Name: הכתמה histochemical של Thaliana ארבידופסיס תא המשני בוול אלמנטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד שיטות הכתמה היסטוכימית לחקר רכיבי דופן התא המשנית ב-Arabidopsis thaliana. הטכניקה כוללת הטמעה, חיתוך וצביעה למיקרוסקופיה, ומסייעת לחוקרים לחקור הרכב דופן התא בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לסבין ראסל לסיוע בעריכה. עבודה זו הייתה חלק מDOE Bioenergy וינט המכון (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי משרד אנרגיה האמריקאי, משרד מדע, המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי, באמצעות חוזה DE-AC02-05CH11231 בין לורנס ברקלי מעבדה לאומית ומשרד אנרגיה האמריקאי.

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין סכסוכים כספיים לחשוף.

סעיפי גזע thaliana א נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את הארגון של התאים בדופן התא משני ולבחון באופן איכותי את ההבדלים בין סוג בר וצמחים מהונדסים. הטכניקות הנפוצות עבור חתך הדגימות הן יד חיתוך ישיר; או כאשר דגימות מוטבעות בagarose או מקבע, חתך יכול להיעשות עם vibratome או microtome. בניגוד לחיתוך יד, שני האחרונים אפשר לצמצם את הסיכון של ייצור הבדלים מדויקים בין דגימות שיהיו פשוט נגרמים על ידי הכנת מדגם רעה שנגרמה על ידי הבדלי עובי בין דגימות ומשטחים לא ישרים. כל השיטות האלה י...

דופן תא הצמח מחזיקה שפע של מידע בתוך מרכיביה השונים: ליגנין, תאית, hemicelluloses (xylan, glucuronoxylan,, arabinoxylan, גלוקן מעורב הצמדה, או glucomannan xyloglucan), ופקטין. טכניקות היסטולוגית לספק רמזים חזותיים חשובים בחקר הבדלים בתוך קירות תא המשניים ברמות ארגוניות וסלולריות. טכניקות היסטולוגית שונות פותחו וניתן למצוא בספרות, אבל בטכניקות אלה יכולים להיות מאתגרות ולמתחילים זמן רב משום שפרוטוקולים מפורטים מאוד עם הוראות חזותיות פשוטות הם לעתים רחוקות, אם בכלל זמין. מטרתו של מחקר זה היא לספק קווים מנחים פשוטים לטכניקות צביעה היסטולוגית כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה. חתך רקמת הגזע הוא הצעד הראשון בהדמיה של קירות תא וצורות תא. למרות סעיפי יד לחתוך הם זולים וייקחו פחות זמן להתכונן, שימוש בvibratome מציע עקביות ומניב תמונות באיכות גבוהה. באמצעות vibratome מאפשר ייצור באיכות נתונים טוב יותר על ידי יצירה גם קטעים עם אותו העובי, אשר מסייע להפיק תמונות חדות ומפחית באופן משמעותי את הסיכון לייצור הבדלים מדויקים בין דגימות שיהיו פשוט נגרמים על ידי הכנת מדגם רעה. שימוש רפים לתקן דגימות טריות יכול להיות אתגר למתחילים ועדיין עשויה להיות זמן רב אפילו למומחים כאשר ניתוח צריך להיעשות במהירות. בנוסף, הוא הופך להיות בלתי אפשרי למדוד כל פעילות ביולוגית עם המדגם כאשר הוא כבר מוטבע בשרף. טכניקה פשוטה אחת שמעסיקה agarose ועובש תוצרת בית היא מועילה להטבעת רקמות גזע, וזה גם יכול להיות מנוצל ביישומים אחרים הדורשים נתיחה של רקמות רכות. בהשוואה להטבעת דגימות בשרף, בשיטה זו יש יתרון של שמירה על רקמות חיים והפחתת מניפולציה מדגם. חתך רקמות באמצעות vibratome הוא מאוד מדויק ומייצר homogenחלקי היחידות הארגוניות, אשר, בהתאם למטרת המחקר, לאחר מכן ניתן להשתמש בכמה טכניקות צביעה שונות. שיטות הפשוטות כדי להמחיש ליגנין וארומטיים אחרים להעסיק אור אולטרה סגול (UV). עירור של מולקולות המבוססים על ארומטיים על ידי אור UV הוא טכניקה ישנה, ​​אבל הוא עדיין אחד מהגישות המהירות ביותר להדמיה של ליגנין. עם זאת, להדמיה UV היא למעשה לא אידיאלית לגילוי ליגנין, כי אור UV ילהיב ארומטיים אחרים. ליגנין מורכב בעיקר משלושה אבני בניין, monolignols (כהלים hydroxycinnamyl: אלכוהול coniferyl, אלכוהול sinapyl, ואלכוהול p-coumaryl) 1-3. כתם Phloroglucinol יכול לספק רמזים להיקף cinnamaldehydes הווה בעצה, סיבים, ורקמות קנה הנשימה 4. Phloroglucinol הוא אינדיקטור טוב של cinnamaldehydes הכללי ויכול להבדיל בין cinnamaldehydes וארומטיים אחרים. ניתן לאתרם מונומרים אלכוהול sinapylומובחן על ידי השימוש בכתם מאולה. O הכחול Toluidine הוא צבע צבעוני, ולכן יש לו את היכולת להכתים אלמנטים שונים של תא הקיר בצבעים שונים 5,6. השימוש העיקרי של O הכחול toluidine הוא לזהות פקטין וליגנין 5,6. היתרון של שימוש בO הכחול toluidine הוא שאלמנטים רבים של דופן התא ניתן דמיינו בצעד אחד. שני calcofluor הלבן ואדום קונגו הם קלים לעבוד איתו והוא יכול לשמש כדי לחזות תאית. תאית כתמים הלבנים Calcofluor, callose, וβ-glucans אינו להחליף או להחליף בחולשה האחר 6-9, ואילו כתמים אדומים קונגו ישירות לβ-(1 → 4)-glucans ובמיוחד לתאית 10,11. מטרתו של מחקר זה היא לספק קווים מנחים פשוטים לשימוש בטכניקות הצביעה כאמור לקבלת תמונות באיכות גבוהה מא thaliana גבעולים.

