הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד
2 בינואר 2014
ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.
הליך זה מכין החלקות כיסוי זכוכית עם וירוסים לשימוש במיקרוסקופ כוח אטומי ומיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ לוקליזציה המופעל על ידי צילום פלואורסצנטי. ראשית, יש לנקות את מצע הזכוכית ולצפות את הזכוכית בסרט דק של פוליאתילן גליקול ביוטיניל חלקית המושתל בפולי L ליזין. לאחר מכן, טפל במשטח עם avadon כדי להגביר את זיקת הקישור של הסרט הביוטיניל.
כעת טפל במשטח עם נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לנגיף המעניין. לאחר מכן טפל במשטח שהוכן לנוגדנים עם הנגיף המעניין. בניגוד לציפוי ספין, לטכניקה זו יש את היתרון של פיזור גרסאות לאורך פני השטח בצורה הומוגנית.
על מנת לייעל את המיקרוסקופיה, הנח את החלקות הכיסוי בצורה אנכית במתלה החלקה לכיסוי טפלון בגודל מתאים, וטבל אותם בכוס מלאה בסוניקט אלכוהול אתילי מסונן למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את הכיסוי החלקה בהרחבה במים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי במתלה טפלון נקי נפרד וכוס מלאות בסודיום הידרוקסיד סוניקט מולארי אחד למשך 30 דקות ושטפו בהרחבה במים טהורים במיוחד.
כעת יבש את הכיסוי השטוף מחליק מתחת לזרם חנקן והעביר אותם לרשת טפלון נקי ויבש. ודא שכל החלקה של הכיסוי נקייה מכל סרט או חלקיקים גלויים. מיד לאחר הייבוש בזרם החנקן בצורה אופקית, הנח החלקת כיסוי אחת לתוך צלחת פטרי סטרילית במרכז פיפטת החלקת הכיסוי את הכמות המתאימה של פוליאתילן גליקול מושתל פוליליזין ביוטיניל ב-PBS.
מניחים עוד החלקה נקייה על גבי הנוזל בשיטת כריך. ודא שהנפח בין הפנים הפעילות של שתי החלקות הכיסוי מלא לחלוטין בנוזל. מכסים את צלחת הפטרי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות.
לאחר מכן, הרם את הכריך בעזרת פינצטה מבלי לצבוט את עודפי הנוזלים. כעת בעזרת האגודל והאצבע המורה, צובטים את הכריך קלות ואופקית. החלק את החלקות הכיסוי בכיוונים מנוגדים והפרד אותם מבלי לגעת בפנים הפעילות.
שטפו את שני הפנים הפעילים ב-25 מיליליטר מים טהורים במיוחד. כעת יבש את החלקות הכיסוי עם זרם חנקן ושים לב אילו פני החלקה של הכיסוי פעילים לצלחת פטרי סטרילית. הנח פתק כיסוי מטופל עם הפיפטה הפעילה עם הפנים כלפי מעלה כמות מתאימה של תמיסת ראיות מופשרת על אמצע הפנים הפעילות.
הניחו החלקה נוספת עם הפנים הפעילות כלפי מטה כדי לסנדוויץ' את הנוזל, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 25 עד 30 דקות. לאחר מכן, הפרד את שני פתקי הכיסוי כפי שהוצג קודם לכן. הקפידו לא לגעת בפנים הפעילות.
כעת שטפו את שני הפנים הפעילים ב -25 מיליליטר מים טהורים במיוחד ואז יבשו את החלקות הכיסוי בזרם חנקן. חשוב לזכור אילו פרצופי החלקה של הכיסוי פעילים. לעיון עתידי, הנח מיד כיסוי נלהב ומטופל להחליק פעיל עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, פיפטה כמות מתאימה של נוגדן ביוטיניל להפשיר על אמצע הפנים הפעילות.
הניחו החלקת כיסוי נוספת עם הפנים הפעילות כלפי מטה על גבי הנוזל בשיטת סנדוויץ'. לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות לאחר הפרדת שתי החלקות הכיסוי, יש לשטוף את שני הפנים הפעילות עם 25 מיליליטר PBS. לאחר מכן הניחו פתק כיסוי שטופל בנוגדנים עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית ופיפטה כמות מתאימה של וירוס על אמצע הפנים הפעילות.
עכשיו כריך עם כיסוי פעיל שני, להחליק, לכסות ולדגור. כעת הפרד את שני פתקי הכיסוי. שטפו את שני הפנים הפעילים עם 25 מיליליטר PBS והעבירו אותם למתלה טפלון וכוס מלאה ב-PBS.
השתמש מיד בדגימות המוכנות או אחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה ימים. הנה. וריון מסוג בר של נגיף סטומטיטיס שלפוחית עוגן למשטח הזכוכית ונותח על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. רוחב ואורך הוויריון הם 80 ננומטר על 180 ננומטר, מה שמראה עיוותים מינימליים מהגודל המקורי של הוויריון.
בניסוי זה, הוויריון הבודד צולם על ידי מיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי. שימוש בנוגדני VSVG המסומנים על ידי Alexis 6 47. האיזופני השטח הכחולים מדגימים את פני השטח המשוחזרים של הוויריון באמצעות מיקרוסקופ FOM.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תלושי כיסוי זכוכית עם וירוסים לשימוש עם מיקרוסקופ כוח אטומי או מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. חשוב לזכור בכל עת באיזה פנים של תלוש הכיסוי יש את הכימיה הפעילה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להכנת כיסית זכוכית עם וירוסים לשימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) ובדימות פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה (super-resolution). הטכניקה מבטיחה היצמדות מבוקרת של ויריונים, ובכך מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של מבנים ויראליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- היצמדות של ויריונים חיונית לטכניקות דימות כגון AFM ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה (super-resolution microscopy).
