הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד
January 2nd, 2014
ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.
הליך זה מכין החלקות כיסוי זכוכית עם וירוסים לשימוש במיקרוסקופ כוח אטומי ומיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ לוקליזציה המופעל על ידי צילום פלואורסצנטי. ראשית, יש לנקות את מצע הזכוכית ולצפות את הזכוכית בסרט דק של פוליאתילן גליקול ביוטיניל חלקית המושתל בפולי L ליזין. לאחר מכן, טפל במשטח עם avadon כדי להגביר את זיקת הקישור של הסרט הביוטיניל.
כעת טפל במשטח עם נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לנגיף המעניין. לאחר מכן טפל במשטח שהוכן לנוגדנים עם הנגיף המעניין. בניגוד לציפוי ספין, לטכניקה זו יש את היתרון של פיזור גרסאות לאורך פני השטח בצורה הומוגנית.
על מנת לייעל את המיקרוסקופיה, הנח את החלקות הכיסוי בצורה אנכית במתלה החלקה לכיסוי טפלון בגודל מתאים, וטבל אותם בכוס מלאה בסוניקט אלכוהול אתילי מסונן למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את הכיסוי החלקה בהרחבה במים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי במתלה טפלון נקי נפרד וכוס מלאות בסודיום הידרוקסיד סוניקט מולארי אחד למשך 30 דקות ושטפו בהרחבה במים טהורים במיוחד.
כעת יבש את הכיסוי השטוף מחליק מתחת לזרם חנקן והעביר אותם לרשת טפלון נקי ויבש. ודא שכל החלקה של הכיסוי נקייה מכל סרט או חלקיקים גלויים. מיד לאחר הייבוש בזרם החנקן בצורה אופקית, הנח החלקת כיסוי אחת לתוך צלחת פטרי סטרילית במרכז פיפטת החלקת הכיסוי את הכמות המתאימה של פוליאתילן גליקול מושתל פוליליזין ביוטיניל ב-PBS.
מניחים עוד החלקה נקייה על גבי הנוזל בשיטת כריך. ודא שהנפח בין הפנים הפעילות של שתי החלקות הכיסוי מלא לחלוטין בנוזל. מכסים את צלחת הפטרי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות.
לאחר מכן, הרם את הכריך בעזרת פינצטה מבלי לצבוט את עודפי הנוזלים. כעת בעזרת האגודל והאצבע המורה, צובטים את הכריך קלות ואופקית. החלק את החלקות הכיסוי בכיוונים מנוגדים והפרד אותם מבלי לגעת בפנים הפעילות.
שטפו את שני הפנים הפעילים ב-25 מיליליטר מים טהורים במיוחד. כעת יבש את החלקות הכיסוי עם זרם חנקן ושים לב אילו פני החלקה של הכיסוי פעילים לצלחת פטרי סטרילית. הנח פתק כיסוי מטופל עם הפיפטה הפעילה עם הפנים כלפי מעלה כמות מתאימה של תמיסת ראיות מופשרת על אמצע הפנים הפעילות.
הניחו החלקה נוספת עם הפנים הפעילות כלפי מטה כדי לסנדוויץ' את הנוזל, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 25 עד 30 דקות. לאחר מכן, הפרד את שני פתקי הכיסוי כפי שהוצג קודם לכן. הקפידו לא לגעת בפנים הפעילות.
כעת שטפו את שני הפנים הפעילים ב -25 מיליליטר מים טהורים במיוחד ואז יבשו את החלקות הכיסוי בזרם חנקן. חשוב לזכור אילו פרצופי החלקה של הכיסוי פעילים. לעיון עתידי, הנח מיד כיסוי נלהב ומטופל להחליק פעיל עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, פיפטה כמות מתאימה של נוגדן ביוטיניל להפשיר על אמצע הפנים הפעילות.
הניחו החלקת כיסוי נוספת עם הפנים הפעילות כלפי מטה על גבי הנוזל בשיטת סנדוויץ'. לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות לאחר הפרדת שתי החלקות הכיסוי, יש לשטוף את שני הפנים הפעילות עם 25 מיליליטר PBS. לאחר מכן הניחו פתק כיסוי שטופל בנוגדנים עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית ופיפטה כמות מתאימה של וירוס על אמצע הפנים הפעילות.
עכשיו כריך עם כיסוי פעיל שני, להחליק, לכסות ולדגור. כעת הפרד את שני פתקי הכיסוי. שטפו את שני הפנים הפעילים עם 25 מיליליטר PBS והעבירו אותם למתלה טפלון וכוס מלאה ב-PBS.
השתמש מיד בדגימות המוכנות או אחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה ימים. הנה. וריון מסוג בר של נגיף סטומטיטיס שלפוחית עוגן למשטח הזכוכית ונותח על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. רוחב ואורך הוויריון הם 80 ננומטר על 180 ננומטר, מה שמראה עיוותים מינימליים מהגודל המקורי של הוויריון.
בניסוי זה, הוויריון הבודד צולם על ידי מיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי. שימוש בנוגדני VSVG המסומנים על ידי Alexis 6 47. האיזופני השטח הכחולים מדגימים את פני השטח המשוחזרים של הוויריון באמצעות מיקרוסקופ FOM.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תלושי כיסוי זכוכית עם וירוסים לשימוש עם מיקרוסקופ כוח אטומי או מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. חשוב לזכור בכל עת באיזה פנים של תלוש הכיסוי יש את הכימיה הפעילה.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה להכנת פרוסות כיסוי מזכוכית עם וירוסים לשימוש במיקרוסקופיית כוח אטומית (AFM) ובדימות פלואורסצנטי ברזולוציה עליונה. הטכניקה מבטיחה הידבקות מבוקרת של ויריונים, ומאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של מבנים ויראליים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- הידבקות ויריון חיונית לטכניקות דימות כמו AFM ומיקרוסקופיה ברזולוציה עליונה.
- הידבקות מבוקרת משפרת את איכות תוצאות הדימות.
- שיטות קודמות עשויות שלא לספק חלוקה אחידה של ויריונים.
- מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה להידבקות ויריונים למשטחי זכוכית.
- לשפר את איכות הדימות במיקרוסקופיית כוח אטומית ובמיקרוסקופיה ברזולוציה עליונה.
- להדגים את יעילות השיטה באמצעות וירוס של stomatitis vesicular.
שיטות ששימשו
- ניקוי וציפוי פרוסות כיסוי מזכוכית בפוליאטילן גליקול ביוטינילי.
- טיפול במשטחים באבידין ובנוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לווירוס.
- כריכת פרוסות כיסוי כדי לאפשר חלוקה אחידה של נוזלים.
- שימוש בטכניקות סוניקציה ושטיפה כדי להבטיח ניקיון.
תוצאות עיקריות
- ויריונים עגנו בהצלחה למשטחי זכוכית לצורך דימות.
- ויריון יחיד דומיין עם עיוות מינימלי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- השיטה הדגימה חלוקה יעילה של ויריונים על פני השטח.
- התוצאות אישרו את כדאיות שיטת ההכנה לדימות ברזולוציה גבוהה.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה אמינה להידבקות ויריונית.
- טכניקה זו משפרת את איכות הדימות ביישומי מיקרוסקופיה.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על שיטה זו ליישומים שונים של דימות ויראלי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
