Name: הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: למדו שיטה לבידוד וגידול תאי קדם מיוגניים מדגי Teleosts לחקר מיוגנזה בתרבית. הפרוטוקול כולל ניתוח שריר אפקסלי, פירוק מכני ואנזימטי, ושתילה על סובסטרט למינין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להאריך הרבה תודות לבני זוג. פפ Planas וחואן קסטיו למומחיותם המקצועית בפיתוח והיישום של פרוטוקול תרבות זו לדגים קטנים ודו חיים. תודה גם לאינספור אנשים שיש להם ללא לאות בסיוע עם הנתיחה והניתוק של רקמת שריר מדגים רבים (שניהם במין ומספר), ובם מתיו טעינה, Delci כריסטנסן, זכריה פאולר, ברוק פרנזן, נתן Froehlich, קירה מרשל, בן מאיר, איתן Remily, וSinibaldo רומרו. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מחלקת כספים הזנק ביולוגיה, המרכז לפרוטאז NIH מענק המחקר # 2P20 RR015566, NIH NIAMS גרנט # R03AR055350, וNDSU Advance קדימה NSF גרנט # HRD-0,811,239 לPRB. תמיכה הייתה גם מסופקת על ידי P30DK056336 # הפרס UAB התזונה השמנת יתר מרכז המחקר, NIH NIDDK. תכניו הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם בהכרחמייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

אין מה לחשוף.

תכנית myogenic, במבין מינים שנבדקו, ניתן ללמוד אותם בקלות באמצעות מערכת במבחנה. ואכן, על בידוד, תאים מבשר myogenic (MPCs) בדגים או תאי myosatellite (MSCs) ביונקים בקלות להיכנס לתהליך המוסדר הזה מאוד מעורב ההתפשטות, נסיגת מחזור התא, ובידול מסוף של myoblasts וההיתוך של myoblasts אלה לmyotubes המתהווה. המחסור הכללי של זנים מהונדסים גנטי כתב של מיני piscine (עם החריגה האפשרית של דג הזברה 67 ופורל קשת 69) מגביל בעבודת vivo של הפעלת MPC / MSC, שגש...

הבנה ניכרת של myogenesis יונקים הושגה באמצעות המחזר של תהליך זה בשתי תרבויות וההיצמדות למנגנון עכבר עיקרי (מאסכאלאס) ושורת תאי שמקורם בעכבר היטב תאר, C2C12 5. החל משנת 1950s 6, תרבויות אלה הביאו להתקדמות רבה בהבנה של תכנית murinemyogenic, ובהרחבה, myogenesis בחוליות אחרות. בנוסף, טכניקות myofiber explant תא בודד הגבירו את ההבנה של יחסי גומלין בין תאי לווין וmyofibers סביב 7-9. בתרביות תאים הן אטרקטיביות במיוחד לחקירות של myogenesis בשל הזמן הקצר ממבשרת לתא מובחן 10, קלות היחסית של transfection לRNAi 14,17,18 התרחבות 11-14, 15,16 וביטוי יתר מהונדס לימודים, במבחנה ואחרי השתלת in vivo 18-20, ואפילו compאריסון לתאי myogenic מבשר וסוכני הוויסות שלהם על פני מיני 21,22. בעוד הבדלים בשל הסביבה המלאכותית של מערכת התרבות תוארו 5,23, במבחנה מערכות אלה הוכיחו להיות הכרחיים לנתיחה של התכנית המורכבת המסדירה את הקמתה של multinucleated, myofibersfrom הבדיל סופני mononucleated תאי שגשוג המכונים myosatellite תאים (MSCs) בקרב היונקים. מחוץ לכיתת היונקים, לעומת זאת, השימור ו / או הסטייה של מנגנוני השליטה myogenesis הם הבינו היטב, במידה רבה בשל הקושי בתאי culturing myogenic מבשר (MPCs) וmyoblasts ממינים שונים. אכן, תרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות שרק תוארו בשלוש ציפורים 24-26, זוחל אחד 27, כמה דו חיים 28-30, וכמה דגים 1,3,4,31-33. שורות תאי myogenic רציפים מvertebrates