SPE לנקות עוד יותר את פפטידים לפני ניתוח LC-MS להפוך שלב. <strong&gt; הערה: פרמטרים חיפוש מסד נתונים. במהלך המחשוף סלקטיבית של N-glycopeptides את השרף, PNGase F ממיר asparagine מקושר N-סוכרים לחומצה אספרטית. לכן, יש שינוי מסת דה 0.9840 של N-glycopeptides המשוחרר. כדי לזהות במדויק את הפפטידים האלה, שינוי זה צריך להוסיף לפרמטרי החיפוש יחד עם שינויים נפוצים כגון carbamidomethylation של ציסטאין והחמצון של מתיונין.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו מציגים אסטרטגית glycopeptide ללכוד לאפיון חלבונים על פני קרום תא. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד חלבונים מופרשים, כגון אלה בדם, כמו גם בנוזלי גוף אחרים או בתקשורת תרבות תא. ההצלחה של השיטה מסתמכת על העיכול של דגימות המלאה; לכן, אפיון SDS-PAGE של יעילות העיכול הוא הכרחי, במיוחד עבור הניתוח של מדגם בפעם הראשונה. עיכול שלם יכול להיות מאתגר עבור חלבונים בממברנה, והוא יכול להיות אפשרי רק לאחר solubilizat...

חלבונים בתא שטח באינטראקציה עם הסביבה תאית ולהעביר אותות מבחוץ לחלק הפנימי של תא. לפיכך, חלבונים אלה, כוללים חלבוני מטריצת חוץ תאיים, ממלאים תפקידים קריטיים בכל ההיבטים של ביולוגיה ופיזיולוגיה, החל שגשוג, צמיחה, הגירה, בידול להזדקנות וכן הלאה סלולריות. חלבוני פני השטח לתפקד על ידי אינטראקציה עם תאים אחרים, חלבונים ומולקולות קטנות 1-3. אפיון מולקולרי של חלבונים על פני קרום התא הוא עניין רב לא רק לביולוגים, אלא גם לחברות תרופות, שכן יותר מ -60% מתרופות ממוקדים לחלבונים על פני קרום תא 4. ספקטרומטריית טנדם מסה (MS), עם הרגישות שלה מעולה, דיוק, ותפוקה לזיהוי של חלבונים ופפטידים, כבר כלי רב עוצמה למחקרים proteomic הגלובליים 5,6. עם זאת, חלבוני פני השטח להוות אתגר משמעותי לפרוטאומיקה מבוססת MS, כפירוב חלבוני פני השטח קיימים בכמויות נמוכות ועם שינויים כבדים. האזורים פורש הקרום של חלבוני פני השטח לעבד אותם הידרופובי; זה נכון במיוחד במקרה של חלבונים הטרנסממברני multipass. זה קשה ובכך לפזר חלבוני קרום בתמיסות מימיות ללא העזרה של חומרי ניקוי; עם זאת השימוש בחומרי הניקוי, בדרך כלל מדכא את הביצועים של HPLC ו-MS 1,7,8 בזיהוי חלבון. לכן, חלבוני קרום היו מאופיינים בצורה גרועה בפרוטאומיקה מבוססת LC-MS הישירה. Glycosylation הוא אחד לאחר translational השינויים החשובים והנפוצים ביותר המתרחשים בחלבונים על פני קרום תא 9. מורכבות ואת ההטרוגניות עצומות של glycans לעכב MS אות &#39;פפטידים 10. עם זאת, במספר שיטות proteomic השתמשו השינוי הזה ייחודי להעשרת חלבוני פני השטח ולהסיר את moieties הסוכר מחלבונים לפני ניתוח LC-MS. שיטה אלהים כולל לכידה מבוססת קטיני זיקת 11 ולכידה כימית המבוסס על חומצה בורית או מבוסס hydrazide 12 כמו גם פרידות כרומטוגרפיה הידרופילי 8,13. הסרת glycans הופכת חלבונים בממברנה לחלבונים רגילים ומפשטת באופן דרסטי את אפיון הטרשת הנפוצה. בגלל glycosylation גם מתרחש בחלבונים מופרשים שיש מסיסות גבוהה בניגוד לחלבוני קרום, שיטות רבות glycoproteomic מותאמות לחלבונים מסיסים, ונוטות להיות סלקטיביות glycopeptide נמוכה ורגישות כשנפרס קרום חלבונים 8,14. שיטות אחרות קיימות גם להעשיר, בפרט, חלבונים על פני קרום תא, כגון אלה באמצעות ultracentrifugation 15 ואסטרטגיות תיוג 16. השוואה מפורטת בין השיטה שלנו ושיטות קיימות אחרות לאפיון חלבוני קרום נערכה לאחרונה 17, והתוצאות הצביעו על כך שהשיטה שלנו יכולה לבצע באותה מידה, אם לא, אבל עם יותר טובים, יותר מכל שיטות פרוטאומיקה הקרום לעומת פשטות גבוהה יותר. כדי לסייע לחוקרים להשתמש בשיטה זו, אנו נפרט כאן פרוטוקול כללי. שיטה זו משלבת מספר יתרונות של אסטרטגיות glycoproteomics קיימות והוא המציא במיוחד עבור גליקופרוטאינים קרום, אך השיטה עובדת פחות טובה לחלבונים מופרשים. המאפיינים של שיטה זו כוללים: 1) solubilization של חלבונים בממברנה מלא, 2) העשרת glycopeptides במקום גליקופרוטאינים לחסל את הפרעה סטרית הפוטנציאלית בעת שימוש במצע הלכידה מוצק, 3) השימוש בכימית hydrazide ליצירת קשרים קוולנטיים בין glycopeptides ומצע לכידה, כך שglycopeptides מלוכד יכול לסבול שוטף מחמיר לגבוה glycoselectivity, ו -4) את היכולת לנהל את ההליך כולו ללכוד בצינור אחד לאובדן מדגם מופחת ומשך הליך מקוצר. לאחר יישום שיטה זו ללימוד ואריאתי של דגימות ביולוגיות כוללים תאים ורקמות, ראה סלקטיביות גבוהה (&gt; 90%) לגליקופרוטאינים 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest</td><td>SF Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פריודאט</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz הידרזיד ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>וורת'ינגטון ביו-רפואי</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 מחסנית</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX מחסנית</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td>, <td>סיגמא</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>אמרסקו</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סולפיט</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>Invertase</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 trypsin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonulease B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumin</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

