לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הדמיה אימונופלואורסצנטית תוך חיונית של האוזן של עכברים נושאי מלנומה כדי לחקור את הדינמיקה של רכיבי המטריצה של רקמת הגידול. זה מושג על ידי חיסון ראשון של אוזן עכבר עם GFP המבטא תאי מלנומה B 16 F 10. לאחר מכן מבוצע ניתוח באוזן העכבר על מנת להפריד את הגחון מעור האוזן הגבית ולחשוף את רקמת הגידול.

לאחר מכן מבוצע צביעה חיסונית על הרקמה החשופה של האוזן הגבית. לבסוף, החיה מוכנה להדמיה תוך חיונית. בסופו של דבר, מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה מרובת פוטונים משמשים להצגת לוקליזציה והתנהגות דינמית של תאי גידול ומרכיבי המטריצה שלהם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות הדמיה חיה אחרות הוא שאנו יכולים לדמות את האינטראקציות הדינמיות של תאי הגידול עם התאים הקשורים לסטרומה כגון תאי חיסון, אך זה בהקשר של סיבית ורשת כמו מטריצה חוץ-תאית. אז שיטה זו יכולה לעזור לך לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הגידול, כגון כיצד תאי גידול מתקשרים עם המיקרו-סביבה הפיזית שלהם, מה שבתורו עשוי לספק תובנות חשובות לגבי אופן התקדמות הגידולים. חלק מההליך יודגם על ידי ויטה קי, מדען בכיר במעבדה שלנו כדי להכין תאי גידול להזרקה התחל בתרבית תאי מלנומה B 16 F 10 GFP.

לאחר הצנטריפוגה התאים מעבירים אותם לצינור איינור של 1.5 מיליליטר ומסתובבים שוב, מסירים את כל הסופרנטנט מלבד שכבה דקה של מדיום שנשארת ממש מעל הגלולה, משהים מחדש את התאים לתוך תמיסת תאים עבה ליד כדי להעמיס את תמיסת התא לנפח של 10 מיקרוליטר. מזרק המילטון. הסר את מכסה הקצה ממחט מחוברת בגודל 33 וטען 20 מיקרוליטר של התרחיץ על גבי תא הקצה.

לאחר מכן משוך לאחור את הבוכנה עד שחמישה מיקרוליטרים של slurry נטענים בתוך המזרק. לאחר הרדמה של עכבר C 57 Black Six בהרדמה הניתנת להזרקה, יש לגלח את ראש העכבר, לסדר את השערות על הראש וסביב האוזן ולשטוף במים. בעזרת סרט דבק, קבע את הקצה הפרוקסימלי של האוזן בקצה האצבע המורה.

הכנס את מחט המזרק של המילטון בין הדרמיס הגבי לסחוס האוזן של עכבר C 57 שחור שש החודר לאוזן פרוקסימלי לדיסטלי למשך כשניים עד שלושה מילימטרים. הזרקו את תמיסת התאים והסיגו לאט את המחט מהעור. תן לתאי הגידול ליצור גידול מוצק במהלך שבעה עד תשעה ימים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול.

לאחר שימוש בתערובת של חמצן לח ואיזו פלואור כדי להרדים את העכבר, הנח את העכבר על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס ובצע צביטה עדינה בבוהן. כדי לוודא שהחיה מורדמת מספיק. מרחו משחה עיניים על העיניים והשאירו את העכבר על כרית חימום מבוקרת תרמיסטור רקטלי לאורך כל ההליך.

לאחר מכן, הנח בעדינות את האוזן הנושאת את הגידול על ערימת שקופיות זכוכית. לאחר מכן השתמש ברצועות קטנות של סרט דבק כדי לקבע את הקצוות הקדמיים והאחוריים של האוזן לערימה באמצעות אזמל, חתוך את עור הגחון של האוזן לאורך הסליל האנטי של אפרכסת העכבר. הסר את הקלטות מהאוזן בעזרת פינצטה מעוקלת.