<table><tbody><tr>מספר CAS של <td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihydroxybenzene [מספר CAS: 108-73-6]</td></tr> <tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>מספר CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>מספר CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>טולדין כחול O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>בלוטן כלוריד, טולוניום כלוריד [מספר CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן פרמנגנט</td><td>סיגמא</td><td>223468</td><td>מספר CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>אתנול 190 הוכחה</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>מספר CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>קונגו אדום</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>C6277</td><td>דיסודיום 3,3'-[[1,1'-ביפניל]-4,4'-דילביס(אזו)]ביס(4-אמינונפתלין 1-סולפונאט) [מספר CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>מבהיר פלואורסצנטי 28 / Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS מספר 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td></td><td>Leica מיקרוטום להב רוטט VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>חברת סכיני גילוח אמריקאית לבטיחות</td><td>פריט # 60-0139-0000&nbsp;</td><td></td><td>להב קצה כפול מפלדת אל-חלד (Personna Super)</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורג (2 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה (0.6 מ"ל)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitt</td><td>Bel-Art</td><td>3800000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; מגן ידיים חם כפפה</td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>טד פלה בע"</td>מ <td>10033</td><td>חנות ב 4 מעלות; C או 20 מעלות; C לאחסון של 3 חודשים או יותר</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 דבק רקמות מיידי&nbsp;</td></tr><tr><td>מצלמה עם שבב CCD ללא תריס מכני&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה צבעונית במהירות גבוהה&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>תוכנת מצלמת QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; מכשירים מולקולריים</td><td>MetaMorph גרסה 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>דמיון אנליזה&nbsp;</td><td>אדובי&nbsp;</td><td>משקפי Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover, מרובעים, מס' 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 מ"מ (7/8 x 7/8 אינץ') משקפי כיסוי עמידים בפני קורוזיה ועבים ושטוחים באופן אחיד. עובי מס '1 הוא 0.13 עד 0.17 מ"מ.</td></tr><tr><td>מיקרו שקופיות חלביות, 1 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 מ"מ - 1 מ"מ</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan אריזה</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן TX2 Leica</td><td></td><td>11513851/11513885</td><td>מסנן המשמש לניתוח אדום קונגו עם מעבר פס של 560/40.</td></tr></tbody></table>