האחר מאשר המכרסמים 34-36 הם אפילו יותר נדירים, עם הקו רק שאינו יונקים myogenic התא שנגזר משליו יפני (japonica Cortunix), QM7 37. למרות ניסיונות רבים בהנצחה, שורת תאי myogenic חוליות נותרת חמקמקה ופרוטוקול עבור transfection יעיל של תאים אלה יצא לאור השנה 15 בלבד. לפיכך, פרוטוקולים ברורים ומותאמים היטב לculturing MPCs וmyoblasts עיקריים ממגוון רחב של בעלי חוליות יש צורך מאוד לא רק להרחיב עוד יותר את הידע של האבולוציה של תכנית myogenic שלנו, אבל כדי להעסיק את כוחה של פיזיולוגיה השוואתית לבצע פריצות דרך ב לטיפול במחלות אנושיות שלד שרירים והפרעות. בעוד שהספרות מכילה דיווחים רבים של בידוד MPC / היצמדות למנגנון 38-49, מקובל עבור סופרים לתאר את הפרוטוקולים לבידודים כגון בקצרה, לעתים קרובות לא שלמים, פורמטים. יתר על כן, הפרוטוקולים המאלף ביותר ריפוrted פותחו עבור עכברי 50-53, וחלק מאלה מסתמך על בחירת נוגדן 54,55 או transgenes הקרינה 56,57, מה שהופך את הפרוטוקולים הללו לבלתי שמישות או מינים שאינם מכרסמים מעשיים כמוסים מנוצלים על ידי ביולוגים שריר. עם מעט ידוע על piscine, דו חיים, הזוחלים וmyogenesis, פרוטוקול מפורט ויסודי, שתוארה עם הדרכה קולית וויזואלית וביעילות הפגינה במינים שאינם קרובים, יהיה מועיל ביותר בתחום. תואר לראשונה על ידי פאוול ועמיתיו בשנת 1989 58, הפרוטוקול הבא פותח בתחילה כדי לבודד MPCs וmyoblasts מדגי salmonid (כלומר, פורל קשת, Oncorhynchus mykiss, וסלמון האטלנטי, סאלאר Salmo) וחלק cyprinids גדול יותר (כלומר, דג זהב, Carassiusauratusauratus) . ב2000, Fauconneau וPaboeuf מותאם תרבות והיצמדות למנגנון עיקרי לפורל קשת 59, ואמא minoroptimizationsדה שהפרוטוקול לניצול בכמה דגיגים קטנים יותר של clade Danioninae (דג הזברה, rerio Danio, וDanio הענק, Devario aequipinnatus) 32 בשל כלים גנטיים הרבים הזמינים לעבודת דג הזברה ובכך קרובי משפחתה הקרובים. דגי חוליות הם אורגניזמים אטרקטיביים למחקר בשל אסטרטגיית הצמיחה מסתעפת (לפחות ברוב המינים). salmonids הגדול, כמו רוב הדגים, גדל אבד את הכיוון, עם פוטנציאל צמיחה בלתי מוגבל על ידי אסימפטוטה במועד הפירעון, גם בגיל המבוגר 60-62. שלא כמו דג הזברה, danionins הגדול כגון Danio הענק 63 ופוטנציאל צמיחת תצוגת Danio משופם טיפוסי של דגי חוליות, מה שהופך את צירופם הישיר פלטפורמה אידיאלית להבנה אם בחירת גורל תא MPC משחקת תפקיד בהיפרפלזיה שרירי שלד לעומת היפרטרופיה. כמו כן, אנו מראים כי פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם עכברים וaxolotls, עם תשואת תא גבוהה יחסית וviabמדדי ility. סלמנדרות Urodele, כגון האמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum), להחזיק את היכולת יוצאת דופן כדי לחדש רקמות, כוללים גפיים וזנבות 64-66 כולו. מאפיין זה הופך את הדגמים מעניינים דו חיים אלה של בזבוז שריר שלד ואת הזדקנות. באמצעות הפרוטוקול המתואר להלן, בגישה דומה יכולה להתבצע כפי שנעשה במינים דגים רבים, מתן הקשר השוואתי רחב עוד יותר ללימודים כאלה. ביולוגים באמת השוואתיים כפי שרבים מעריכים, ההתקדמות המשמעותית ביותר בביולוגיה בסיסית ויו translational יכולה להתבצע כאשר הנתונים מנותחים בתוך הספקטרום הרחב ביותר (כאן, כל שושלת החוליות).

