הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית לאחר פגיעה איסכמית. זה מושג תחילה על ידי שימוש במודל עכבר של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן. לאחר מכן, תרכובות מועברות לעין על ידי זריקות תוך זגוגיות.

לאחר מכן, זלוף כלי הדם ותפקוד המחסום מאומתים על ידי אנגיוגרפיה פלואורסצאין. השלב האחרון הוא חילוץ העין ובידוד הרשתית. לאחר מכן הרשתית מוכתמת ומורכבת לפני ההדמיה.

בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת להערכת שיעורי התחדשות כלי הדם לאחר טיפולים תוך-זגוגיים או בעכברים עם שינויים גנטיים. הטכניקה שאנו מציגים מספקת מערכת קלה לשחזור וניתנת לשחזור להערכת התחדשות כלי הדם במערכת העצבים המרכזית. הוא מבוסס על מודל סמית של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן ויכול להיות מועיל למדי בתכנון אסטרטגיות טיפוליות לתיקון איסכמיה במערכת העצבים המרכזית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המנגנונים המולקולריים המניעים או מונעים התחדשות תפקודית של כלי דם. במערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של גנים, תרכובות פרמקולוגיות או מנגנונים פתולוגיים מבהירים המתחילים צמיחה של כלי דם.

בנוסף למחלות עיניים, ניתן להוציא טכניקה זו לאזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון המוח וחוט השדרה נדרש תרגול כדי להזריק בהצלחה תרכובות להומור הזגוגי של עכברים ולטפל בזהירות במוכנות טרייה. כדי להתחיל, הכניסו גורי עכברים ב-P 7 ו-CD אם אומנת אחת לתא חמצן המוגדר ב-75% חמצן חמישה ימים לאחר מכן, הוציאו את החיות מהתא והחזירו אותן לתנאי דיור רגילים. לאחר מכן, ב-P 12 או P 14, מבוצעות הזרקות תוך זגוגיות כדי להעביר תרכובות לרשתית הפנימית.

לאחר הרדמת עכברים, יש לוודא את יעילות ההרדמה על ידי צביטה רציפה של הזנב, כף הרגל האחורית והאוזן בעזרת מלקחיים. יש להכין מבעוד מועד מחט זכוכית משוכה משופעת המחוברת למזרק של 10 מיקרוליטר עם טיפת שרף אפוקסי. אתר את מקום ההזרקה בלימבוס האחורי של העין.

הכנס את המחט בזווית של 45 מעלות והזריק את תרכובת העניין. לאחר מריחת משחה על העין, החזירו את העכבר לכלוב עם אם אומנת כדי להתחיל לצנטריפוגה את תמיסת דקסטר הפלואורסצאין ולאסוף את הסופרנט כדי למנוע התכווצות כלי הדם. מחממים את תמיסת דקסטרין הפלואורסצאין לפני ההזרקה.

לאחר מכן, אשר את עומק ההרגעה בעכבר המרדים. כשהוא מוכן, בצע חתך בקו האמצע מעל הבטן בעזרת מספריים לניתוח. לאחר פתיחת כלוב הצלעות והוצאת רקמה היקפית מהלב, מהדקים את אבי העורקים היורד.

הכנס מחט 25 מד מלאה בדקסטרין פלואורסצאין מחומם לחדר השמאלי והחדיר את התמיסה. תוך שתי דקות מההזרקה, ערפו את ראשו של בעל החיים והניחו את הראש על צדו. הסר את העור והעפעפיים המכסים את העין במספריים לניתוח.

לאחר מכן, הניחו מלקחיים מעוקלים מתחת לעין ומשכו אותם בעדינות כלפי מעלה עד לניתוק עצב הראייה. סובב את ראש העכבר לצד השני וחזור על שלבים אלה. כדי להבטיח חדירה טובה יותר של קיבוע, נקב חור בחדר הקדמי של העין.

בעזרת מחט בקוטר 30, העבירו את העיניים לשפופרת המכילה 4% פרפורם, אלדהיד, וקבעו למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, הסר את ה-PFA ושטוף את העיניים ארבע פעמים עם PBS קר כקרח. הניחו את העיניים בצלחת פטרי המכילה PBS קר ומקמו אותן מתחת למיקרוסקופ סטריאו.

לאחר המקום, הסר את כל הרקמה הנוספת המקיפה את העין בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה וחתוך את הקרנית. השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לקלף את הסקלרה הרחק מהפריפריה לכיוון עצב הראייה. צבטו את העדשה בעזרת מלקחיים וחלצו אותה מכוס העין.

השתמש בזוג מלקחיים אחד כתמיכה ובשני כדי לאחוז ולהרים ולהסיר בזהירות את העדשה. נתק את כלי האלויד מהצד הפנימי של הרשתית באמצעות מברשת קטנה ומלקחיים. לאחר מכן, הסר צרורות של כלי דם היאלואידים המחוברים לדיסק האופטי באמצעות מלקחיים.

העבירו את הרשתית המנותחת לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל PBS והניחו על קרח. לפני תחילת הליך הצביעה, הרשתית המנותחת מודגרת תחילה למשך הלילה עם ניעור עדין בארבע מעלות צלזיוס. בתמיסה, iso selectin B four בצימוד פלואורסצנטי המכיל סידן כלורי במהלך כל הליך הצביעה, יש לכסות את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור למחרת.

הסר את תמיסת הצביעה ושטוף את הרשתית שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את צד קולטני האור של הרשתית כלפי מטה למיקרוסקופ. החלק תוך כדי חיזוק הרשתית בעזרת מברשת.

בצע ארבעה חתכים רדיאליים עמוקים במרחקים שווים. בעזרת אזמל כירורגי, יש לשטח בזהירות את הרבעים ולטבול את הרשתית במדיום הרכבה להלבנת צילום הנח בזהירות החלקת כיסוי על פני הרשתית המותקנת מבלי להפעיל לחץ ולהימנע מבועות אוויר. לבסוף, השקופיות מצולמות ומכומתות.

עבור מחיקת כלי הדם, נצפתה עלייה תלוית מינון בהתחדשות כלי הדם לאחר הזרקת Trin one ב-P 14 וצמיחה מחודשת. הוערך בכלי P 17 עם תפקוד מחסום פגוע פלואורסצנטי דליפה לאחר שפע עם דקסטרין פלואורסצנטי לאחר הזרקה תוך זגוגית של lentivirus. ב-P שלוש, העיכוב של IRE אחד אלפא שיפר באופן דרמטי את התחדשות כלי הדם בשלב צמיחת כלי הדם ב-P 17.

לאחר שליטה בטכניקות אלה, הזרקה תוך זגוגית, זלוף לב ושאיבת רשתית אמורים להימשך כ-10 דקות כל אחד אם הם מבוצעים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמר את המבנה התלת-ממדי של העין, להימנע מלחץ מוגזם שעלול לפגוע ברשתית ולפגוע בתוצאות. אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים, וירוסים או תרכובות ביו-אקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש להשתמש תמיד באמצעי זהירות ובכלים מעוקרים בעת ביצוע הליך זה.