חלבונים פני תא, כוללים חלבונים תאיים מטריקס, משתתפים בכל התהליכים העיקריים הסלולריים ופונקציות, כגון צמיחה, בידול, ושגשוגם. אפיון מקיף של חלבונים אלו מספק מידע עשיר לגילוי סמן ביולוגי, זיהוי סוג התא, ובחירת תרופות יעד, כמו גם לעזור לקדם את ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה סלולריות שלנו. חלבוני פני השטח, לעומת זאת, מציבים אתגרים משמעותיים אנליטיים, בגלל השפע שלהם מטבע הנמוך, גבוהה הידרופוביות, ולאחר translational שינויים כבדים. ניצול של glycosylation הנפוץ בחלבוני פני השטח, אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד תפוקה גבוהה, המשלבת את היתרונות של כמה אמצעי N-glycoproteomics קיימים. השיטה שלנו יכולה להעשיר glycopeptides נגזר מחלבונים פני השטח ולהסיר glycans לפרוטאומיקה הקלילה באמצעות LC-MS. N-glycoproteome נפתר כולל information זהות חלבון וכמות כמו גם באתריהם של glycosylation. שיטה זו יושמה לסדרה של מחקרים בתחומים שונים, לרבות סרטן, תאי גזע, ורעילויות תרופה. המגבלה של השיטה טמונה בשפע הנמוך של חלבוני קרום פני השטח, כך שכמות גדולה יחסית של דגימות הנדרשות לניתוח זה בהשוואה למחקרים התמקדו בחלבוני cytosolic.

תרשים זרימת נציג של הליך הניסוי מסוכם באיור 1. התיוג וצעדי חלוקה נוספים הם אופציונליים ופרטים מתוארים בפרסום האחרון 18. אפשרות נוספת היא לנתח את פפטידים ללא שינוי, שאינו מגיבים עם השרף. היתרונות של ניתוח פפטידים ללא שינוי כוללים את זיהוי הפוטנציאל של פפטידים שאינם מסוכרים וחלבונים, כגון claudins בצומת הדוקים; יתרון נוסף הוא כימות מדויק יותר. בהתבסס על יתרונות אלה, אנו כינה זו גרם שיטת lycocapture-roteomics q lobal ssisted-g uantitat...