<table><tbody><tr><td colspan="4">טבלה 1. מידע מפורט</td>על</tr><tr><td>ריאגנטים חברת ריאגנטים</td><td>(מועדף לעומת חלופי)</td><td>מספר קטלוגי (מועדף לעומת חלופי)</td><td>כמות לתרבית</td></tr><tr><td>&גמא;פולי-ליזין סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוקרן (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 מ"ג</td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז גבוה)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סלגרו)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 ליטר</td></tr><tr><td>למינין</td><td>BD Biosciences ( סיגמא-אולדריץ')</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>פישר סיינטיפיק (סיגמא-אולדריץ')</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1.51 גרם</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>פישר סיינטיפיק (סיגמא-אולדריץ')</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9.53 גרם</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית</td><td>תרמו סיינטיפיק (סיגמא-אולדריץ')</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 מ"ל</td></tr><tr><td>גנטמיצין סולפט</td><td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 מ"ל</td></tr><tr><td>Donor Equine Sera</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 מ"ל</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Sera</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>קולגנאז (סוג IV)</td><td>וורת'ינגטון (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0.44 גרם</td></tr><tr><td>טריפסין (מהלבלב)</td><td>MP ביו-רפואיים (סיגמא-אולדריץ')ICN15357125</td> <td>(T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 2. חומרים מתכלים, כלים וציוד</td></tr><tr><td>כלים</td><td>מתכלים</td><td>ציוד</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים</td><td>מלקחיים (גס)</td> <td>פיפטור</td><td></td>סרולוגי</tr><tr><td>סטרילי 50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>מלקחיים (עדין)</td> <td>מד</td><td></td>pH</tr><tr><td>סרט מעבדה</td><td>אזמל ידיות</td><td>חממה מצננת (אקותרמית)</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m מערכות עיקור ואקום</td><td>להבי אזמל (#10, #11)</td> <td>קולט אדים</td><td></td>זרימה למינרית</tr><tr><td>דוחה מים נייר חיטוי</td><td>מספריים כירורגיים</td><td>סעפת</td><td></td>ואקום</tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>זכוכית פטרי צלחות</td><td>מיקרואוסמולליות מד</td><td></td></tr><tr><td></td> מיקרואוסמולליות <td>12-16 גרם קנולות עם Luer Locks</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 3. נפחים אופטימליים לציפוי צלחות תרבית תאים</td></tr><tr><td>גודל צלחת</td><td>ס"מ^2 לבאר</td><td>פולי-L-ליזין*</td><td>למינין*</td></tr><tr><td>*6 באר</td><td>9.5</td><td>1.6 מ"ל</td><td>1</td></tr><tr><td>24 בארות</td><td>1.9</td><td>0.32</td><td>0.2</td></tr><tr><td>48 באר</td><td>0.95</td><td>0.16</td><td>0.1</td></tr><tr><td>96 באר</td><td>0.32</td><td>0.06 0.03</td><td></td></tr><tr><td>*0.1 מ"ג/מ"ל ריכוז</td><td>** 0.020 מ"ג/מ"ל ריכוז</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 4. מדיה לבידוד, דיסוציאציה ותרבית</td></tr><tr><td>ריאגנט</td><td>בידוד</td><td>שטיפת</td><td>דיסוציאציה</td></tr><tr><td>בסיס בינוני</td><td>419.25 מ"ל</td><td>395.40 מ"ל</td><td>297.00 מ"ל</td></tr><tr><td>ג'נטמיצין סולפט**</td><td>0.75 מ"ל</td><td>0.60 מ"ל</td><td></td></tr> <tr><td>סרום סוסים תורם</td><td>75.00 