- הדבקה מבוקרת משפרת את איכות תוצאות הדימיג'.
- ייתכן ששיטות קודמות אינן מספקות התפלגות אחידה של הויריונים.
- מחקר זה מציג שיטה חדשנית להכנת דגימות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להצמדת ויריונים למשטחי זכוכית.
- שיפור איכות הדימיון ב-AFM ובמיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה (super-resolution microscopy).
- הדגמת יעילות השיטה באמצעות נגיף הסטומטיס הוסיקולרי (vesicular stomatitis virus).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניקוי וציפוי של כיסויים זכוכיתיים (coverslips) ב-polyethylene glycol ביוטינילי.
- טיפול במשטחים באמצעות avidin ונוגדנים ביוטיניליים הספציפיים לנגיף.
- הצמדת כיסויי זכוכית במבנה "סנדוויץ'" כדי להקל על פיזור אחיד של הנוזל.
- שימוש בטכניקות סוניקציה ושטיפה כדי להבטיח ניקיון.
תוצאות עיקריות
- ויריונים עוגנו בהצלחה למשטחי זכוכית לצורך דימות.
- ויריונים בודדים דוממו עם עיוות מינימלי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- השיטה הדגימה פיזור יעיל של ויריונים על פני המשטח.
- התוצאות אישרו את היתרונות של שיטת ההכנה לדימות ברזולוציה גבוהה.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה מהימנה להיצמדות של ויריונים.
- טכניקה זו משפרת את איכות הדימוי ביישומי מיקרוסקופיה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו עבור יישומי דימוי ויראליים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הידבקות מבוקרת והומוגנית של ויריונים למשטחי זכוכית, ובכך תומכת בדימוג ברזולוציה גבוהה עבור מחקרים מכניסטיים של מבנה נגיפי ואינטראקציות עם המאחס. על ידי הבטחת הכנה רפרודוקטיבילית של הדגימות, היא מפחיתה שונות במבחנים ביופיזיקליים עוקבים, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים לצורך תיקוף מטרות ומאמצים לאופטימיזציה של תרכובות מובילות. הטכניקה ישימה עבור נגיפים מעטופים הרלוונטיים לתוכניות גילוי תרופות אנטי-ויראליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיית הוויריון והפיזור של חלבוני השטח כדי להסיק על נגישות המטרה וחשיפת האפיטופים.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה סטנדרטית להשוואת ויריונים מסוג בר (wild-type) וויריונים מוטנטיים תחת תנאי דימוי זהים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מאפשר הערכה כמותית של קישור נוגדנים או ליגנדים לויריונים מקובעים באמצעות קריאות פלואורסצנציה.
- ערך תפעולי: תומך באחידות הבדיקה על ידי מזעור התקבצעות (clustering) של ויריונים והטיית אוריינטציה על פני שטח הדימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר קורלציה בין שינויים מבניים בויריונים לבין פנוטיפים תפקודיים כגון יכולת הדבקה או עמידות לנטרול.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורכי של וריאנטים נגיפיים במודלים פרה-קליניים תוך שימוש בהכנת דגימות עקבית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם אפיון מבני וביופיזיקלי מנחה את בחירת המטרה ואת סריקת תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות בנוגע למנגנוני כניסת נגיפים וניטרול באמצעות נוגדנים דרך דימוי ישיר.
- סריקה: מאפשרת הכנה הדירה של דגימות ויריונים עבור קמפיינים של סריקה מבוססת דימוי בעלת תוכן גבוה.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים מורפומטריים כמותיים (למשל, ממדי ויריונים) ומדידות של עוצמת פלואורסצנציה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין התנהגות ויריונים in vitro לבין יעילות פרה-קלינית על ידי שימור מאפיינים מבניים טבעיים במהלך הדימוי.
- שימוש חוזר בארגון: מהווה פלטפורמה גמישה של כימיה של פני-שטח, שניתן להחילה על יעדים ויראליים מרובים בתוכניות גילוי שונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי בבדיקות של ביולוגיה מבנית על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מההכנה.
- ערך תפעולי: מגביר את השחזוריות בין מעבדות ושיטות דימוי באמצעות פונקציונליזציה סטנדרטית של פני השטח.
- ערך אסטרטגי: מפחית הרצות דימוי כושלות עקב הידבקות לקויה של הויריונים, ובכך חוסך בזמן מכשיר ובמשאבי דגימה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר של "המשך/עצור" בפרויקטים אנטי-ויראליים על ידי מתן הערכה מוקדמת של פגיעות מבנית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של פני שטח ובטכניקות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לתשתית AFM ולדימיון ברזולוציה גבוהה (super-resolution).
- מצריך הקפדה קפדנית על אוריינטציה של הפנים הפעיל במהלך הרכבה רב-שלבית.
- התאמה לנגיפים לא מעטופים עשויה לדרוש שינוי של כימיית העיגון.
- מגבלות אחסון (עד 3 ימים ב-4°C) מחייבות תכנון ניסיוני בתוך אותו שבוע.
