In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים
23 באפריל 2014
קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק קומפלקסים של חלבונים מעוברים חיים של drosohpila באמצעות גישה של קישור צולב (cross-linking) in vivo. זאת משיגים תחילה על ידי העמסת אלפי זבובים לכלוב אוכלוסייה ואיסוף עוברים בשלבים מוקדמים. לאחר מכן, החלבונים מקושרים באופן צולב in vivo באמצעות פורמלהיד, אשר מייצב את קומפלקסי החלבונים הפנימיים שלהם.
לאחר מכן, מכינים תמריתי חלבון מהעובריים שעברו קישור צולב (cross-linked), על מנת שניתן יהיה לבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של קומפלקס החלבונים. התוצאות מזהות את קומפלקסי החלבונים המבודדים באמצעות אנליזה של Western blot. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בידוד מסורתי של קומפלקסי חלבונים בגישות in vitro, הוא שגישה זו, המתבצעת in vivo, מאפשרת לנו ללכוד אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות אך משמעותיות מבחינה תפקודית, אשר עשויות שלא להיות מזוהות בשיטות in vitro מסורתיות.
את הטכניקה תדגים ד"ר Min Gao, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. ראשית, ערבבו מים ואגר fly באמצעות מוט ערבוב. עקרו תערובת זו במהלך מחזור האוטוקלאב.
ערבבו סוכרוז לתוך מיץ תפוחים וחממו זאת ל-70 °C על פלטה. לאחר מכן, חברו את התערובות והניחו להן להתקרר במשך 15 דקות לפני שהאגר יתגבש. הכינו methyl four hydroxy benzoate טרי באתנול.
זהו החומר המשמר. הוסיפו אותו לתערובת ההקשחה וערבבו במשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את התערובת לתוך צלחות פלסטיק או קלקר בגודל 300 square centimeter, תוך הקפדה שלא ייווצרו בועות.
יש להניח את הצלחותיות באחסון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ולהשתמש בהן תוך שבוע. יש להכין כלוב אוכלוסייה של 40 עד 50,000 זבובים ממנו ייאספו העוברים. יש להוסיף לכלוב האוכלוסייה שתי צלחותיות טריות ממולאות בתערובת קורנמיל ומולסס, כאשר על פני השטח מפזרים כארבעה גרם של שמרים למאפה.
אפשרו לזבובים לחיות על מצעים אלו למשך 48 שעות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. לאחר יומיים, פזרו כגרם אחד של שמרים על שני מצעי אגר עם מיץ תפוחים, והחליפו את המצעים שבכלוב האוכלוסייה במצעים אלו. לאחר שעה, החליפו את המצעים שבכלוב בשני מצעים נוספים מאותו סוג.
שתי פלטות האיסוף שבהן השתמשו הזבובים במשך שעה יכילוו עוברים. השהו את העוברים והמים על הפלטה והשתמשו במברשת כדי לסייע בניתוקם. לאחר מכן, שפכו אותם דרך נפה בעלת שתי שכבות.
השכבה העליונה היא רשת פלדה של 850 מיקרון, והשכבה התחתונה היא רשת פלדה של 75 מיקרון. העוברים יאספו על הרשת הדקה יותר, ויופרדו מהפסולת הגסה באמצעות מברשת צבע. העבירו את העוברים לסל רשת ניילון דקה העשוי מחלקו העליון של מבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר.
שטפו את העוברים במים וייבשו אותם ברשת כנגד נייר סופג. לאחר מכן, טבלו את העוברים בתמיסת bleach בריכוז 50% למשך שלוש דקות. סובבו אותם בתוך ה-bleach, ולאחר מכן שטפו אותם היטב במים וייבשו אותם בספיגה.
לאחר מכן טבלו את העוברים באיזופרופנול למשך כ-15 שניות. בעזרת סיבוב, פעולה זו תפרק את גושי העוברים, ואין לה להימשך יותר מ-30 שניות. ייבשו את העוברים בנייר סופג והעבירו אותם לתמיסת הפטן למשך חמש דקות.
העבירו לעיתים קרובות את ההפטן באמצעות פיפט מעל העוברי כדי למנוע מהם להידבק זה לזה, ייבשו את העוברי בעזרת נייר סופג ושטפו אותם ב-PBST. לאחר שטיפת העוברי במשך שלוש דקות, העבירו אותם על גבי הרשת למבחנה של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של PBST. הסירו את הרשת והשאירו את העוברי בתמיסה, וודאו כי נפח העוברי הוא בין 100 ל-300 מיקרוליטר.