מ"ל</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- סרום בקר עוברי***</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>* PSF: קוקטייל פניצילין/סטרפטומיצין/פונגיזון (פי 100); ** ריכוז 50 מ"ג/מ"ל; מאופיין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 5. דילולים ונפחי ציפוי מומלצים</td></tr><tr><td>גודל צלחת</td><td>ס"מ ^ 2 לכל דילול באר</td><td></td><td>ציפוי נפח</td></tr><tr><td>6 באר</td><td>9.5</td><td>1.5-2.0x10 ^6 תאים / מ"ל</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>24 באר</td><td>1.9</td><td>1.5-2.0x10 ^6 תאים / מ"ל</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 באר</td><td>0.95</td><td>1.5-2.0x10^6 תאים/מ"ל</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 באר</td><td>0.32</td><td>1.5-2.0x10^6 תאים/מ"ל</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 6. מספר ממוצע של תאים לגרם רקמה</td></tr><tr><td>מינים</td><td>ממוצע # תאים/גרם רקמה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6,400,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1,783,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1,797,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66,800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 7. טמפרטורות דגירה מומלצות</td></tr>: <tr><td>טמפרטורת מינים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Danio/Devario spp.</td><td>26 - 28 & deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 מעלות; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* טמפרטורות נמוכות יותר תומכות בשיעורי התפשטות נמוכים יותר.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

בשל הקושי המובנה והזמן כרוך בלימוד תכנית myogenic in vivo, מערכות התרבות עיקריות נובעות מתאי גזע בוגרים תושב שרירי שלד, התאים המבשר myogenic (MPCs), הוכיחו הכרחיות להבנה של התפתחות שרירי שלד שלנו ושל יונקים צמיחה. במיוחד בקרב המינים הבסיסיים של Vertebrata, עם זאת, הנתונים הם מוגבלים המתאר את המנגנונים המולקולריים שליטה החידוש העצמי, שגשוג, והתמיינות של MPCs. עניין מיוחד הם מנגנונים אפשריים העומדים בבסיס היכולת של בעלי חוליות הבזליים לעבור היפרפלזיה ניכרת postlarval שלד myofiber (חוליות דגים כלומר) והתחדשות מלאה הבאות אובדן סרח (כלומר urodele דו חיים). בנוסף, השימוש בmyoblasts התרבותית יכול לסייע בהבנה של התחדשות והשחזור של תכנית myogenic וההבדלים ביניהם. אללצורך זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול חזק ויעיל (ווריאציות בו) לבידוד ושמירה על MPCs וצאצאיהם, myoblasts וmyotubes לא בוגר, בתרבית תאים כפלטפורמה להבנת האבולוציה של תכנית myogenic, החל יותר בעלי חוליות בסיס. וניצול של מעמדו אורגניזם המודל של דג הזברה (Danio rerio), אנו מדווחים על היישום של פרוטוקול זה לדגים קטנים של clade cyprinid Danioninae. במקביל, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי להבין גישה השוואתית רחבה יותר על ידי בידוד MPCs מהאמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum) ואפילו המכרסמים מעבדה. פרוטוקול זה הוא כיום בשימוש נרחב בלימוד myogenesis בכמה מיני דגים, ביניהם פורל קשת, דגי סלמון והדניס 1-4.

עשרים וארבע שעות שלאחר זריעה, תאים מבשר myogenic (MPCs) צריכה להיות גלויות מחובר לתשתית laminin (ראה איורים 1 א ו1D). בעקבות זריעה, תאים (MPCs) לאמץ צורה כמו ציר, מעידה על סוג תא זה (איור 1) והם MyoD1 (איור 2) +. במיני Danio, MPCs להיראות קומפקטי עם תהליכים דו קוטביים קטנים יותר מאשר לעשות MPCs ממינים Oncorhynchus וSalmo. עם זאת, במהלך ארבעה ימים של תרבות, MPCs מכל מיני piscine בדק לאמץ מורפולוגיות דומות ונראים ב...

