אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור פרופיל מטבולי בתאים מתורבתים. זה מושג על ידי חילוץ מטבוליטים קוטביים מהתאים. השלב השני הוא להרכיב מחדש את תמציות התאים במים ולהעביר את הדגימות לבקבוקוני LC.

לאחר מכן, הדגימות מוזרקות למכשיר lc QE MS, אשר כויל ונתונים גולמיים נרשמים במחשב בשלב האחרון. פסגות מטבוליט מופקות מהנתונים הגולמיים באמצעות תוכנה מסחרית, ושיאים לא ידועים מחפשים מול מסד נתונים המוני ברזולוציה גבוהה. למרות שמאסטר זה יכול לספק תובנה לגבי רמות מטבוליט יחסיות בסארס, ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון סרום או רקמות.

ראשית, הכינו 500 מיליליטר של שלב A נייד, שהם 20 מילי-מולרי אמוניום אצטט, ו-15 מילי-מולרי אמוניום הידרוקסיד ב-3% אצטו, ניטריל ומים. לאחר מכסה רופף של הבקבוק, סוניקט את התמיסה באמבט מים סוניקט למשך 10 דקות ללא חימום. לאחר מכן ממיסים חמישה מיליגרם של נתרן פלואורו אצטט וחומצה בחמישה מיליליטר מים כדי ליצור ריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.

לאחר מכן ממיסים דיאזינון במתנול כדי ליצור ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. להכנת מיליליטר אחד של תמיסת כיול שלילית במסה נמוכה, מערבבים 960 מיקרוליטר של תמיסת כיול תרמו שלילית עם 20 מיקרוליטר של תמיסת נתרן פלואורו אצטט וחומצה הומובנילית. כדי להכין מיליליטר אחד של תמיסת כיול חיובית במסה נמוכה, מערבבים 990 מיקרוליטר של תמיסת כיול תרמו חיובית ו-10 מיקרוליטר של תמיסת הדיאזינון.

לאחר ביצוע כיול מסה סטנדרטי במצב חיובי, כוונן את טווח הסריקה ליחס מסה למטען של 60 עד 900 בלוח הבקרה של המכשיר והחל דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מקור של 25 אלקטרון וולט. הזן יוני כיול מותאמים אישית, וברגע שמקור היונים יציב, התחל את הכיול המותאם אישית בדף הכוונון. העבר את הקוטביות למצב שלילי לאחר ביצוע כיול מסה סטנדרטי במצב שלילי, התאם את טווח הסריקה ליחס מסה למטען של 60 עד 900 בלוח הבקרה של המכשיר והחל דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מקור של 35 אלקטרון וולט.

הזן יוני כיול מותאמים אישית, וברגע שמקור היונים יציב, התחל את הכיול המותאם אישית. בדף הכוונון, ציידו את מכשיר ה-QE MS ביינון ריסוס אלקטרו מחומם או בדיקת HESI על ידי קיבועו ברמה C ולאחר מכן חיבורו לכניסות גז החנקן, כבל האידוי וכבלי המתח. בדף כוונון המחשב, הגדר את פרמטרי הכוונון הרלוונטיים עבור הבדיקה.

הגדר את טמפרטורת הנימים ל-320 מעלות צלזיוס ואת עדשת ה-S ל-55. בשלב הבא בתוכנית השיטה, בנה שיטת סריקה מלאה באמצעות הערכים הבאים. קבע את שיטת הכרומטוגרפיה על ידי הזנת מידע השיפוע הליניארי.

השתמש בעמודת ביניים להפרדת תרכובות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, הכינו ממס מיצוי על ידי ערבוב ידני של 40 מיליליטר מתנול ו -10 מיליליטר מים ב -50 מיליליטר. שניים. בתרבית קודמת של סרטן המעי הגס H CT שמונה תאים מגיעים למפגש של 80%.

שואבים במהירות את המדיום ומניחים את צלחת שש הבארות על גבי קרח יבש. לאחר מכן הוסיפו מיד מיליליטר אחד של ממס מיצוי לכל באר והעבירו את הצלחת למקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. לאחר הוצאת הצלחת מהמקפיא, 15 דקות לאחר מכן, הניחו אותה על גבי קרח יבש וגרדו את התאים לתוך הממס.

