Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעשיר חלבוני ממברנה על פני התא בשפע נמוך. זה מושג על ידי דנטורציה ועיכול ראשונים של חלבוני ממברנה. השלב השני הוא לחמצן את הגליקנים וללכוד את הפפטידים הגליקוזיליים על משטח שרף.

לאחר מכן נשטפים הלא-גליקופפטידים מהשרף. השלב האחרון הוא שחרור הגליקופפטידים המקושרים N מהשרף לניתוח lc MS. בסופו של דבר, ניתן למפות את רצף הפפטידים שזוהה בחזרה לחלבונים למטרות זיהוי וכימות.

היום אני הולך להדגים לכם כיצד פועל ראל לכידת פפטיד Geico. היתרון העיקרי של מנת יתר של טכניקה זו, למעט קיימים, כגון לכידת גליקופרוטאין, הוא שחלבון הממברנה יתעכל תחילה וניתן לבצע את לכידת הגליקופפטיד בכלי אחד. היישום של טכניקה זו יכול להתרחב לגילוי הסמן הביולוגי של המחלה.

מכיוון שחלבון גטור יכול להישפך בדם ובנוזלי גוף אחרים והגליקופרוטאין המסתובב בדם, הספציפיים לתהליך הפתולוגי, יכולים לשמש כפרוגנוזה ואבחון, סמנים ביולוגיים. ראשית, הכינו ארבעה מיליליטר של חיץ היפוטוני עם קוקטייל מעכב פרוטאז אחד עד 100. הוסף מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני על כדור תא המכיל כ-10 עד התאים השמיניים, ודגר את התערובת למשך 15 עד 30 דקות על קרח, העבירו את התאים לבקבוקון של שני מיליליטר וכינים את התאים על ידי העברת הדגימה חמש עד 10 פעמים דרך מחט מזרק.

לאחר מכן השתמש בציטומטר המו ובצביעה כחולה טריאן. כדי לבדוק את יעילות הליזה, שלב את הליזאט של מיליליטר אחד עם שלושה מיליליטר של שאריות מאגר היפוטוני. סובב את הצינור ב -3000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה ואחסנו את הגלולה במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. סובב את צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, ממיסים את השבר המיקרוזומלי ב -200 מיקרוליטר של מאגר דנטורציה, ואז מרתיחים את התמיסה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר קירור התמיסה המחוממת לטמפרטורת החדר, הוסיפו אבקת אוריאה בטוהר גבוה במיוחד כדי לתת ריכוז סופי של שמונה מולארי ודגרו על הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים 500 מילימולר. אני צריך תמיסת מלאי אצטמיד לדגימה כדי לתת ריכוז סופי של 15 מילימולר.

לאחר מכן דגרו את התמיסה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאלקיל את התיולים החופשיים בדגימה. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי DTT מולרית אחת לדגימה כדי לתת ריכוז סופי של 10 מילימולר ודגר את התמיסה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. כדי להרוות את העודף I oto אצטמיד יש לדלל את התמיסה המתקבלת 10 פעמים עם מאגר טריס של 40 מילי-מולרי ב-PH שמונה, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדגימה ביחס של 1 ל-20 של טריפסין לכמות החלבון הכוללת.

השג את כמות החלבון הכוללת באמצעות מבחן ברדפורד. שמרו על תגובת העיכול בתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח שהתגובה תושלם. בסיום, יש להפסיק את העיכול על ידי החמצת תמיסת הדגימה ל-pH 1 עם חומצה הידרוכלורית של 10 מילי-מולרי, מצב שגם מתדרדר במהירות הגבוהה ביותר.

לאחר מכן חומר הניקוי מתכלה במהירות הגבוהה ביותר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת באינקובטור. לאחר הדגירה, הסר את המשקעים המפותחים על ידי צנטריפוגה לאחר צנטריפוגה. נקה את ה-SUP natin המכיל את פפטידי הדגימה על ידי מחסנית מיצוי פאזה מוצקה C 18 וייבש את הדגימה שהתקבלה בוואקום מהיר.

בצע ניתוח דף SDS של דגימות לפני ואחרי טיולים ועיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. בשלב זה, ממיסים את הפפטידים הנקיים ב -200 מיקרוליטר של מאגר צימוד. לאחר הוספת מטהר נתרן לתמיסת הפפטיד כדי לתת ריכוז סופי של 10 מילי-מולארי.

דגירה של הדגימה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר בסיום הדגירה, הרוו את הפראט המוגזם בנתרן גופרתי כדי לתת ריכוז סופי של 20 מילימולר ו-pH של חמישה לאחר הדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הכניסו 200 מיקרוליטר של תמיסת שרף נגזרת הידרוציטים, מאגר מאוזן וצימוד לתמיסת הפפטיד. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עם סיבוב מקצה לקצה לצימוד מלא. בסיום, הסר את הפפטידים הלא קשורים על ידי שטיפת השרף פעמיים במיליליטר אחד של מים נטולי יונים, מיליליטר אחד של 1.5 נתרן כלורי מולרי, מיליליטר אחד של מתנול ומיליליטר אחד של 80% אצטו ניטריל.

לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט ואת השטיפות לניתוח פפטידים לא קשורים. אחסן את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. לאחר מכן שטפו את השרף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט ב-pH שמונה.

לבסוף, הוסף 300 מיקרוליטר אמוניום ביקרבונט לבקבוקון הדגימה. לשחרר את הגליקופפטידים N מהשרף. הוסף PNG ACE F ודגר את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה.

לאחר מכן, אספו את הפפטידים המשוחררים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן שטפו את השרף עם מיליליטר אחד של 80% אצטיל ניטריל. שלב את הכביסה עם מה שנאסף בעבר. לבסוף יבש את התמיסה שהתקבלה במהירות VAC לניתוח lc MS.

ספקטרום גליקופפטיד לא טיפוסי שנלקח לאחר שיטת ההעשרה מוצג כאן בגליקופפטיד המתקבל. ה-n גליקן הוסר והגליקן המחובר לזלזול הומר לחומצה ספרטית על ידי P-N-G-A-F. לכן, ניתן לחפש את הספקטרום בקלות על ידי כל מנוע חיפוש פרוטאומי מול מסדי נתונים נפוצים של רצפי חלבונים.

lc MS לא טיפוסי. התוצאה של n גליקופפטידים שנלכדו מוצגת כאן בה ניתן לזהות יותר מ-100 גליקופרוטאינים מריצת lc MS בודדת של מקטע מיקרוזומלי של תא. סלקטיביות ההעשרה הן לגליקופרוטאינים והן לגליקופפטידים היא בדרך כלל יותר מ-90%ניתוח מוצלח יכול להיות בעל סלקטיביות העשרה של 95% באמצעות עמודת SCX ושיפוע צעד לפיצול נוסף. הדגימות לפני ניתוח LCMS בדרך כלל יכפילו את מספר זיהויי הגליקופרוטאין.

לפעמים כאשר כמות הגליקופפטידים המתקבלים נמוכה, ניתן לראות את הטומאה שהצטברה מהבקבוקונים בדגימה הסופית. ניתן להסיר מזהמים אלה על ידי עמודת MCX. אז אחרי שצפיתם בסרטון הזה, אני מקווה שיש לכם הבנה טובה כיצד להשתמש בשיטות לכידת הגליקופפטידים שלנו כדי לחקור חלבון ממברנה בשירות עצמי.

בזמן שאתה מנסה פרוטוקול זה, חשוב גם להקצות דוגמאות לכל שלב לפתרון בעיות. ניתן לייעל את נפח המגיב גם למחקר הספציפי שלך.