Name: מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: למד מדידת pH סימולטנית בחלליות אנדוציטיות ובציטוזול בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה משתמשת בחיישני pH HPTS ו-SNARF-1 לניתוח דינמיקה תוך-תאית בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ז'יל דופואה על הקריאה הביקורתית של כתב היד. 
מימון
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מענק # MOP-126173. C.M.D הוא חבר ב-Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) הממומן על ידי Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

1. הכנה של פתרונות לסלולריים pH כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את התרכובות הבאות לחמישה צינורות נפרדים 50 מיליליטר חרוטי להכין פתרונות 5 לשמש לכיול: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaCl (1 מיליליטר של 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0.58 גרם ב10 H מיליליטר 2 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KCl (6.75 מיליליטר של 1 M KCl) (1 M KCl = 0.75 גרם ב10 H מיליליטר 2 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוקוז (1 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז) (1M D-גלוקוז = 1.80 גרם ב10 H מיליליטר 2 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgS0 4 (0.05 מיליליטר של 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1.20 גרם ב10 H מיליליטר 2 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 HEPES מ&quot;מ (1 מיליליטר של 1M HEPES) (1 M HEPES = 2.38 גרם ב10 H מיליליטר 2 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl 2 (0.05 מיליליטר של 1M CaCl 2) (ז גרם CaCl 2 = 1.47 1 ב10 H מיליליטר 2 0) הכן את כל הפתרונות במזוקקים H 2 O (DDH 2 O) הכפול. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים כל פתרון עם 35 מיליליטר של DDH 2 O ולערבב עם בוחש מגנטי עד כהlution מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של כל פתרון עם 1 N KOH או 1 N HCl להשיג ערכי ה-pH של 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ו7.5. לאחר מכן, להתאים את עוצמת הקול עם מים deionized נפח סופי של 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד 5 מ&quot;ג של nigericin ולהוסיף אותו ל670 μl של EtOH המוחלט להכין 10 מ&quot;מ nigericin פתרון מניות. זהירות: nigericin הוא רעיל מאוד ויש לטפל בם בזהירות רבה (כפפות, משקפי מגן ומסכה). מערבבים את הפתרון על ידי היפוך עד nigericin הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.05 מיליליטר של 10 מ&quot;מ nigericin (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) לכל פתרון כיול. Nigericin הוא ionophore שמגביר את חדירות קרום תא וגורם לאיזון של רמת חומציות תוך תאית וחוץ תאי בנוכחות ריכוז depolarizing של תאי K +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאחסן את פתרונות כיול לחודש 1 על 4 מעלות צלזיוס </li></ol> 2. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת safet ביולוגימכסה המנוע y, תאי זרע ב35 מ&quot;מ מנות תרבות x 10 מ&quot;מ 2 מיליליטר של מדיום גידול בתוספת 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה. השתמש בכמות התאים הדרושה כדי להבטיח מפגש 50 כ% לאחר 24 שעות. הערה: בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו HT-1080 התא וצלחת 1 x 10 5 תאים לכל צלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר מנות התרבות הדרושה לניסוי וצלחת 5 מנות תרבות נוספות שמשמש לכיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות תרבות המקום בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות לפחות 24 שעות. </li></ol> 3. הכנת בדיקות pH חישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 1M של חללית ה-pH ניאון 8-hydroxypyrene-1, 3,6 חומצת trisulfonic, מלח trisodium (HPTS / pyranine) בDDH 2 0. פתרון זה חייב להיות מאוחסן ב RT ומוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של 1 מ&quot;מ 5 - (ו- 6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethyl אסטר אצטט (C-snarf-1 בבוקר, נקרא thereaחרי snarf-1) על ידי המסת 1 מ&quot;ג של snarf-1 ב1.76 מיליליטר של DMSO. לערבב ביסודיות על ידי pipetting חוזר ונשנה. פתרון snarf-1 חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור. </li></ol> 4. תיוג תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישה עשר שעות לפני ההדמיה לחיות תאים, להוסיף 2 μl של פתרון מניות 1M HPTS (ריכוז סופי 1 מ&quot;מ) לכל מנה תרבות המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הכלים התרבות לחממה. הבדיקה HPTS היא תא impermeant, ולכן לתווית האברונים הבדיקה חייבת להיות נלקחת על ידי pinocytosis. מצב זה מחייב את incubations תא עם HPTS מבוצע במדיום תרבות, בתוספת סרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם HPTS, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא לפחות 2 שעות. דגירה עם snarf-1 צריכה להתבצע במדיום סרום ללא בגלל סרום עלול למנוע הספיגה של החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון מניות snarf-1 1 מ&quot;מ להשיג afריכוז inal של 5 מיקרומטר ולאפשר לתאי דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס, באור עמום. ריכוז C-snarf-1 וזמן דגירה יכולים להשתנות בהתאם לסוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, לשטוף תאי פעמים PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום ללא סרום. </li></ol> 5. תוספת של מאפנני pH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך האם השיטה יכולה לזהות שינויי pH בתאים, חומרים כימיים שונים המווסתים pH תאיים ניתן להשתמש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bafilomycin A1, מעכב ספציפי של V-ATPase 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזופורם מחליף Na + / H + 1 (NHE-1) 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NH 4 Cl, בסיס חלש, שמגביר את רמת חומציות תוך תאית 7 </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות של חומרים כימיים שהוזכרו לעיל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bafilomycin A1: להוסיף 10 מיקרוגרם של bafilomycin A1 ל160 μl של DMSO להשיג פתרון מניות של 100 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EIPA: להוסיף 25 מ&quot;ג EIPA ל1.67 מיליליטר של מתנול לobtaiריכוז סופי na של 50 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NH 4 Cl: לפזר 0.53 גרם של אמוניום כלוריד ב10 מיליליטר של DDH 2 O להשיג ריכוז סופי של 1 מ&quot;מ. </li></ul> הערה: כל פתרונות המניות חייבים להישמר על 4 מעלות צלזיוס למעט A1 bafilomycin אשר חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרבות מנות נפרדות, מוסיף אחד מהחומרים הכימיים כמפורט להלן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 μl של 100 bafilomycin מיקרומטר A1 (ריכוז סופי 100 ננומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 μl של 50 מ&quot;מ EIPA (מיקרומטר ריכוז 25 הסופי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 μl של 1M 4 Cl NH (ריכוז סופי 20 מ&quot;מ) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 30 דקות ב37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לרכישת תמונה. </li></ol> 6. מפרט של מיקרוסקופ Live-תא ההדמיה והגדרות רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה לחיות תאים באמצעות מטרת 40X רכוב על microsco סריקה הפוכה רפאים confocalpe מצויד בשלב XY ממונע, חדר שיכול להכיל מנות תרבות תחתית זכוכית בחממת במה (טמפרטורה, לחות, CO 2) מבוקרת לסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר confocal (אולימפוס FV1000) משמש כאן מצויד ב: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ננומטר 405 לייזר דיודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר ארגון 40 mW (458 ננומטר, 488 ננומטר, 515 ננומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר ניאון הליום (543 ננומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת פלואוריט 10X, NA0.4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת שמן PLAPONSC תכנית APO 60x, NA1.4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DM מראה dichroic 405/458/488/543 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDM 560 וSDM 640 מסננים dichroic </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מחסום BA655-755 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BS20/80 מפצל קרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנה לניתוח נתונים לרכישת תמונה וניתוח, </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע חממת השלב התחממה ל37 מעלות צלזיוס ומיקרוסקופ מוגדר, מניח צלחת תרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1 לחדר ההדמיה שלב confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חרי איתור שטח של עניין, התאם את הגדרות רכישת תוכנת איור 1. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שני סטי ערוץ וירטואליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את השלב הראשון שמתאים לעירור HPTS ב405 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 570-600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את השלב השני שמתאים לעירור HPTS ב458 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 640-650 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצם confocal מוגדר 175 מיקרומטר כברירת מחדל וצמצם אופטימלי צריך להיות מוגדר באופן ידני ב300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונה על ידי ערמת חלקים סידוריים אופקיים אופטיים (800 800 פיקסלים) של 0.4 מיקרומטר עובי. </li></ul></li></ol> הערה: מטרת 40X היא שימושית כדי לבחון כמה תאים בו זמנית ועובדת היטב לצפייה אברון. עם זאת, ברזולוציה מרחבית ועוצמת אות הן בטr המושג באמצעות אובייקטיבי שמן 60x. בנוסף, אין שום עירור או פליטת הצטלבות בין שני הצבעים. 7. כיול של בדיקות pH חישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכיול, להסיר בינוני ממנת התרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1, לשטוף פעמיים עם PBS סטרילי ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של אחד מפתרוני הכיול חמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות לתוך תא שלב confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לרכישת הזמן לשגות תמונה בהתאם להגדרות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר התמונות ופעמים משך מרווח לניסוי. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל מרווח 1 דקות בין תמונות עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את התריס כדי לסגור בין הרכישה של כל תמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקרינה לדקות בתוכנת גיליון אלקטרוני ולקבוע את הזמן שבו עוצמת הקרינה היא יציבה. ה-pH תאיים היא בדרך כלל יציבה לאחר 15-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> REPEAT צעדים 7.1-7.4 באמצעות צלחת תרבות חדשה עבור כל פתרון כיול הנותר. </li></ol> 8. רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכיול נעשה, לרכוש נתונים לדוגמה 4-5 שדות שנבחרו באקראי המכילים 15-20 תאים לכל תחום. שתי תמונות מתקבלות עבור כל שדה: אחד לתיוג HPTS (שלפוחית) והשני עבור תיוג snarf-1 (cytosol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרינה רקע (אזור תאי) היא הופחתה באופן דיגיטלי מתמונות ניאון של שני הבדיקות. שלפוחית ​​שהכותרת וcytosol מהתמונות המאוחסנות שלהם נבחרו באמצעות מסיכה בינארי. עבור כל בדיקה pH חישה, עוצמות הקרינה נמדדות בקנה מידה מספרי (0-4,095 קנה מידה ברמה אפורה). עוצמה ממוצעת של כל הפיקסלים באברון או ציטופלסמה מחושבת וערכים משמשים לחישוב יחס הקרינה. </li></ol> 9. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבילות תוכנה שונות זמינות באופן מסחרי לניתוח נתונים. כלומרתוכנת FluoView. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיליון אלקטרוני, ערכי שיא ולחשב יחס הקרינה באופן הבא: במקרה של HPTS, R = (F 458 ננומטר / F 405 ננומטר), ובמקרה של snarf-1, R = (ננומטר F 644 ננומטר / F 584 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים מדעית כגון GraphPad פריזמה. העלילה צריכה לשרטט יחסי הקרינה (ציר ה-Y) כפונקציה של ה-pH (ציר ה-X). התאמת עקומות מושגת באמצעות רגרסיה שאינה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוצמות הקרינה של הדגימות כמתואר בשלב 8.2 ולחשב יחס הקרינה. השתמש עקומות כיול להפוך יחסים לערכי ה-pH. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

יש צורך במדידת pH כמותי בתחום ההדמיה לחיות תאים של תאים סלולריים שונים כדי למדוד במדויק את שינויי ה-pH בתגובות תא לאתגרים חיצוניים. עם זאת, אחד המכשולים העיקריים שנותר הוא בקלות ובאופן ספציפי כדי למקד את התאים סלולריים. מבחינה זו, מספר מחקרים הדגישו את השימוש בHPTS כאינדיקטור pH תאיים שהוכנס לתאים על ידי electroporation או microinjection 8-10. טכניקות אלה סובלות מחסרונות רציניים, כלומר electroporation גורם לניזקים רבים לתאים, וmicroinjection דורש ציוד מיוחד וכישורים טכנ...

