Name: Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למדו שיטת לכידת גליקופפטידים להעשרת חלבוני קרום פני תא נדירים באמצעות חמצון גליקנים וניתוח LC-MS. טכניקה זו מאפשרת זיהוי וכימות חלבונים גליקוזילציה בפרוטאומיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הזנק של אוניברסיטת סיימון פרייזר.

1. ממברנות הקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ hypotonic (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 10 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על תא גלולה (~ 10 8 תאים) ו דגירה של 15-30 דקות על קרח. Lyse התאים על ידי העברת הדגימה באמצעות מחטי מזרק (5-10 עובר) או שמאחד את המדגם על ידי homogenizer Dounce (15-30 שבץ). השתמש hemocytometer וכתמי כחולי trypan כדי לבדוק את היעילות של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שבריר microsomal ידי צנטריפוגה ההפרש של lysate ב3,000 דקות 15 GX ולאחר מכן ב100,000 GX 2 שעות. צנטריפוגה הראשונה משיגה גלולה שהוא שבריר הגרעיני, וצנטריפוגה הבאה של supernatant מייצרת גלולה שנייה, המהווה את חלק microsomal המכיל קרום הפלזמה, כמו גם האברונים קרום הנכנס 8. Supernatant הסופי הוא שבריר cytosolic. אחסן את השברים microsomal במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך analys נוסףהוא כמפורט להלן. </li></ol> 2. ממיסים, לפגל, וחלבונים בממברנה Digest <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את חלקיק microsomal במאגר denaturation (40 מ&quot;מ טריס, 10 mM EDTA, 10 מ&quot;מ TCEP, 0.5% Rapigest, pH 8) ולאחר מכן דגירה הפתרון ב100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את הפתרון המחומם לטמפרטורת חדר, להוסיף אבקת אוריאה גבוהה במיוחד טוהר לפתרון ל8 ריכוז סופי M ודגירה המדגם ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון מניות iodoacetamide למדגם ל15 מ&quot;מ ריכוז סופי, ודגירת הפתרון בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לalkylate thiols בחינם במדגם. הוספת פתרון מניות DTT המדגם לריכוז סופי 10 מ&quot;מ ודגירת הפתרון עוד 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להרוות את iodoacetamide המוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 10x הפתרון שהושג עם 40 חיץ מ&quot;מ טריס ב-pH 8, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדוגמא ביחס 1:20 של trypsin לחלבון בסך הכל. שמור את תגובת מערכת העיכול בלילה בתנור 37 ° C כדי להבטיח התגובה הושלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את מערכת העיכול על ידי acidifying פתרון המדגם ל-pH 1 עם HCl, מצב זה גם מפרק את חומרי הניקוי, כלומר Rapigest. לבזות את Rapigest ב-C ° 37 עבור שעה 1, ולהסיר את המשקעים שפותחו על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את supernatant המכיל פפטידים מדגם על ידי מחסנית C-18 מיצוי שלב מוצק (SPE) ולייבש את הדגימה המתקבלת על ידי speedvac. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח SDS-PAGE של דגימות לפני ואחרי טריפסין עיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. </li></ol> 3. לכידת glycopeptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את פפטידים ניקו בחיץ הצימוד (אצטט 100 מ&quot;מ נתרן, pH 5.5). הוספת periodate נתרן לתוך תמיסת פפטיד בריכוז 10 מ&quot;מ סופי ל30 דקות בחושך, בטמפרטורת חדר. זה יהיה לחמצן קבוצות cis-דיאול בglycans לאלדהידים, המאפשרת glycans לבני זוג השרף דרך הכימיה hydrazide. להרוות את periodate המופרז על ידי סולפיט נתרן בריכוז 20 מ&quot;מ סופי וה-pH 5 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שרף derivatized hydrazide לתוך תמיסת פפטיד ביחס של 1:4 (שרף לפתרון) לזוג glycopeptides לשרף. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עם סיבוב מקצה לקצה עבור צימוד שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פפטידים מאוגדים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 מיליליטר של כל אחד מאלה: המים DI, 1.5 M NaCl, מתנול ואצטוניטריל 80%. לבסוף, לשטוף 3x השרף עם 1 מיליליטר של 100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3 ב-pH 8 להחליף את החיץ של המערכת ל100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant והשוטף לניתוח של פפטידים מאוגדים (אופציונליים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את N-glycopeptides מהשרף על ידי PNGase F בדגירת לילה בשעה 37 ° C עםn מקצה לקצה רוטציה. לאסוף את הפפטידים שפורסמו על ידי צנטריפוגה ולשטוף אצטוניטריל 80%. ייבש את הפתרון שהתקבל בspeedvac לניתוח LC-MS. </li></ol> 4. היפוך חלוק נוסף (אופציונאלי) כדי לפשט את מורכבות מדגם נוסף, fractionate N-glycopeptides מתקבל. לדוגמא, redissolve פפטידים המיובשים לתוך formate האמוניה 10 מ&quot;מ, pH 3 עם אצטוניטריל 20% ולהשתמש בתמורת קטיון חזקה כרומטוגרפיה (SCX) לfractionate פפטידים. ייבש את eluent שהושג, ולאחר מכן לנתח את שברי פפטיד מתקבלים על ידי הפוך השלב LC-MS 8,17,18. 5. ניקוי של N-glycopeptides פורסם (אופציונלית) אם חששות לעלות לזיהום הפוטנציאלי של פפטידים, redissolve פפטידים המיובשים לתוך 0.1% חומצה פורמית ולהשתמש בעמודת MCX SPE לנקות עוד יותר את פפטידים לפני ניתוח LC-MS להפוך שלב. <strong&gt; הערה: פרמטרים חיפוש מסד נתונים. במהלך המחשוף סלקטיבית של N-glycopeptides את השרף, PNGase F ממיר asparagine מקושר N-סוכרים לחומצה אספרטית. לכן, יש שינוי מסת דה 0.9840 של N-glycopeptides המשוחרר. כדי לזהות במדויק את הפפטידים האלה, שינוי זה צריך להוסיף לפרמטרי החיפוש יחד עם שינויים נפוצים כגון carbamidomethylation של ציסטאין והחמצון של מתיונין.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו מציגים אסטרטגית glycopeptide ללכוד לאפיון חלבונים על פני קרום תא. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד חלבונים מופרשים, כגון אלה בדם, כמו גם בנוזלי גוף אחרים או בתקשורת תרבות תא. ההצלחה של השיטה מסתמכת על העיכול של דגימות המלאה; לכן, אפיון SDS-PAGE של יעילות העיכול הוא הכרחי, במיוחד עבור הניתוח של מדגם בפעם הראשונה. עיכול שלם יכול להיות מאתגר עבור חלבונים בממברנה, והוא יכול להיות אפשרי רק לאחר solubilizat...