הכתמה histochemical של<em&gt; thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana הוא אורגניזם מודל המשמש בדרך כלל להבנה ומניפולציה של תהליכים תאיים שונים בצמחים, והוא נמצא בשימוש נרחב בחקר היווצרות דופן תא משנית. שקיעת דופן תא משנית מתרחשת לאחר הנחת דופן התא הראשונית, תהליך המתבצע אך ורק על ידי תאים מיוחדים כגון אלה היוצרים רקמות כלי וסיבים. רוב דפנות התאים המשניות מורכבות מתאית (40-50%), המיצלולוז (25-30%) וליגנין (20-30%). בודדו מספר מוטציות המשפיעות על ביוסינתזה משנית של דופן התא, והמוטציות המתאימות עשויות להפגין או לא להפגין שינויים ברורים בהרכב הביוכימי או פנוטיפים חזותיים מכיוון שניתן להסוות מוטציות אלה על ידי תגובות מפצה. הליכי צביעה שימשו באופן היסטורי כדי להראות הבדלים על בסיס תאי. שיטות אלה הן אך ורק אמצעי ניתוח חזותיים; עם זאת, יש חשיבות רבה לתפקידם בניתוח מהיר וביקורתי. אדום קונגו ולבן קלקופלואור הם כתמים המשמשים לזיהוי פוליסכרידים, בעוד ש-Mäule ו-phloroglucinol משמשים בדרך כלל לקביעת הבדלים בליגנין, וכחול טולואידין O משמש לצביעה דיפרנציאלית של פוליסכרידים וליגנין. הטכניקות הפשוטות לכאורה של חתך, צביעה והדמיה יכולות להוות אתגר למתחילים. החל מהכנת דגימה באמצעות מודל A. thaliana, מחקר זה מפרט את הפרוטוקולים של מגוון מתודולוגיות צביעה שניתן ליישם בקלות לתצפית על ארגון תאים ורקמות בדפנות תאים משניות של צמחים.

גזע הטבעה וחתך: השימוש בתבנית פלסטיק תוצרת בית כדי להטביע את הגבעולים ב -7% הוכיחו agarose להיות מהיר וקל (איור 1). שני חלקים (A ו-B; איור 1) של מערכת הבקבוקון המוטבע לעשות את זה פשוט כדי לשחרר בקלות את הגבעול המשובץ בagarose כagarose אינו מקל על חלקי הבקבוקון שהם אינרטי, שמירה על המערכת נקייה. ניתן לעשות שימוש חוזר הבקבוקונים מספר פעמים במשך שנים. הנוחות של אחסון הגזע המוטבע גם עושה את השלבים הבאים קלים יותר. על מנת לחסוך בזמן כלשהו, ​​בדו...