<table><tbody><tr><td>פתרונות לכיול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז (דקסטרוז)</td> <td>פישר</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>פישר</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ניגריצין</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>רעיל בשאיפה או במגע עם העור</td></tr><tr><td colspan="4">שמור מוגן מפני האור בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>צלחות תרבית C וריקות 35 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr>בדיקות <td></td><td></td><td></td><td>חישת pH</td></tr><tr><td>8-הידרוקסיפירן-1,3,6-חומצה טריסולפונית (HPTS)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>H-348</td><td>הרחק מהאור בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>5-(ו-6)-Carboxy SNARF&reg;-1, אצטוקסימתיל אסתר, אצטט</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>C-1271</td><td>הרחק מהאור והלחות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>דימתיל סופוקסיד (DMSO)</td><td>פישר</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>מזיק</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>M-12445</td><td>20 גרם</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>פישר</td><td>S369-1</td><td>115 גרם</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 גרם</td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>הביאו ל-1 ליטר</td></tr><tr><td>חיטוי והתאימו את ה-pH ל-7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>L-11621</td><td>40.5 גרם</td></tr><tr><td>מים נטולי</td> מים <td>N/A</td><td>N/A</td><td>הביאו ל-5 ליטר</td></tr><tr><td>מאפנני</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-Ethyl-N-isopropyl) אמילוריד (EIPA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>פישר</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת ph בו זמנית בendocytic ותאי cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

pH התוך תאי מווסת היטב ודווח על הבדלים ב-pH בין הציטופלזמה לאברונים1. ויסות ה-pH התאי חיוני לבקרה הומאוסטטית של תהליכים פיזיולוגיים הכוללים: סינתזת חלבון, DNA ו-RNA, סחר שלפוחית, צמיחת תאים וחלוקת תאים. שינויים בהומאוסטזיס pH תאי עלולים להוביל לשינויים תפקודיים מזיקים ולקדם התקדמות של מחלות שונות2. קיימות שיטות שונות למדידת pH תוך תאי, אך מעט מאוד מהן מאפשרות מדידה בו זמנית של pH בציטופלזמה ובאברונים. כאן, אנו מתארים בפירוט שיטה מהירה ומדויקת למדידה בו זמנית של pH ציטופלזמי ואורגנלרי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על תאים חיים3. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בשני צבעים יחסיים עם חישת pH בעלי חלוקה סלקטיבית של תאים סלולריים. לדוגמה, SNARF-1 ממודר בתוך הציטופלזמה ואילו HPTS ממודר בתוך אברונים אנדוזומליים/ליזוזומליים. למרות ש-HPTS משמש בדרך כלל כאינדיקטור pH ציטופלזמי, צבע זה יכול לתייג באופן ספציפי שלפוחיות לאורך המסלול האנדוזומי-ליזוזומלי לאחר שנקלט על ידי פינוציטוזיס3,4. באמצעות בדיקות חישת pH אלה, ניתן למדוד בו זמנית pH בתוך התאים האנדוציטיים והציטופלזמיים. אורך גל העירור האופטימלי של HPTS משתנה בהתאם ל-pH ואילו עבור SNARF-1, אורך גל הפליטה האופטימלי הוא שמשתנה. לאחר העמסה עם SNARF-1 ו-HPTS, התאים מתורבתים בתמיסות שונות מכוילות pH כדי לבנות עקומת pH סטנדרטית עבור כל בדיקה. הדמיית תאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ביטול חפצים ורעשי רקע. בגלל התכונות הספקטרליות של HPTS, בדיקה זו מתאימה יותר למדידת התא האנדוזומי החומצי הקל או להדגמת אלקליניזציה של האברונים האנדוזומליים/ליזוזומליים. שיטה זו מפשטת את ניתוח הנתונים, משפרת את הדיוק של מדידות ה-pH וניתן להשתמש בה כדי לענות על שאלות בסיסיות הקשורות לאפנון pH במהלך תגובות התאים לאתגרים חיצוניים.