חלבונים בתא שטח באינטראקציה עם הסביבה תאית ולהעביר אותות מבחוץ לחלק הפנימי של תא. לפיכך, חלבונים אלה, כוללים חלבוני מטריצת חוץ תאיים, ממלאים תפקידים קריטיים בכל ההיבטים של ביולוגיה ופיזיולוגיה, החל שגשוג, צמיחה, הגירה, בידול להזדקנות וכן הלאה סלולריות. חלבוני פני השטח לתפקד על ידי אינטראקציה עם תאים אחרים, חלבונים ומולקולות קטנות 1-3. אפיון מולקולרי של חלבונים על פני קרום התא הוא עניין רב לא רק לביולוגים, אלא גם לחברות תרופות, שכן יותר מ -60% מתרופות ממוקדים לחלבונים על פני קרום תא 4. ספקטרומטריית טנדם מסה (MS), עם הרגישות שלה מעולה, דיוק, ותפוקה לזיהוי של חלבונים ופפטידים, כבר כלי רב עוצמה למחקרים proteomic הגלובליים 5,6. עם זאת, חלבוני פני השטח להוות אתגר משמעותי לפרוטאומיקה מבוססת MS, כפירוב חלבוני פני השטח קיימים בכמויות נמוכות ועם שינויים כבדים. האזורים פורש הקרום של חלבוני פני השטח לעבד אותם הידרופובי; זה נכון במיוחד במקרה של חלבונים הטרנסממברני multipass. זה קשה ובכך לפזר חלבוני קרום בתמיסות מימיות ללא העזרה של חומרי ניקוי; עם זאת השימוש בחומרי הניקוי, בדרך כלל מדכא את הביצועים של HPLC ו-MS 1,7,8 בזיהוי חלבון. לכן, חלבוני קרום היו מאופיינים בצורה גרועה בפרוטאומיקה מבוססת LC-MS הישירה. Glycosylation הוא אחד לאחר translational השינויים החשובים והנפוצים ביותר המתרחשים בחלבונים על פני קרום תא 9. מורכבות ואת ההטרוגניות עצומות של glycans לעכב MS אות &#39;פפטידים 10. עם זאת, במספר שיטות proteomic השתמשו השינוי הזה ייחודי להעשרת חלבוני פני השטח ולהסיר את moieties הסוכר מחלבונים לפני ניתוח LC-MS. שיטה אלהים כולל לכידה מבוססת קטיני זיקת 11 ולכידה כימית המבוסס על חומצה בורית או מבוסס hydrazide 12 כמו גם פרידות כרומטוגרפיה הידרופילי 8,13. הסרת glycans הופכת חלבונים בממברנה לחלבונים רגילים ומפשטת באופן דרסטי את אפיון הטרשת הנפוצה. בגלל glycosylation גם מתרחש בחלבונים מופרשים שיש מסיסות גבוהה בניגוד לחלבוני קרום, שיטות רבות glycoproteomic מותאמות לחלבונים מסיסים, ונוטות להיות סלקטיביות glycopeptide נמוכה ורגישות כשנפרס קרום חלבונים 8,14. שיטות אחרות קיימות גם להעשיר, בפרט, חלבונים על פני קרום תא, כגון אלה באמצעות ultracentrifugation 15 ואסטרטגיות תיוג 16. השוואה מפורטת בין השיטה שלנו ושיטות קיימות אחרות לאפיון חלבוני קרום נערכה לאחרונה 17, והתוצאות הצביעו על כך שהשיטה שלנו יכולה לבצע באותה מידה, אם לא, אבל עם יותר טובים, יותר מכל שיטות פרוטאומיקה הקרום לעומת פשטות גבוהה יותר. כדי לסייע לחוקרים להשתמש בשיטה זו, אנו נפרט כאן פרוטוקול כללי. שיטה זו משלבת מספר יתרונות של אסטרטגיות glycoproteomics קיימות והוא המציא במיוחד עבור גליקופרוטאינים קרום, אך השיטה עובדת פחות טובה לחלבונים מופרשים. המאפיינים של שיטה זו כוללים: 1) solubilization של חלבונים בממברנה מלא, 2) העשרת glycopeptides במקום גליקופרוטאינים לחסל את הפרעה סטרית הפוטנציאלית בעת שימוש במצע הלכידה מוצק, 3) השימוש בכימית hydrazide ליצירת קשרים קוולנטיים בין glycopeptides ומצע לכידה, כך שglycopeptides מלוכד יכול לסבול שוטף מחמיר לגבוה glycoselectivity, ו -4) את היכולת לנהל את ההליך כולו ללכוד בצינור אחד לאובדן מדגם מופחת ומשך הליך מקוצר. לאחר יישום שיטה זו ללימוד ואריאתי של דגימות ביולוגיות כוללים תאים ורקמות, ראה סלקטיביות גבוהה (&gt; 90%) לגליקופרוטאינים 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest</td><td>SF Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פריודאט</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz הידרזיד ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>וורת'ינגטון ביו-רפואי</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 מחסנית</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX מחסנית</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td>, <td>סיגמא</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>אמרסקו</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סולפיט</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>Invertase</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 trypsin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonulease B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumin</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