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים צביעה היסטוכימית של רכיבי הדופן התאית השניונית של ANA בצמח Arabidopsis. הדבר משיג תחילה על ידי הטמעת גבעול הצמח ב-aros. לאחר מכן, הגבעול המוטמע ב-aros מוצא מהתבנית ומועבר לדיסקיות דגימה, אשר נחתכים לאחר מכן לחתכים רוחביים של הגבעול באמצעות vibrato.בשלב הבא, הפרוסות עוברות הליכות שונות של צביעה היסטוכימית. לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה כדי להראות את השינויים הדיפרנציאליים ברכיבי הדופן התאית השניונית שהתקבלו מהצביעה ההיסטוכימית. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בנושא הדופן התאית, כגון שינויים ברקמות המקולריות בגבעולים של צמחים.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון ששלבים פשוטים אך קריטיים המוזכרים בפרוטוקולים כאן לא תועדו ביסודיות או הוצגו באופן פשוט בעבר. כדי להתחיל, הכינו תבנית ביתית להטבעת הגבעולים באמצעות מבחנות פלסטיק. ראשית, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את התחתית הקונוית של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה בנפח 2 mL.רכיב זה מכונה חלק A, הכולל נקב של מחט מזרק, חור במכסה הפ menutup הגדול מעט מקוטר הגבעול שיוטמע. לאחר מכן, גזרו חצי סנטימטר מתחתיתו של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.6 מיליליטר. רכיב זה יכונה חלק B. הוסיפו את החלק הגזור של חצי הסנטימטר ממבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.6 מיליליטר לתוך מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 מיליליטר שנגזרה מראש.אטמו את שני החלקים באמצעות פאראפורם. בעזרת להב תער, חתכו מקטע גבעול מהאזור הנחקר, והמיסו תמיסת aros בריכוז 7% במיקרוגל בעוצמה נמוכה. לאחר שה-aros המומס התקרר לכ- 50 °C, העבירו באיטיות בעזרת פיפט 5 mL של ה-agros לתבנית הפלסטיק המוכנה מראש כדי למלא את הבקבוקון.לאחר שה-aros התקרר במשך 30 עד 60 שניות והפך לחצי-מוצק, הכניסו את הגבעול לתוך המבחנה הממולאת ב-aeros. לאחר מכן, מקמו את המכסה המנוקב באופן שקצה הגבעול ייתמך על ידי המכסה. השאירו את המבחנה בטמפרטורת החדר או ב-4°C למשך 10 עד 30 דקות עד להתמצקות.הוצאו את התבנית על ידי החלקה עדינה שלה מתוך המבחנה. פתחו את ה-parafilm ולחצו בעדינות עם האגודל על החלק התחתון של חלק B של התבנית, כדי לשחרר את ה-aros שהתגבש מחלק A עלהית של זכוכית למיקרוסקופ. בצעו חיתוך באמצעות החלקה.חלקו את הגבעול המוטמע בטבעת לשלושה חלקים שווים בקירוב, באורך של 1.2 סנטימטרים כל אחד. גזרו את חלקי הגבעול שלא היו בתוך הטבעת והשליכם. ודאו שדיסק הדגימה נקי ויבש לחלוטין.השתמשו בנייר סופג רך כדי להסיר כל לחות מבלוק ה-aros המכיל את הדגימות. הניחו טיפה קטנה של דבק לרקמות על דיסק הדגימות. הניחו במהירות את בלוק ה-aros כך שהדגימות יהיו ניצבות לפלטה עבור חתכים רוחביים, או במקביל לפלטה.עבור חתכיםlongitudinal, יש להמתין עד שהדבק יקבע את הדגימה לדיסק הדגימה בטמפרטורת החדר או ב-4°C למשך 10 עד 30 דקות. קבע את דיסק הדגימה במקומו על מגש הבאפר או בתוך בלוק ה-aros כך שהחתכים יהיו מקבילים ללהב התער. מלא את מגש הבאפר במים מזוקקים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות יהיו שקועות לחלוטין.חתכו להניב תער לשניים ולאחר מכן גזרו את הקצוות במספריים חזקים כך שהלהב יישאר שטוח לחלוטין. חברו חצי אחד מהלהב שחולק למחזיק הסכין. הגדירו את הזווית במחזיק הסכין ל-84 מעלות, את המהירות ל-0.90 millimeters per second ואת התדר ל-50 hertz.חתכו את הפרוסות לעובי של 100 micron באמצעות מצב רציף (continuous mode). אספו את הפרוסות בעזרת פיפט פלסטיק חד-פעמי במהלך החיתוך במגש הבופר. העבירו מספר פרוסות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר לצביעת fluorol.העבירו את חתכי הגבעול למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו למבחנה 1 ml של תמיסת הפלורול וסגרו אותה מיד. מכיוון שחומצה ההידרוכלורית בצבע הפלורו-גלוקנול היא קורוזיבית מאוד, הניעו את המבחנה בעדינות כדי להבטיח שכל החתכים נצבעו.העבירו בעדינות את החתכים באמצעות קצה של פ pipette חתוך אל על זכוכית של מיקרוסקופ. כסו את החתכים בזכוכית כיסוי. בחנו את החתכים תחת תאורת שדה בהיר (brightfield).התמיסה מתייבשת תוך חמש עד 10 דקות, דבר הגורם להידרדרות של הדגימות. לכן, יש להשלים את הדמיון תוך פרק זמן זה. לצביעה רעה, העבירו את חתכי הגבעול למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה.הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת אשלגן פרמנגנאט 0.5% למבחנה המכילה את החתכים. שאבו והניחו בעדינות את תמיסת אשלגן הפרמנגנאט 0.5% באמצעות פיפט, רצוי מבלי להפריע לחתכים. לאחר דקותיים של דגירה וחזרה על פעולת השאיבה, המתינו עד שכל החתכים ישקעו בתחתית מבחנת המיקרו-צנטריפוגה.באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, שאבו 700 µL של תמיסת Potassium permanganate בריכוז 0.5%, והוסיפו 700 µL של מים מזוקקים כדי לשטוף את ה-potassium permanganate. חזרו על הפעולה שלוש עד ארבע פעמים או עד שהתמיסה המימית תישאר צלולה. לאחר השלכת המים, הוסיפו במהירות מיליליטר אחד של 3% hydrochloric acid עד שהצבע החום כהה ייעלם מהחתכים.דבר זה עשוי לקרות תוך שלוש עד חמש דקות, או שייתכן שיידרשו שתי שטיפות של חמש דקות כל אחת. שאבו החוצה את כל תמיסת ה-3% hydrochloric acid והוסיפו מיד מיליליטר אחד של תמיסת ammonium hydroxide מרוכזת. לפני הדמיה בתאורה מסוג brightfield לצביעת Congo red, העבירו את חתכי הגבעול למבחנת מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת 0.5% Congo red.העבירו בעדינות את תמיסת ה-Congo red בריכוז 0.5% למעלה ולמטה בעזרת פיפט, מבלי להזיז את החתכים. לפני דגירה ושטיפה של החתכים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, העבירו בעדינות את החתכים באמצעות קצה פיפט חתוך אל על גבי זכוכית מיקרוסקופ. לאחר מכן, כסו אותם בעזרת כיסוי זכוכית.בחן את הדגימות תחת המיקרוסקופ. הזז את הפלטה תחת עירור של אור כחול באמצעות מסנן פליטה של 560 nanometer עבור צביעת calcior white. העבר את חתכי הגבעול לפרוטוקול של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה והוסף 1 mL של תמיסת 0.02% calcior white.שאיף והזרק בעדינות את התמיסה בעזרת פיפטה למעלה ולמטה. המשך לדגירה ושטיפה של החתכים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב לפני תצפית בחתכים תחת אור UV. לצביעה ב-toluidine blue o, העבר את חתכי הגבעול לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת toluidine blue O בריכוז 0.02% למבחנה וערבבו בעדינות באמצעות פיפטה. לאחר מכן, דגרו ושטפו את החתכים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לפני תצפית עליהם בתאורה בשדה בהיר. עיינו בפרוטוקול הכתוב לפרטים על הגדרות המיקרוסקופ והמצלמה לצילום, וכן על תהליך הצילום באולטרה-סגול ובשדה בהיר.ניתן להדמיות של תרכובות ארומטיות, כולל הליגנין בתאים, באמצעות האוטופלואורסצנציה שלהן תחת תאורת UV. סיבי xylem וסיבי interf הראו אוטופלואורסצנציה תחת תאורת UV, אך לא ב-pith וב-cortex או ב-epidermis, מכיוון שליגנין ופולימר ארומטי מופקעים במהלך בניית תאים משנית; בעוד שצבע fluorol מגיב עם קבוצות קצה של אלדהיד בליגנין כדי להניב צבע ורוד או פוكسיה כפי שנצפה תחת תאורת UV. גוון פוكسיה נצפה ב-xylem ובסיבי interf, אך אינו קיים ב-pith וב-cortex או ב-epidermis.בדרך כלל, עוצמת הצבע תואמת לרמת ההליגניפיקציה באופן איכותני. נצבע ה-MALS ספציפי לזיהוי יחידות ליגנין מסוג ingal בתוך ה-xylem ובסיבי interf. צביעה באדום מעידה על נוכחות של יחידות ליגנין מסוג ingal באלמנטים של הליגנין.עם זאת, נצפה צבע אדום בהיר יותר בסיבים בהשוואה לרקמות xylem, מה שמעיד על כך שהסיבים מכילים רמה גבוהה יותר של ingal lignin, בעוד שה-xylem עשיר יותר ביחידות gua lignin. חתכי גבעול שנצבעו ב-calcior white נבחנו תחת אור UV והראו כי האפידרמיס, הקורטקס והליבה נצבעו, מכיוון שכל הרקמות הללו הכילו cellulose כפולימר פוליסכרידי עיקרי בדפנות התאים שלהן. חתכים שנצבעו ב-Congo red נבחנו תחת עירור של אור כחול, וצבעו אף הם את האפידרמיס, הקורטקס והליבה.בניגוד לסידן, צביעת Congo red הצביעה טוב יותר פוליסכרידים ב-xylem ובסיבי interf ונראתה פחות מושפעת מנוכחותו של lignin. Odine Blue O מסווג כצבע פוליכרומטי מכיוון שהוא גורם לדגימה רב-גונית. Odine blue O הוא צבע יוני נקשר לקבוצות בעלות מטען שלילי ומייצר צבעים שונים.כאשר הצבע נקשר לקבוצות יוניות שונות בתא, צביעת taine blue O של חתכי גבעול חשפה כי xylem וסיבים בין-צרוריים הם ליגניפיים, שכן הם מראים גוון כחול-ירקרק או כחול, דבר התואם את תוצאות ה-UV וה-fluoro glucan. כל תצפיות הצביעה, לעומת זאת, מראות כי רקמות הליבה (pith), הקורטקס והאפידרמיס מציגות גוון כחול-ירקרק או כחול מכיוון שלמרות שאינן ליגניפיות, הן מכילות פולימרים של פקטין בדפנות התאים שלהן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן חיתוך גבעולי צמחים וצביעה דיפרנציאלית של הרקמות השונות בדופן התא הצמחי באמצעות צבעים היסטוכימיים שונים.