מעבירים את התמיסה מכל באר לשלושה צינורות עינור של 1.7 מיליליטר ומצנטריפוגות את הדגימות במהירות של 20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לשני צינורות איינור חדשים. לאחר מכן יבש את הדגימות בוואקום מהירות.

לאחר שהדגימות יבשות, אחסן אותן במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. לאחר הוצאת הדגימות מהמקפיא לניתוח, אפשר להן להגיע לטמפרטורת הקרח. לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטר מים קרים כקרח, ומערבלו את הדגימות כדי להמיס מטבוליטים.

לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימות ב-20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. במשך שתי דקות, העבירו את ה-SUPERNAT לבקבוקוני lc והזריקו חמישה מיקרוליטרים מהדגימות למכשיר lc QES לניתוח. לאחר שהכיול בוצע כראוי במכשיר QE MS, אזנו את עמודת ה-lc למשך חמש דקות עם 85% משלב B הנייד בקצב זרימה של 0.15 מיליליטר לדקה.

לאחר מכן, הגדר את רצף הדגימה בסדר אקראי כדי להפיץ את התנודות שהוצגו על ידי ה-LCMS לכל דגימה ולהבטיח השוואה מדויקת יותר בין דגימות שונות. לאחר כל שש דגימות, הוסף ריצת כביסה, ואחריה דגימה ריקה כדי להעריך את רקע המערכת ורמות ההעברה. שמור את הרצף והתחל את הרצף.

ברגע שעמודת ה-lc מראה לחץ יציב קרוב ל-400 PSI, לאחר ששתי הדגימות הראשונות של הרצף פעלו, בדוק את הפסגות בכרומטוגרמות אלה עבור מטבוליטים לא ידועים כדי לוודא שרצף הדגימה פועל בצורה חלקה. לאחר סיום כל הדגימות ברצף, בצע ניתוח נתונים במחשב נפרד. בחר את שיטת יישור השיא וחילוץ המסגרת עבור מולקולות קטנות בתוכנה זמינה מסחרית.

לאחר מכן טען את הנתונים הגולמיים של lc ms וקבץ אותם על סמך סוגי דגימה. בחר דגימות באמצע רצף הריצה כדגימת ייחוס כרומטוגרפיה ליישור שיא, ובחר קבוצה כקבוצת היחס או חישוב השינוי המלא. לאחר מכן העלה זרע מסגרת, כולל מטבוליטים ידועים לניתוח מטבוליט ממוקד עם נתונים שנאספו וזרע המסגרת המתאים.

לאחר מכן, בחר סריקת ספקטרום מלאה במצב חיובי או שלילי ושמור את קובץ עיבוד הנתונים הזה באותה תיקיה כמו הנתונים הגולמיים. כבה את פונקציית החיפוש במסד הנתונים והפעל את זרימת העבודה. לאחר מכן ייצא את נתוני התהליך כגיליון Excel המכיל את אזור השיא של כל מסגרת.

לניתוח מטבוליט לא ממוקד, בחר את שיטת מיצוי הרכיבים. טען את הנתונים הגולמיים לדוגמה ושלוש דוגמאות ריקות לחיסור רקע. לאחר קבוצה זו, הנתונים הגולמיים והגדירו את דגימות הייחוס כפי שתואר קודם לכן.

הגדר את סף הרכיבים ל- 10 לחמישי. השתמש במסד נתונים של מטבולום אנושי לזיהוי תרכובות לא ידועות. לאחר שמירת קובץ עיבוד זה, בטל את פונקציית החיפוש במסד הנתונים והתחל את זרימת העבודה.

לאחר סיום עיבוד הנתונים, השתמש במקדמי וריאציה או מסנני CV כדי להסיר רכיבים עם CV גדול בתוך דגימות שכפול ומסנני עוצמה. כדי להסיר רכיבים שזוהו ברמת הרעש באופן ידני, עברו על כל רכיב ובחרו את אלה עם שיא מוגדר היטב או הבדל גדול יחסית בסוגי דגימה שונים לחיפוש מסד הנתונים. לבסוף, ייצא את הנתונים עם כניסות במסד הנתונים.