חלבונים פני תא, כוללים חלבונים תאיים מטריקס, משתתפים בכל התהליכים העיקריים הסלולריים ופונקציות, כגון צמיחה, בידול, ושגשוגם. אפיון מקיף של חלבונים אלו מספק מידע עשיר לגילוי סמן ביולוגי, זיהוי סוג התא, ובחירת תרופות יעד, כמו גם לעזור לקדם את ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה סלולריות שלנו. חלבוני פני השטח, לעומת זאת, מציבים אתגרים משמעותיים אנליטיים, בגלל השפע שלהם מטבע הנמוך, גבוהה הידרופוביות, ולאחר translational שינויים כבדים. ניצול של glycosylation הנפוץ בחלבוני פני השטח, אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד תפוקה גבוהה, המשלבת את היתרונות של כמה אמצעי N-glycoproteomics קיימים. השיטה שלנו יכולה להעשיר glycopeptides נגזר מחלבונים פני השטח ולהסיר glycans לפרוטאומיקה הקלילה באמצעות LC-MS. N-glycoproteome נפתר כולל information זהות חלבון וכמות כמו גם באתריהם של glycosylation. שיטה זו יושמה לסדרה של מחקרים בתחומים שונים, לרבות סרטן, תאי גזע, ורעילויות תרופה. המגבלה של השיטה טמונה בשפע הנמוך של חלבוני קרום פני השטח, כך שכמות גדולה יחסית של דגימות הנדרשות לניתוח זה בהשוואה למחקרים התמקדו בחלבוני cytosolic.