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מתארים את טכניקת הצביעה של ויזנר להכתמת הליגנין הקיים בתאי צמח מיוחדים. טכניקת צביעה זו מסייעת לדמיין את דפנות התא המיושרות בגבעולי Arabidopsis thaliana ומסייעת לכמת את הליגניפיקציה בדפנות התא של סוגים שונים של תאים.

צביעת ויזנר להדמיית ליגנין: טכניקה להכתמת משקעי ליגנין הנמצאים בגבעולים של Arabidopsis thaliana

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת הצביעה של Maule להכתמת ליגנין מזרק הקיים בתאי הצמח המתמחים. טכניקת צביעה זו מסייעת לאפיין את התפלגות הליגנין בסיבים הקסילם והאינטרפשקולריים.

צביעת מאולה לליגנין: טכניקה לאפיון התפלגות ליגנין בקטעי גזע Arabidopsis thaliana

בסרטון זה, אנו מדגימים את שיטת הצביעה האדומה של קונגו כדי לדמיין משקעי תאית בקטעי גזע Arabidopsis thaliana .

צביעה אדומה של קונגו: טכניקה להמחשת משקעי תאית בקטעי גזע צמחיים

בסרטון זה, אנו מתארים הליך צביעה כדי לדמיין שקיעת תאית בתוך דפנות התא של Arabidopsis thaliana, צמח דיקוט, באמצעות calcofluor לבן, אשר נקשר במיוחד גלוקנים הקשורים β, מציג פלואורסצנטיות תחת אור UV.

צביעה לבנה Calcofluor: שיטה פשוטה להדמיית פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי UV של משקעי תאית בדפנות התא של קטעי גזע צמח דיקוט

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית ללוקליזציה של חלבוני אראבינוגלקטן (AGPs) ופקטין ברקמות צמחים. חלקי רקמת צמח קבועים ומשובצים שרף מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ומשניים פלואורסצנטיים ספציפיים ל-AGP ופקטין ובצבע פלואורסצנטי קושר תאית כדי לחשוף את הקולוקליזציה הספציפית לרקמה שלהם בדופן התא.

אימונולוקליזציה של חלבונים Arabinogalactan ו Pectins ברקמת הצמח

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לטעון את ה-CFDA לאתרים שונים של החלקים התחתונים של Arabidopsis. לאחר מכן אנו מציגים את דפוס ההתפלגות שהתקבל של CF ב נצרי.

שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.

אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

למד שיטות הכתמה היסטוכימית לחקר רכיבי דופן התא המשנית ב-Arabidopsis thaliana. הטכניקה כוללת הטמעה, חיתוך וצביעה למיקרוסקופיה, ומסייעת לחוקרים לחקור הרכב דופן התא בצמחים.

הכתמה histochemical של

גלה סרטונים נוספים