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעשיר חלבוני ממברנה על פני התא בשפע נמוך. זה מושג על ידי דנטורציה ועיכול ראשונים של חלבוני ממברנה. השלב השני הוא לחמצן את הגליקנים וללכוד את הפפטידים הגליקוזיליים על משטח שרף.לאחר מכן נשטפים הלא-גליקופפטידים מהשרף. השלב האחרון הוא שחרור הגליקופפטידים המקושרים N מהשרף לניתוח lc MS. בסופו של דבר, ניתן למפות את רצף הפפטידים שזוהה בחזרה לחלבונים למטרות זיהוי וכימות.היום אני הולך להדגים לכם כיצד פועל ראל לכידת פפטיד Geico. היתרון העיקרי של מנת יתר של טכניקה זו, למעט קיימים, כגון לכידת גליקופרוטאין, הוא שחלבון הממברנה יתעכל תחילה וניתן לבצע את לכידת הגליקופפטיד בכלי אחד. היישום של טכניקה זו יכול להתרחב לגילוי הסמן הביולוגי של המחלה.מכיוון שחלבון גטור יכול להישפך בדם ובנוזלי גוף אחרים והגליקופרוטאין המסתובב בדם, הספציפיים לתהליך הפתולוגי, יכולים לשמש כפרוגנוזה ואבחון, סמנים ביולוגיים. ראשית, הכינו ארבעה מיליליטר של חיץ היפוטוני עם קוקטייל מעכב פרוטאז אחד עד 100. הוסף מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני על כדור תא המכיל כ-10 עד התאים השמיניים, ודגר את התערובת למשך 15 עד 30 דקות על קרח, העבירו את התאים לבקבוקון של שני מיליליטר וכינים את התאים על ידי העברת הדגימה חמש עד 10 פעמים דרך מחט מזרק.לאחר מכן השתמש בציטומטר המו ובצביעה כחולה טריאן. כדי לבדוק את יעילות הליזה, שלב את הליזאט של מיליליטר אחד עם שלושה מיליליטר של שאריות מאגר היפוטוני. סובב את הצינור ב -3000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה ואחסנו את הגלולה במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. סובב את צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, ממיסים את השבר המיקרוזומלי ב -200 מיקרוליטר של מאגר דנטורציה, ואז מרתיחים את התמיסה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר קירור התמיסה המחוממת לטמפרטורת החדר, הוסיפו אבקת אוריאה בטוהר גבוה במיוחד כדי לתת ריכוז סופי של שמונה מולארי ודגרו על הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים 500 מילימולר. אני צריך תמיסת מלאי אצטמיד לדגימה כדי לתת ריכוז סופי של 15 מילימולר.לאחר מכן דגרו את התמיסה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאלקיל את התיולים החופשיים בדגימה. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי DTT מולרית אחת לדגימה כדי לתת ריכוז סופי של 10 מילימולר ודגר את התמיסה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. כדי להרוות את העודף I oto אצטמיד יש לדלל את התמיסה המתקבלת 10 פעמים עם מאגר טריס של 40 מילי-מולרי ב-PH שמונה, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדגימה ביחס של 1 ל-20 של טריפסין לכמות החלבון הכוללת.השג את כמות החלבון הכוללת באמצעות מבחן ברדפורד. שמרו על תגובת העיכול בתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח שהתגובה תושלם. בסיום, יש להפסיק את העיכול על ידי החמצת תמיסת הדגימה ל-pH 1 עם חומצה הידרוכלורית של 10 מילי-מולרי, מצב שגם מתדרדר במהירות הגבוהה ביותר.לאחר מכן חומר הניקוי מתכלה במהירות הגבוהה ביותר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת באינקובטור. לאחר הדגירה, הסר את המשקעים המפותחים על ידי צנטריפוגה לאחר צנטריפוגה. נקה את ה-SUP natin המכיל את פפטידי הדגימה על ידי מחסנית מיצוי פאזה מוצקה C 18 וייבש את הדגימה שהתקבלה בוואקום מהיר.בצע ניתוח דף SDS של דגימות לפני ואחרי טיולים ועיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. בשלב זה, ממיסים את הפפטידים הנקיים ב -200 מיקרוליטר של מאגר צימוד. לאחר הוספת מטהר נתרן לתמיסת הפפטיד כדי לתת ריכוז סופי של 10 מילי-מולארי.דגירה של הדגימה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר בסיום הדגירה, הרוו את הפראט המוגזם בנתרן גופרתי כדי לתת ריכוז סופי של 20 מילימולר ו-pH של חמישה לאחר הדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הכניסו 200 מיקרוליטר של תמיסת שרף נגזרת הידרוציטים, מאגר מאוזן וצימוד לתמיסת הפפטיד. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עם סיבוב מקצה לקצה לצימוד מלא. בסיום, הסר את הפפטידים הלא קשורים על ידי שטיפת השרף פעמיים במיליליטר אחד של מים נטולי יונים, מיליליטר אחד של 1.5 נתרן כלורי מולרי, מיליליטר אחד של מתנול ומיליליטר אחד של 80% אצטו ניטריל.לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט ואת השטיפות לניתוח פפטידים לא קשורים. אחסן את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. לאחר מכן שטפו את השרף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט ב-pH שמונה.לבסוף, הוסף 300 מיקרוליטר אמוניום ביקרבונט לבקבוקון הדגימה. לשחרר את הגליקופפטידים N מהשרף. הוסף PNG ACE F ודגר את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה.לאחר מכן, אספו את הפפטידים המשוחררים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן שטפו את השרף עם מיליליטר אחד של 80% אצטיל ניטריל. שלב את הכביסה עם מה שנאסף בעבר. לבסוף יבש את התמיסה שהתקבלה במהירות VAC לניתוח lc MS.ספקטרום גליקופפטיד לא טיפוסי שנלקח לאחר שיטת ההעשרה מוצג כאן בגליקופפטיד המתקבל. ה-n גליקן הוסר והגליקן המחובר לזלזול הומר לחומצה ספרטית על ידי P-N-G-A-F. לכן, ניתן לחפש את הספקטרום בקלות על ידי כל מנוע חיפוש פרוטאומי מול מסדי נתונים נפוצים של רצפי חלבונים.lc MS לא טיפוסי. התוצאה של n גליקופפטידים שנלכדו מוצגת כאן בה ניתן לזהות יותר מ-100 גליקופרוטאינים מריצת lc MS בודדת של מקטע מיקרוזומלי של תא. סלקטיביות ההעשרה הן לגליקופרוטאינים והן לגליקופפטידים היא בדרך כלל יותר מ-90%ניתוח מוצלח יכול להיות בעל סלקטיביות העשרה של 95% באמצעות עמודת SCX ושיפוע צעד לפיצול נוסף. הדגימות לפני ניתוח LCMS בדרך כלל יכפילו את מספר זיהויי הגליקופרוטאין.לפעמים כאשר כמות הגליקופפטידים המתקבלים נמוכה, ניתן לראות את הטומאה שהצטברה מהבקבוקונים בדגימה הסופית. ניתן להסיר מזהמים אלה על ידי עמודת MCX. אז אחרי שצפיתם בסרטון הזה, אני מקווה שיש לכם הבנה טובה כיצד להשתמש בשיטות לכידת הגליקופפטידים שלנו כדי לחקור חלבון ממברנה בשירות עצמי.בזמן שאתה מנסה פרוטוקול זה, חשוב גם להקצות דוגמאות לכל שלב לפתרון בעיות. ניתן לייעל את נפח המגיב גם למחקר הספציפי שלך.