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל תאי אב מיוגניים מדגי מים כדי שיעברו מיוגנזה in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה של השריר האפקסלי (epaxal muscle) מהאורגניזם. השלב השני הוא פירוק מכני של הרקמה המבודדת.בשלב הבא, הרקמה תעבור דיסוציאציה אנזימטית כדי לפזר את התאים הרצויים. השלב האחרון הוא זריעת תאי העזר המיוגניים המבודדים על תשתית Laminin. בסופו של דבר in vitro.מיאוגנזה (Myogenesis) משמשת להדגמת ההשפעות של טיפולים שונים על שינויים בוויסות וביטוי גנים, ביטוי חלבונים ובשינויים בפנוטיפ התאים. סרטון זה ידגים כיצד להקים מערכת תרבית ראשונית מתאי קדם-שריריים (Myogenic precursor cells) של דגי גרמיים (teleost). הדגמה חזותית של טכניקה זו היא חיונית, שכן חלק משלבי הדיסוציאציה עשויים להיות קשים ללמידה.דיסוציאציה נכונה ומספקת חיונית לבידוד משק תאים הולם לצורך תרבית מאוחרת יותר. ראשית, הכינו את כל המדיומים והתמיסות הדרושים להליך. לאחר מכן, הכינו את הפריטים הנוספים הדרושים לבידוד הרקמה.ביצוע עיקור באוטוקלאב מראש במידת הצורך. ודאו כי אתם מכינים חומרים נוספים עבור כל אדם המסייע בתהליך הדיסקציה. פריטים נוספים שיש להחזיק בהישג יד כוללים ethanol 70%, מאזניים סטריליים, מבחנות קוניות של 50 milliliter וקרח עבור כל חמישה גרמים של רקמה המיועדת לדיסקציה.העבירו 25 milliliters של מצע בידוד למבחנה קונית סטרילית של 50 milliliter. לאחר ששקלתם ורשמתם את מספר המסה, הניחו את המבחנות על קרח. כאשר תהיו מוכנים, הוציאו דג שישמש לדיסקציית רקמות ושקיעו אותו ב-70% Ethanol למשך 30 שניות, לפני הנחתו על נייר אוטוקלאב דוחה מים ישירות מאחורי ה-erla. השתמשו בסכין מנתח כדי לבצע חתך שטחי ורדוד, אחזו בעור בנקודת החתך ומשכו לכיוון הזנב כדי להסיר את הקשקשים והעור.בשלב הבא, כרתו את שריר הלבן הגליקוליטי המהיר מהציר של הדג משני הצדדים. הימנעו מהשריר האדום החמצוני האיטי הממוקם סמוך לקו הצד. העבירו את השריר אל תוך מディア בידוד והשליכו את שאר חלקי הדג.המשיכו באיסוף רקמה עד להשגת כמות מספקת של שריר במהלך הנתיחה, והבטיחו שרקמת השריר המאוגדת נשארת על קרח כדי לשמור על חיוניות התאים. כדי להתחיל, שפכו מבחנה אחת של רקמת שריר לתוך צלחת פטרי מזכוכית. השתמשו בשני סקלפלים בתנועות הלוך וחזור כדי לקצוץ את הרקמה עד שניתן יהיה להוציא את תערובת הרקמה בקלות.באמצעות פיפט של 25 milliliter, העבירו את תרחיף הרקמה חזרה לשפור המקורי. חזרו על שלבים אלו עד שכל הרקמה תעבור דיסוציאציה מכנית. כאשר כל הרקמה עובדה, סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את הרקמה במדרי רענן לפני סבב צנטריפוגה נוסף.לאחר שטיפה יסודית, השעה את הרקמה בתמיסת קולגנאז למשך 60 דקות בטמפרטורה של 18 °C תוך끔 ניעור עדין. בתום הדגירה, סובב את המבחנות בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים. לאחר שטיפה שנייה, השעה שוב את הרקמה במדיום שטיפה.בשלב הבא, בצעו טריטורציה (trituration) להומוגנאט הרקמה עד שניתן יהיה להעבירו הלוך וחזור בפיפט של 10 מיליליטר בקלות יחסית. חזרו על תהליך זה עם פיפט של חמישה מיליליטר, ולאחר מכן שוב עם קנולה מתכת במידה 16 המחוברת למזרק. לאחר הומוגניזציה יסודית, השקיעו את הרקמה וסננו את הנוזל העליון (supernatant).