Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

המטרה הכללית של הליך זה היא להעשיר חלבוני ממברנה של פני השטח של התא בעלי שכיחות נמוכה. דבר זה מושג תחילה על ידי דנטורציה ועיכול של חלבוני הממברנה. השלב השני הוא חמצון הגליקנים ולכידת הפפטידים הגליקוזילתיים על פני שרף.

לאחר מכן שוטפים את הגיליקופפטידים שאינם קשורי גליקן מהשרף. השלב הסופי הוא שחרור ה-N-Linked Glycopeptides מהשרף לצורך אנליזת lc MS. לבסוף, ניתן למפות את רצף הפפטידים שזוהו בחזרה לחלבונים לצורכי זיהוי וכימות.

היום אדגים לכם כיצד עובד תהליך לכידת הפפטידים של Geico. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון לכידת גליקופרוטאינים, הוא שחלבון הממברנה יעבור תחילה עיכול, ולכידת הגליקופפטיד תוכל להתבצע בכלי אחד. יישום של טכניקה זו עשוי להתרחב לגילוי של סממנים ביולוגיים למחלה.

מכיוון שחלבון gator עשוי להיות מופרש לדם ולנוזלי גוף אחרים, וגליקופרוטאין במחזור הדם, שהם ספציפיים לתהליך הפתולוגי, יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים (Biomarkers) לפרוגנוזה ולאבחון. ראשית, הכינו ארבעה מיליליטר של בופר היפוטוני עם תערובת מעכבי פרוטאז ביחס של 1:100. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר היפוטוני למשקע תאים המכיל כ-10⁸ תאים, והדגרימו את התערובת למשך 15 עד 30 דקות על קרח. העבירו את התאים למבחנה של שני מיליליטר והליסו את התאים על ידי העברת הדגימה חמש עד 10 פעמים דרך מחט של מזרק.

לאחר מכן השתמשו ב-hemo cytometer ובצביעה ב-trian blue. כדי לבדוק את יעילות הליסיס, ערבבו את 1 mL של הליזט עם 3 mL של תמיסת hypotonic buffer שנותרה. סבבו את המבחנה ב-3000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות.

העבירו את העילוי למבחנה לאולטרסנטריפוגה ואחסנו את המשקע במקפיא של 80- מעלות צלזיוס. סובבו את מבחנת האולטרסנטריפוגה ב-100,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, המסו את הפרקציה המיקרוסומלית ב-200 µL של באפר דנטורציה, והרתיחו את התמיסה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר קירור התמיסה המחוממת לטמפרטורת החדר, הוסיפו אבקת urea בדרגת טיהור גבוהה מאוד (ultra high purity) כדי להגיע לריכוז סופי של 8M, והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו לדגימה תמיסת stock של iodoacetamide בריכוז 500 mM כדי להגיע לריכוז סופי של 15 mM.

לאחר מכן, דגרו את התמיסה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע אלקילציה של התיאולים החופשיים בדגימה. בעקבות זאת, הוסיפו לדגימה תמיססת סטוק של DTT בריכוז מולרי אחד, כדי להגיע לריכוז סופי של 10 millimolar, ודגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את פעילות ה-Iodoacetamide העודף, דללו את התמיסה שהתקבלה פי 10 עם באפר tris בריכוז 40 millimolar ב-pH 8, ולאחר מכן הוסיפו לדגימה trypsin ביחס של 1:20 של trypsin לכמות החלבון הכוללת.

מדוד את כמות החלבון הכולל באמצעות בדיקת Bradford. שמור את תגובת העיכול בתנור בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה כדי להבטיח השלמת התגובה. עם סיום התהליך, הפסק את העיכול על ידי החמשת תמיסת הדגימה ל-pH 1 באמצעות חומצה כלורית 10 mM, תנאי הגורם גם לפירוק ה-rapidest.

לאחר מכן, השארו את הדטרגנט להתפרק במהירות המרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת באינקובטור. לאחר האינקובציה, הסירו את המשקע שנוצר באמצעות צנטריפוגה. נקו את ה-SUP natin המכיל את פפטידי הדגימה באמצעות מחסירת ספיחה פאזה מוצקה של C 18, וייבשו את הדגימה שהתקבלה באמצעות SpeedVac.