מקלפים בעדינות את הדרמיס הגחוני ואת הסחוס מהדרמיס הגבי. השתמש במאגר הצלצול כדי לשטוף את האוזן כדי לבצע צביעה אימונו-פלואורסצנטית. החל נוגדנים ראשוניים המכוונים למולקולות מטריצה חוץ-תאיות בחסימת מאגר לאוזן החשופה, והנח החלקת כיסוי מעל.

יש לדגור במשך 15 דקות לפני השימוש בכחמישה מיליליטר של חוצץ צלצולים כדי לשטוף את האוזן פעמיים. החל נוגדנים משניים מתאימים או סטרפטוקוס עדן בחסימת מאגר. מרחו תלוש כיסוי ודגרו למשך 15 דקות לפני הכביסה פעמיים כמו קודם, קפלו את אזור העור הפתוח לתוך EM mencia conki והשתמשו במגבונים סטריליים לייבוש דרמיס האוזן החיצוני שלא נפתח.

הניחו את האוזן על ערימת שקופיות זכוכית ומרחו 0.5 מיקרוליטר של דבק כירורגי על קצוות הגב הקדמיים והאחוריים כדי לשתק אותה להדמיה לטווח קצר של שעתיים או פחות. הוסף סטרילי טרי שהוכן כשצלצולי ספיגה חוצצים על גבי האוזן המשותקת ומרחו פתק כיסוי. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם שתי עדשות כדי לצלם את האוזן.

להדמיה ארוכת טווח. הנח את יציאת המחט המחוברת למאגר המכיל צלצולי ספיגה מתחת להחלקת הכיסוי במרחק של כ-0.5 סנטימטרים מהאוזן. השתמש במשאבה פריסטלטית במהירות של מיקרוליטר אחד לדקה כדי להעביר כל הזמן את המאגר לתא.

פתח את תוכנת הרכישה. התאם את עוצמת הקרינה של הרווח, ההגדלה ותמונת זמן החשיפה, מספר שדות המכילים תאי גידול, כמו גם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוכתמים לביצוע הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופיה מרובת פוטונים עם שומן סיליקון. החל מבסיס האוזן.

בנה קיר עגול בקוטר של כשני סנטימטרים ובגובה של שניים עד שלושה מילימטרים סביב האוזן. מלאו את העיגול בצלצולי ספיגה. הנח את העכבר על הבמה על כרית חימום, מכוון ל -37 מעלות צלזיוס והגדר את הגדרות המיקרוסקופ בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג באיור זה, ניתן להבחין במבנים רבים על סמך המורפולוגיה שלהם לאחר צביעה חיסונית. עבור רכיבי ממברנת הבסיס כגון קולגן ארבע או פרוליאן, והכי חשוב, חלבונים מבניים שבדרך כלל לא ניתן לזהות על ידי SHG. ניתן לדמיין את שיטת זיהוי המטריצה הקלאסית.

לדוגמה, מצאנו כי עשרות ו-C מופקדים במקומות שונים של סטרומה גידולית מכוחות קולגנים פיברילריים המתפתחים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול עשויים להוביל להתרחבות או התכווצות של מטריצת הגידול, וכתוצאה מכך, עיצוב מחדש של כלי הדם של הגידול בדומה לריפוי פצעים. כאן אנו מראים שאנו יכולים לבצע שני מיקרוסקופ זמן-lapse של פוטונים, תוך הדמיה של טנאס עם תווית חיסונית ומטריצת C עם הלבנת פוטו מינימלית של ארבע פלואור, אפילו בצפיפות פוטון גבוהה למיקרוסקופ פוטונים. בסרטון זה, תאי גידול שהיו מונחים על הדרמיס החשוף שנצבע מראש לקולגן ארבע נדבקו לרקמה ובקבוצות החלו לנדוד באופן קולקטיבי לאורך קרום הבסיס של כלי הדם ואתרי השומן.

לאחר ששולטים בכל ההליך של פתיחת האוזן והצביעה החיסונית לוקח שעתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע צביעה חיסונית תוך-חיונית כדי לחקור אינטראקציות מטריצת תאים בגידולים באמצעות אפי פלואורסצנטי או מיקרוסקופ שני פוטונים.