המתינו לשקיעה לתחתית, שאבו את ה-PBST והמשיכו מיד לקשירה צולבת (cross-linking) של העוברים. ראשית, הוסיפו לעוברים 10 milliliters של 0.2% formaldehyde ב-PBST שהוכן טרי. הגדירו דגירה עם ערבוב עדין בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות של תגובה, המתינו שהעוברים ישקעו והסירו את התמיסה. לאחר מכן, החליפו במהירות את התמיסה ב-10 מיליליטר של גליצין בריכוז 0.25 מולרי ב-PBST כדי לעצור את התגובה. כוונו את המבחנה להטלטול למשך חמש דקות נוספות. לאחר עצירת התגובה, הסירו את התמיסה ושטפו את העוברים שלוש פעמים, תוך שימוש ב-10 מיליליטר של PBST לכל שטיפה.
הסיר את שארית ה-PBST באמצעות שאיבה בפיפטה ואחסן את העוברים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בהם. באמצעות הומוגנייזר ידני ושני מיליליטר של lysis buffer, בצע הומוגניזציה ל-500 מיקרוליטר של עוברים מקושרים (cross-linked). פעולה זו דורשת כ-15 תנועות עם פסטל הדוק.
העבירו את הלייזט (lysate) לפרועת מיקרו-צנטריפוגה והניחו אותה בערנוער (rocker) לערבוב עדין למשך 15 דקות. לאחר מכן, הצנטריגו את הלייזט ב-16,000 GS למשך חמש דקות. העבירו את עלה המרקע (supernatant) לפרועת 15 מיליליטר.
ניתן להשליך את המשקע. כעת, למעלה-לסנן (supernatant), יש להוסיף 40 µL של תרחיל חרוזי anti-HA. הגדירו את המכשיר לערבוב בעדינות (rocking) למשך כ-2.5 שעות, עד להשלמת הצמידות לחרוזים (bead conjugation).
שקע את החרוזיים ב-2,500 Gs למשך חמש דקות. השאר כ-250 microliters של נוזל על (supernatant) בשפופרת וסבב מחדש את החרוזיים בתוכו. העבר את החרוזיים התלוים למסנן של 10 micron בעמודת ספין (spin column).
הסר את התמיסה באמצעות סבב ריכוז (spin) של עשר שניות ב-12,000 Gs. שטוף את החרוזים בעמודה עם 200 µL של תמיסת שטיפה (wash buffer) ובצע סבב ריכוז נוסף. חזור על פעולה זו שלוש פעמים בסך הכל. לאחר מכן, הוסף 40 µL של תמיסת אלוציה (elution buffer) לחרוזים והדגר אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.
נער את המבחנה בעדינות מדי חמש דקות במהלך תקופה זו כדי לאסוף את התוצר. סבב את העמודה פעם נוספת ב-12,000 GS למשך 10 שניות. יעילות הקישור הצולב (cross-linking) ושל טיהור קומפלקסים של שני חלבונים מקושרים נותחו באמצעות SDS page על ג'ל מדורג של 3% עד 7%, ולאחריו western blot. עוברים המבטאים תג HA וחלבון GFP שימשו למעקב אחר מידת הקישור הצולב ולבדיקת ריכוזי פורמלהיד שונים עבור הפרוטוקול.
רוב ה-GFP בעוברים המטופלים לא עבר קשירה צולבת, ולכן תהליך זה לא התרחש. קומפלקס שתי חלבונים שנקשר בצורה אקראית הושווה לביקורת ללא קשירה צולבת. שתי חלבונים שלא עברו קשירה צולבת נראים כפס ב-285 kilodalton הנודד בחופשיות.
החלבון שקישר באופן צולב (cross-linked) כבד יותר ונדרד (מיגריציה) פחות בליסאט של חלבון גולמי. כמחצית מהחלבון השני שקישרה באופן צולב עם שותפיו האינטראקטיביים in vivo. השותפים האינטראקטיביים שחולצו באמצעות פפטיד HA, בהשוואה לכך, הכילו הן את הקומפלקס והן את החלבון החופשי בפרקציית האלוציה, לאחר שטיפת החרוזים.
לאחר הסרת ה-SDS, נשאר בעיקר נפח חופשי במבחנה עם כמות מינימלית של קומפלקס-מבחנה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ספקטרומטריית מסות, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לשיטות כגון זיהוי רכיבי החלבון בקומפלקסים המבודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לבידוד קומפלקסים חלבוניים טבעיים מעוברים של Drosophila באמצעות גישת קישור צולב (cross-linking) in vivo. הטכניקה מאפשרת ללכוד אינטראקציות חלבוניות חולפות החיוניות לתפקודים תאיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- ביוכימיה של חלבונים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- קומפלקסים חלבוניים רב-רכיביים חיוניים לתפקודים תאיים שונים.
- שיטות מסורתיות עלולות להחמיץ אינטראקציות חלבוניות חולפות.