תרשים זרימת נציג של הליך הניסוי מסוכם באיור 1. התיוג וצעדי חלוקה נוספים הם אופציונליים ופרטים מתוארים בפרסום האחרון 18. אפשרות נוספת היא לנתח את פפטידים ללא שינוי, שאינו מגיבים עם השרף. היתרונות של ניתוח פפטידים ללא שינוי כוללים את זיהוי הפוטנציאל של פפטידים שאינם מסוכרים וחלבונים, כגון claudins בצומת הדוקים; יתרון נוסף הוא כימות מדויק יותר. בהתבסס על יתרונות אלה, אנו כינה זו גרם שיטת lycocapture-roteomics q lobal ssisted-g uantitat...

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעשיר חלבוני ממברנה של פני השטח של התא בעלי שכיחות נמוכה. דבר זה מושג תחילה על ידי דנטורציה ועיכול של חלבוני הממברנה. השלב השני הוא חמצון הגליקנים ולכידת הפפטידים הגליקוזילתיים על פני שרף.לאחר מכן שוטפים את הגיליקופפטידים שאינם קשורי גליקן מהשרף. השלב הסופי הוא שחרור ה-N-Linked Glycopeptides מהשרף לצורך אנליזת lc MS. לבסוף, ניתן למפות את רצף הפפטידים שזוהו בחזרה לחלבונים לצורכי זיהוי וכימות.היום אדגים לכם כיצד עובד תהליך לכידת הפפטידים של Geico. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון לכידת גליקופרוטאינים, הוא שחלבון הממברנה יעבור תחילה עיכול, ולכידת הגליקופפטיד תוכל להתבצע בכלי אחד. יישום של טכניקה זו עשוי להתרחב לגילוי של סממנים ביולוגיים למחלה.מכיוון שחלבון gator עשוי להיות מופרש לדם ולנוזלי גוף אחרים, וגליקופרוטאין במחזור הדם, שהם ספציפיים לתהליך הפתולוגי, יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים (Biomarkers) לפרוגנוזה ולאבחון. ראשית, הכינו ארבעה מיליליטר של בופר היפוטוני עם תערובת מעכבי פרוטאז ביחס של 1:100. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר היפוטוני למשקע תאים המכיל כ-10⁸ תאים, והדגרימו את התערובת למשך 15 עד 30 דקות על קרח. העבירו את התאים למבחנה של שני מיליליטר והליסו את התאים על ידי העברת הדגימה חמש עד 10 פעמים דרך מחט של מזרק.לאחר מכן השתמשו ב-hemo cytometer ובצביעה ב-trian blue. כדי לבדוק את יעילות הליסיס, ערבבו את 1 mL של הליזט עם 3 mL של תמיסת hypotonic buffer שנותרה. סבבו את המבחנה ב-3000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות.העבירו את העילוי למבחנה לאולטרסנטריפוגה ואחסנו את המשקע במקפיא של 80- מעלות צלזיוס. סובבו את מבחנת האולטרסנטריפוגה ב-100,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, המסו את הפרקציה המיקרוסומלית ב-200 µL של באפר דנטורציה, והרתיחו את התמיסה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר קירור התמיסה המחוממת לטמפרטורת החדר, הוסיפו אבקת urea בדרגת טיהור גבוהה מאוד (ultra high purity) כדי להגיע לריכוז סופי של 8M, והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו לדגימה תמיסת stock של iodoacetamide בריכוז 500 mM כדי להגיע לריכוז סופי של 15 mM.לאחר מכן, דגרו את התמיסה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע אלקילציה של התיאולים החופשיים בדגימה. בעקבות זאת, הוסיפו לדגימה תמיססת סטוק של DTT בריכוז מולרי אחד, כדי להגיע לריכוז סופי של 10 millimolar, ודגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את פעילות ה-Iodoacetamide העודף, דללו את התמיסה שהתקבלה פי 10 עם באפר tris בריכוז 40 millimolar ב-pH 8, ולאחר מכן הוסיפו לדגימה trypsin ביחס של 1:20 של trypsin לכמות החלבון הכוללת.מדוד את כמות החלבון הכולל באמצעות בדיקת Bradford. שמור את תגובת העיכול בתנור בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה כדי להבטיח השלמת התגובה. עם סיום התהליך, הפסק את העיכול על ידי החמשת תמיסת הדגימה ל-pH 1 באמצעות חומצה כלורית 10 mM, תנאי הגורם גם לפירוק ה-rapidest.