שששב את הרקמה בתוך תוכה של מדיום דיסוציאציה עם טריפסין והדגר למשך 20 דקות בטמפרטורה של 18 °C. לאחר מכן, הנח את המבחנות בצנטריפוגה לסבב קצר. לאחר הצנטריפוגה, העבר את העלייה לארבעה נפחים שווים של תמיסת בידוד.יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עבור המשקע שנותר. חזור על שלבי השטיפות והדיסוציאציה שהודגמו כעת, ואחד את העלייה שנוצרה עם זו שנאספה קודם לכן.העבירו את התערובת הסופית למבחנות קוניות בנפח 50 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה. לאחר הסבוב, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) תוך הקפדה לא להפריע למשקע התאים. טפטפו שני מיליליטר של מצע גידול מלא לתוך כל מבחנה.להמסה, העבירו את התאים שהושעו למסה למבחנה קונית אחת בנפח 50 מיליליטר. שטפו כל מבחנה עם מיליליטר אחד של מצע גידול מלא. הוסיפו את נוזל השטיפה למאגר התאים שהושעו.בצעו טריטורציה לרקמה באמצעות קנולה ממתכת ומזרק חמש עד 10 פעמים. לאחר סינון תגלי השלולית התאים, הוסיפו כמות מספיקה של מצע גידול מלא להגעה לנפח של 50 milliliters וסבבו בצנטריפוגה. אספו את התאים, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו five milliliters של מצע גידול מלא.לאחר השסעסעס (Resuspension), הוצאו מדגם קטן כדי לקבוע את מספר התאים החיים, באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). הסירו את תמיסת הלמינין מהלוחיות שעובדו ב-poly L lysine.לאחר דילול התאים לריכוז הדרוש, יש לזרוע אותם על הצלחות שהוכנו מראש ולאטום אותן. יש להניח את הצלחות האטומות באינקובטור קירור המכוון לטמפרטורה המתאימה. 24 שעות לאחר זריעת תאי מקור מיוגניים (myogenic precursor cells או MPCs), אלו אמורים להיות קשורים באופן נראה לסובסטרט הלמינין, בעוד שבמקור הם נראים דחוסים יותר.MPCs מדגי zebrafish מאמצים מורפולוגיות דומות לאלו של פורל רב-צבעים. במהלך ארבעה ימי תרבית, שפופרות שריר (myotubes) אמורות להיווצר בתוך שישה עד תשעה ימי תרבית. בתרבית, MPCs ומיובלסטים נראים כמבטאים myo D one.ככל שמיובלסטים מבצעים התמיינות למשבצות שריר (myotubes), הם יתחילו לבטא myogenin. נתונים אלו מראים שגחה תאית במהלך תרבית באמצעות שילוב של BRDU. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידכם הבנה טובה של אופן הבידוד והתרבית.תאי מקור מיוגניים ממגוון מיני דגים לאחר פיתוחם הראשוני בתרביות תאים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של השריר לחקור נתיבים חדשים בביולוגיה של השריר ובאורגניזמים אחרים, כגון דניו (danios), וכן דו-חיים אחרים כגון אקסולוטל (Axolotl).

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור.  מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה.  בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, לשחזור ופשוטה של ​​בידוד והתרבות של ובתאים myoblast מן שרירי השלד של מבוגרים וישישים. השרירים המשמשים כאן כוללים שרירי כף הרגל והרגל. גישה זו מאפשרת הבידוד של אוכלוסייה מועשרת של myoblasts העיקרי ללימודים תפקודיים.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו שיטה לבידוד וגידול תאי קדם מיוגניים מדגי Teleosts לחקר מיוגנזה בתרבית. הפרוטוקול כולל ניתוח שריר אפקסלי, פירוק מכני ואנזימטי, ושתילה על סובסטרט למינין.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

גלה סרטונים נוספים