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הועסקו על HPLC. סטנדרטים Glycopeptide שימש שולטת חיוביים ושליליים. מאדים 14 מדולדל, טריפסין-מתעכל פלזמה האדם היה chromatographed ו flow-through (FT) וכן שברים מחויב שנאספו עבור ניתוחים ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides היו מועשר בשבריר מחויב לעומת FT.

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

השליח השני c-di-GMP הנפוץ בכל מקום שולט בגדילה ובהתנהגות של חיידקים רבים. פיתחנו טכנולוגיה חדשה המבוססת על ספקטרומטריית מסה של תרכובת לכידה לזיהוי ואפיון ביוכימי של חלבונים קושרים c-di-GMP כמעט בכל מין חיידקים.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

שינויים לאחר התרגום (PTMs) משנים את המבנים והתפקודים של חלבונים. שיטות להעשרה בו-זמנית של סוגי PTM מרובים יכולות למקסם את הכיסוי בניתוחים. אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת Ti(IV) דו-תפקודית ואחריה ספקטרומטריית מסה להעשרת וניתוח בו זמנית של חלבון N-גליקוזילציה וזרחון ברקמות הלבלב.

אסטרטגיית העשרת ספין-טיפ לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מרקמות הלבלב האנושיות

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

מחקר זה מציג גישה של לכידת גליקופפטיד להעשיר חלבוני ממברנת תא בעלי שכיחות נמוכה לניתוחים פרוטאומיים מבוססי LC-MS.