הדיוק של נתוני מטבולומיקה תלוי מאוד בביצועי מכשיר lc QEMS כדי להעריך אם המכשיר פועל במצב טוב והאם השיטה המיושמת תקינה. מספר פסגות lc מטבוליט ידועות מופקות מכרומטוגרפיית היונים הכוללת כפי שמוצג כאן. מטבוליטים קוטביים כולל חומצות אמינו, גליקוליזה, חומרי ביניים, TCA, נוקלאוטידים ביניים ויטמינים A TP ו-NADP הם בעלי שמירה טובה על העמודה וצורות שיא טובות בתנאי ה-lc הנוכחיים.

בינתיים, בדיקת שגיאת מסה נעשית תוך 24 שעות לאחר כיול מסה נמוכה כפי שמוצג באיור. כאן, שגיאת המסה מוערכת על ידי השוואת יחס המסה למטען שזוהה ליחס המסה למטען התיאורטי של מטבוליטים ממוקדים. כאן, למטבוליטים הממוקדים יש יחס מסה למטען שנע בין 74 ל-744.

ציר ה-Y כאן מייצג את האחוז המצטבר של מטבוליטים בטווח שגיאת מסה מסוים. העקומה הכחולה מציגה את התוצאה מאפס עד 12 שעות, בעוד שהעקומה בצבע אדום מציגה את הנתונים שנאספו בין 12 ל-24 שעות לאחר הכיול. יותר מ-90% מהמטבוליטים נמצאים בטווח של חמישה חלקים למיליון שגיאת מסה, מה שאומר ששיטת כיול טווח המסה הנמוך שפותחה כאן מספיקה כדי לשמור על שגיאת מסה של חמישה חלקים למיליון לזיהוי טווח מסה נמוך.

נושא נוסף שיש לטפל בו הוא הרגישות של המכשיר עם השיטה הנוכחית והגדרת המכשיר. דילול סדרתי של דגימות משולשות מצלחת פטרי של 10 סנטימטר בוצע חמש פעמים עם מקדם דילול של שש וכתוצאה מכך שישה ריכוזים שונים של דגימות. רשימה ממוקדת משמשת להערכת מספר המטבוליטים שזוהו בריכוזים שונים של הדגימה.

התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שהמספר האופטימלי של מטבוליטים ממוקדים שזוהו הוא בין 2.78 כפול 10 לחמישי ו-1.67 כפול 10 לששת התאים, בעוד שאחד כפול 10 לשבעת התאים נותן מספר קטן יותר של מטבוליטים שזוהו, הנובע מהשפעות דיכוי יונים. תוצאה זו מצביעה על כך שכמות התאים האופטימלית למיצוי לצורך ניתוח זה היא בערך זו של באר בצלחת של שש בארות. עבור ניתוח מטבוליט לא ממוקד, חיתוך CV של 20% וערך עוצמה ממוצע של 10 עד השביעי משמשים לסינון טבלת הרכיבים.

ניתן להגדיל את ערכי החיתוך של CV בעוד שיש להקטין את ערכי העוצמה הממוצעים כדי לכלול יותר פסגות לאחר בדיקה ידנית של הפסגות, רכיבים עם צורות טובות נבחרים ומחפשים במסד הנתונים של המטאבולום האנושי. התוצאות מנתונים שנאספו במצב חיובי מפורטות כאן, בעוד שהתוצאות מהמצב השלילי מפורטות כאן. חלק מהמטבוליטים שזוהו כאן חופפים למטבוליטים ברשימה הממוקדת, כגון גלוטתיון ופרולין.

מטבוליטים נוספים הנעדרים מהרשימה הממוקדת נחקרים גם הם, כגון מתיל גליוקסל, שניתן להפיק מגליקוליזה ו-PTO אחד, שני גליצרול ELE SN, שלושה פוספוכולין, המתגלה במצב חיובי עם זמן שמירה של 3.2 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ מטבוליטים פולי מסארס מתורבת ולאחר מכן להשתמש ב-RC QES כדי למדוד רמות חילוף חומרים יחסיות בדגימות שונות. תודה שצפית.