- קישור צולב (cross-linking) in vivo מציע דרך לייצב אינטראקציות אלו.
- עוברים של Drosophila משמשים כמודל לחקר קומפלקסים חלבוניים.
מטרת המחקר
- בידוד קומפלקסים של חלבונים מעוברים חיים של Drosophila.
- שימוש בקישור צולב (cross-linking) in vivo ללכידת אינטראקציות חולפות.
- ניתוח המבנה והתפקוד של קומפלקסים של חלבונים אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העמסת זבובים לתוך כלוב אוכלוסייה לצורך איסוף עוברי שלב מוקדם.
- ביצוע קשירה צולבת (cross-linking) של חלבונים in vivo באמצעות פורמאלדהיד.
- הכנת תמציות חלבון מעובריים שעברו קשירה צולבת.
- ביצוע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של קומפלקסים חלבוניים לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של קומפלקסים חלבוניים מבודדים באמצעות אנליזת Western blot.
- הדגמה של יעילותו של קישור צולב (cross-linking) in vivo.
- לכידה של אינטראקציות חולפות בין חלבונים.
- השוואה עם שיטות in vitro מסורתיות המדגישה את היתרונות.
מסקנות
- הגישה האינ-ויו (in vivo) עדיפה לחקר אינטראקציות דינמיות של חלבונים.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של תפקודי קומפלקסים של חלבונים.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש בטכניקה זו עבור אורגניזמים אחרים.
שאלות נשאלות שכיחt
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
לכידה של אינטראקציות חולפות בין חלבונים בסביבות תאיות טבעיות נותרת אתגר קריטי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים. גישה זו של קישור צולב (crosslinking) in vivo מאפשרת ייצוב של קומפלקסים לא יציבים ישירות בתוך עוברים של Drosophila, ובכך משמרת אינטראקציות רלוונטיות פיזיולוגית שעלולות ללכת לאיבוד במהלך ליזיס קונבנציונלי. השיטה תומכת במאמצי גילוי מוקדמים על ידי אספקת ייצוג מדויק יותר של הרכב הקומפלקס האנדוגני, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בהערכת מטרות במורד המסלול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ייצוב של קומפלקסים חלבוניים חולפים לצורך אנליזה פונקציונלית.
- ערך תפעולי: מפחית תוצאות שגויות שליליות בתיקוף מטרות (target validation) על ידי לכידה של אינטראקציות שפספסו במבחנה (in vitro).
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות שימור המבנה המקורי של הקומפלקס במערכת מודל הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מהסוכים המתאימות לתיקנון של בדיקות ולבדיקת הדירות.
- ערך תפעולי: מייצר פלטים כמותיים באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ומספקטרומטריית מסות לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- ערך מדעי: משפר את המוכנות לסריקה על ידי אספקת קריאות של מעורבות מטרה (target engagement) הדומות למצב טבעי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות הרלוונטיות למחלות על ידי בידוד קומפלקסים מעוברים מתפתחים, המשמשים כמודל לתהליכים תאיים שמורים.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף מהשלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני באמצעות שמירה על שלמות הקומפלקס.
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי קישור מעורבות המטרה לתוצאות תפקודיות בהתפתחות קו הנבט.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד במקרים שבהם אינטראקציות חולפות משפיעות על התאמת המטרה. היא משלימה סינון פנוטיפי על ידי אספקת הקשר מכניסטי לפנוטיפים שנצפו.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי בידוד קומפלקסים טבעיים בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות בידוד הדיר מערכת של קומפלקסים המיוצבים על ידי קשירה צולבת (crosslinking).
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות באמצעות Western blot ומספקטרומטריית מסות להשוואת הרכב הקומפלקס בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי חשיפת רשתות אינטראקציה שמורות במודל הניתן לטיפול גנטי.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לבידוד קומפלקסים ברקמות ובאורגניזמים מגוונים לאחר התאמה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות מטרה.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות שלבי קישור צולב וכיבוי מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי חשיפת אינטראקציות חולפות שעשויות להעיד על רלוונטיות תפקודית.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על יציבות קומפלקס טבעית ועוצמת אינטראקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברים, בכימיה של קשירה צולבת (crosslinking) ובטכניקות של שיקוע חיסוני (immunoprecipitation).
- תלוי בגישה לציוד הומוגניזציה, צנטריפוגה וסינון להכנת הליזט.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוז הפורמלהיד, תזמון הנטרול (quenching) ועוצמת השטיפה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על רקמות שאינן עוברים או על מערכות מודל חלופיות.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון פוטנציאל לקשירה צולבת מוגברת בריכוזי פורמלהיד גבוהים, העלולה למסך אפיתופים או להפריע לאלוציה.