בצעו אנליזת SDS-PAGE של הדגימות לפני ואחרי השטיפות והעיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. בשלב זה, המסו את הפפטידים המנוקים ב-200 µL של תמיסת חיבור (coupling buffer). לאחר מכן, הוסיפו נתרן פוריאת לתמיסת הפפטידים עד להשגת ריכוז סופי של 10 mM.

דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. עם סיום הדגירה, השביתו את ה-prate העודף באמצעות סודיום סולפיט כדי להגיע לריכוז סופי של 20 millimolar ו-pH של 5. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרת החדר, הוסיפו לתמיסת הפפטיד 200 microliters של תמיסת שרף נגזרת הידרוסייט, שעברה שיווי משקל מוקדם, ובופר צימוד. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יום עד יומיים תוך כדי סיבוב מקצה לקצה להשגת צימוד מלא. בסיום, הסירו את הפפטידים שאינם קשורים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 milliliter של מים דה-יוניים, 1 milliliter של sodium chloride בריכוז 1.5 molar, 1 milliliter של methanol ו-1 milliliter של 80% acetonitrile.

בשלב הבא, אספו את העלייה (supernatant) ואת תמיסות השטיפה לצורך ניתוח של פפטידים שאינם קשורים. אחסנו את הדגימות במקפיא של 80°C- עד לביצוע הניתוח. לאחר מכן, שטפו את הסורבן שלוש פעמים עם 1 mL של 100 mM ammonium bicarbonate ב-pH 8.

לבסוף, הוסיפו 300 microliters של ammonium bicarbonate למבחנה עם הדגימה. כדי לשחרר את ה-N glycopeptides מהשרף, הוסיפו PNG ACE F והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך סיבוב מקצה לקצה.

לאחר מכן, אספו את הפפטידים ששוחררו באמצעות סנטריפוגה, ולאחר מכן שטפו את השרף עם 1 mL של 80% אצטוניטריל. חברו את תמיסת השטיפה לתמיסות שנאספו קודם לכן. לבסוף, ייבשו את התמיסה שהתקבלה ב-speed VAC לצורך אנליזת lc MS.

כאן מוצג ספקטרום גליקופפטידי אטיפי שנלקח לאחר שיטת ההעשרה בגליקופפטיד שהתקבל. הגליקן n הוסר, והגליקן המחובר הומר לחומצה אספרטית על ידי P-N-G-A-F. לפיכך, ניתן לחפש את הספקטרום בקלות באמצעות כל מנוע חיפוש פרוטאומי מול מאגרי נתונים נפוצים של רצפי חלבונים.

תוצאות LC-MS לא טיפוסיות. מוצגות כאן תוצאות של n-glycopeptides של Capture, שבהן ניתן לזהות יותר מ-100 glycoproteins מריצה אחת של LC-MS של פракציית מיקרוסומות מתאים. הסלקטיביות של ההעשרה הן עבור glycoproteins והן עבור glycopeptides היא בדרך כלל מעל 90%. ניתוח מוצלח יכול להגיע לסלקטיביות העשרה של 95% באמצעות עמודת SCX ומדרג שלבים (step gradient) לשיוך פракציות נוסף. הדגימות לפני ניתוח LC-MS יכפילו בדרך כלל את מספר הזיהויים של glycoproteins.

לעיתים, כאשר כמות הגליקופפטידים שהתקבלו נמוכה, ניתן להבחין בדגימה הסופית בזיהומים שהצטברו מהמבחנות. ניתן להסיר זיהומים אלו באמצעות עמודת MCX. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שקיבלתם הבנה טובה על אופן השימוש בשיטות ללכידת גליקופפטידים לצורך חקר חלבוני ממברנה.

בזמן ביצוע פרוטוקול זה, חשוב להפריש דגימות מכל שלב לצורך פתרון בעיות. ניתן גם למטב את נפח הריאגנט בהתאם למחקר הספציפי שלך.