לאחר מכן, השארו את הדטרגנט להתפרק במהירות המרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת באינקובטור. לאחר האינקובציה, הסירו את המשקע שנוצר באמצעות צנטריפוגה. נקו את ה-SUP natin המכיל את פפטידי הדגימה באמצעות מחסירת ספיחה פאזה מוצקה של C 18, וייבשו את הדגימה שהתקבלה באמצעות SpeedVac.בצעו אנליזת SDS-PAGE של הדגימות לפני ואחרי השטיפות והעיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. בשלב זה, המסו את הפפטידים המנוקים ב-200 µL של תמיסת חיבור (coupling buffer). לאחר מכן, הוסיפו נתרן פוריאת לתמיסת הפפטידים עד להשגת ריכוז סופי של 10 mM.דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. עם סיום הדגירה, השביתו את ה-prate העודף באמצעות סודיום סולפיט כדי להגיע לריכוז סופי של 20 millimolar ו-pH של 5. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרת החדר, הוסיפו לתמיסת הפפטיד 200 microliters של תמיסת שרף נגזרת הידרוסייט, שעברה שיווי משקל מוקדם, ובופר צימוד. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יום עד יומיים תוך כדי סיבוב מקצה לקצה להשגת צימוד מלא. בסיום, הסירו את הפפטידים שאינם קשורים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 milliliter של מים דה-יוניים, 1 milliliter של sodium chloride בריכוז 1.5 molar, 1 milliliter של methanol ו-1 milliliter של 80% acetonitrile.בשלב הבא, אספו את העלייה (supernatant) ואת תמיסות השטיפה לצורך ניתוח של פפטידים שאינם קשורים. אחסנו את הדגימות במקפיא של 80°C- עד לביצוע הניתוח. לאחר מכן, שטפו את הסורבן שלוש פעמים עם 1 mL של 100 mM ammonium bicarbonate ב-pH 8.לבסוף, הוסיפו 300 microliters של ammonium bicarbonate למבחנה עם הדגימה. כדי לשחרר את ה-N glycopeptides מהשרף, הוסיפו PNG ACE F והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך סיבוב מקצה לקצה.לאחר מכן, אספו את הפפטידים ששוחררו באמצעות סנטריפוגה, ולאחר מכן שטפו את השרף עם 1 mL של 80% אצטוניטריל. חברו את תמיסת השטיפה לתמיסות שנאספו קודם לכן. לבסוף, ייבשו את התמיסה שהתקבלה ב-speed VAC לצורך אנליזת lc MS.כאן מוצג ספקטרום גליקופפטידי אטיפי שנלקח לאחר שיטת ההעשרה בגליקופפטיד שהתקבל. הגליקן n הוסר, והגליקן המחובר הומר לחומצה אספרטית על ידי P-N-G-A-F. לפיכך, ניתן לחפש את הספקטרום בקלות באמצעות כל מנוע חיפוש פרוטאומי מול מאגרי נתונים נפוצים של רצפי חלבונים.תוצאות LC-MS לא טיפוסיות. מוצגות כאן תוצאות של n-glycopeptides של Capture, שבהן ניתן לזהות יותר מ-100 glycoproteins מריצה אחת של LC-MS של פракציית מיקרוסומות מתאים. הסלקטיביות של ההעשרה הן עבור glycoproteins והן עבור glycopeptides היא בדרך כלל מעל 90%. ניתוח מוצלח יכול להגיע לסלקטיביות העשרה של 95% באמצעות עמודת SCX ומדרג שלבים (step gradient) לשיוך פракציות נוסף. הדגימות לפני ניתוח LC-MS יכפילו בדרך כלל את מספר הזיהויים של glycoproteins.לעיתים, כאשר כמות הגליקופפטידים שהתקבלו נמוכה, ניתן להבחין בדגימה הסופית בזיהומים שהצטברו מהמבחנות. ניתן להסיר זיהומים אלו באמצעות עמודת MCX. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שקיבלתם הבנה טובה על אופן השימוש בשיטות ללכידת גליקופפטידים לצורך חקר חלבוני ממברנה.בזמן ביצוע פרוטוקול זה, חשוב להפריש דגימות מכל שלב לצורך פתרון בעיות. ניתן גם למטב את נפח הריאגנט בהתאם למחקר הספציפי שלך.

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הועסקו על HPLC. סטנדרטים Glycopeptide שימש שולטת חיוביים ושליליים. מאדים 14 מדולדל, טריפסין-מתעכל פלזמה האדם היה chromatographed ו flow-through (FT) וכן שברים מחויב שנאספו עבור ניתוחים ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides היו מועשר בשבריר מחויב לעומת FT.

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

השליח השני c-di-GMP הנפוץ בכל מקום שולט בגדילה ובהתנהגות של חיידקים רבים. פיתחנו טכנולוגיה חדשה המבוססת על ספקטרומטריית מסה של תרכובת לכידה לזיהוי ואפיון ביוכימי של חלבונים קושרים c-di-GMP כמעט בכל מין חיידקים.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

שינויים לאחר התרגום (PTMs) משנים את המבנים והתפקודים של חלבונים. שיטות להעשרה בו-זמנית של סוגי PTM מרובים יכולות למקסם את הכיסוי בניתוחים. אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת Ti(IV) דו-תפקודית ואחריה ספקטרומטריית מסה להעשרת וניתוח בו זמנית של חלבון N-גליקוזילציה וזרחון ברקמות הלבלב.

אסטרטגיית העשרת ספין-טיפ לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מרקמות הלבלב האנושיות

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

למדו שיטת לכידת גליקופפטידים להעשרת חלבוני קרום פני תא נדירים באמצעות חמצון גליקנים וניתוח LC-MS. טכניקה זו מאפשרת זיהוי וכימות חלבונים גליקוזילציה בפרוטאומיקה.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

גלה סרטונים נוספים