למדידה בו זמנית של ה-pH בשני תאית ותאי תאי endosomal / lysosomal, בדיקות ratiometric ניאון pH חישת snarf-1 וHPTS היו בשימוש. Snarf-1 מוגבל לתא cytosolic אילו HPTS מאפשר מדידת pH ratiometric של תא endosomal / lysosomal. תא טעינה עם HPTS ל16 שעות מאפשרת הלוקליזציה סלקטיבית שלה בendosomes / lysosomes 4. דוגמא אופיינית של הקרינה נרשמה מתאי HT-1080 עמוסים בבדיקות pH חישה מוצגת באיור 2 א. ראיות לכך שHPTS תוויות תאי שני endosomal וlysosomal הושגו על ידי שיתוף ...

קיימות מספר שיטות למדידת pH תוך-תאי, אך מעט מאוד מהן מאפשרות מדידה בו זמנית של pH ציטופלזמי ואורגנלרי. כאן, אנו מתארים בפירוט מתודולוגיה מהירה ומדויקת למדידת pH ציטופלזמי ושלפוחית בו זמנית על ידי הדמיה רציומטרית של תאים חיים.

מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד בו-זמנית את ה-pH הוויזקולרי והציטוזולי בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דגירה של התאים עם גששים למדידת pH, HPTS ו-SNF F1, המסמנים את מדורי האנדוזומים והליזוזומים ואת הציטוזול, בהתאמה. לאחר מכן, התאים מונחים בתא בעל סביבה מבוקרת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, והתוכנה מוגדרת למדידת הפלואורסצנציה של הגששים בתא.התאים מדוגרים עם תמיסות שונות המכויילות ל-pH. עקומת סטנדרט של pH נבנית באמצעות רגרסיה לא-ליניארית. משוואות אקספוננציאליות נקבעות עבור שני הגששים, ובהמשך משמשות להמרת עוצמות פלואורסצנציה של הדגימות לערכי pH.שיטה זו מאפשרת קביעת pH וסיקולרי וציטוזולי מדגימות לאחר טיפולים שונים, ויכולה לאפשר את חקר הוויסות של ה-pH התאי במהלך תהליכים ביולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות למדידת pH תוך-תאי הוא ששיטתנו מאפשרת מדידה של דינמיקת ה-pH התאי בתאים חיים תוך ביטול ארטיפקטים ורעשי רקע. במהלך הדמיה, את הפרוצדורה תדגים fess lucier, סטודנט לדוקטורט שפיתח שיטה זו. לצורך כיול ה-pH התאי, יש להכין סדרה של חמישה תמיסות בנפח 50 milliliter בטווח של pH 5.5 עד 7.5, במרווחים של 0.5.הוסף טיפה אחר טיפה של אשלגן הידרוקסיד רגיל או חומצה כלורית כדי לכוון את ערכי ה-pH. לאחר מכן, הוסף לכל תמיסה מכויילת pH כ-0.05 milliliters של IOR gersin. בריכוז של 10 millimolar עבור ריכוז סופי של 10 micromolar, ה-risin יעלה את חדירות ממברנת התא בנוכחות ריכוזים דפולריזטוריים של אשלגן חוץ-תאי. תחת מנדף, זרע תאים בצלחוני תרבית של 35 millimeter עם שני milliliters של מצע המכיל 10% fetal bovine serum ואנטיביוטיקה, במטרה להשיג 50% confluence לאחר 24 שעות של אינקובציה ב-37 degrees Celsius.לאחר זריעת כל הצלחות הנדרשות לניסוי, זרע חמש צלחות נוספות לצורך כיול. דגור צלחות אלו למשך 24 שעות, לאחר 24 שעות נוספות, ו-16 שעות לפני הדימות. למחרת בבוקר, כשלוש שעות לפני כן, הוסף שני µL של סמן האברונים HPTS בריכוז 1 M, כדי להגיע לריכוז סופי של 1 mM HPTS בתמיסה.לפני הדמיה, הסר את ה-HPTS על ידי ביצוע שתי שטיפות עם PBS. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטרים של מצע נטול סרום והשאר את התאים לדגירה למשך שעתיים נוספות לפחות.ממש לפני הדמיה, דגרו את התאים עם 5 µM snf, על ידי הוספת 10 µL של 1 mM snf, לאחר תקופת דגירה אחת של SNF. שטפו את התאים פעמיים ב-PBS והוסיפו 2 mL של מצע ללא סרום, ולאחר מכן המשיכו להדמיה של התאים.יש לבצע דימות של התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקה הפוכה ספקטרלית, המצויד בבמה ממוטרת ובתיבת סביבה. בעת שימוש בצלחות פטרי מפלסטיק, העדשה המתאימה ביותר היא 40x. יש להגדיר בתוכנה שתי קבוצות של ערוצים וירטואליים, ולהתאים את אורך גל העירור ואת אורכי גל הפליטה.עבור HPTS ו-SNF one, מפתח המיקוד (confocal aperture) מוגדר כברירת מחדל ל-175 microns, ויש להגדיר ידנית את המפתח האופטימלי ל-300 microns. לאחר שהתא התחמם ל-37 °C, התחילו את הכיול, שטפו את לוח התאים פעמיים נוספות באמצעות PBS, ולאחר מכן החליפו את המצע בתמיסת הכיול הראשונה. כעת הניחו את התאים בתוך התא וכיילו את שני הצבעים הרגישים ל-pH, תוך רכישת עד 30 תמונות בשיטת time lapse במרווחים של דקה אחת.ניתן לאסוף כל ערימת תמונות בעובי של 0.4 microns ובשטח של 800 square pixels. ובין התמונות, יש לתכנת את התריס להישאר סגור. יש להתרשם מעוצמת הפלואורסצנציה מדי דקה, אשר בדרך כלל תתייצב לאחר כ-20 דקות.מרגע שהפלורסצנציה התייצבה, צלם תמונות מארבעה או חמישה שדות המכילים 15 עד 20 תאים ואת שני הגששים. תמונות אלו ישמשו לחישוב העקומות. חזור על תהליך זה עבור כל תמיסת כיול.לאחר מכן, המשיכו בדימות של צלחות התנאי הניסיוני שאינן דורשות שטיפות. בניתוח של כל תמונה, ראשית, בצעו חיסור דיגיטלי של הפלואורסצנציה החוץ-תאית ברקע. לאחר מכן, בחרו וזיקולות מסומנות וציטוזול מהתמונות השמורות באמצעות מסכת בינארית. עבור כל גשש למדידת pH, עוצמות הפלואורסצנציה נמדדות בסולם שבין 0 ל-4,095.חשבו את עוצמת הממוצע עבור כל הפיקסלים באבניב או בציטופלזמה. באמצעות ערכים אלו, חשבו את יחסי הפלואורסצנציה עבור HPTS ועבור snf. עבור עקומות כיול, שרטטו את יחסי הפלואורסצנציה שהתקבלו עבור כל תמיסת כיול כפונקציה של pH; את התאמת עקומת הכיול יש לבצע באמצעות משוואה מעריכית.לבסוף, השתמשו בעקומות הכיול כדי להמיר את היחסים לערכי pH, ובכך להשיג ערכי pH ציטוזוליים וערכי pH של אבנים בתוך תאים חיים תחת תנאי הניסוי. ראיות ברורות התקבלו לכך ש-HPTS מסמן הן מדורים אנדוזומליים והן מדורים ליזוזומליים, באמצעות צביעה משולבת עם transferrin המצומד ל-Alexa 546 לצביעת אנדוזומים, או עם גשש פלואורסצנטי לליזוזומים, LysoTracker.תמונות time-lapse באורך גל אדום עמוק נאספו עבור כל גשש כפי שמתואר ב-HT 10 80 תאים. חמישה תמיסות כיול נבחנו לבדיקת יציבות גישת הפלואורסצנציה לאחר 15 דקות בתמיסות, כגון תמיסות pH 6 ו-pH 7.5. בעקומת הכיול עבור pH נתון, הנתונים מייצגים את היחס בין עוצמות הפלואורסצנציה ב-558 ל-405 ננומטר עבור HPTS או ב-644 ל-584 ננומטר עבור SNF 1. שתי העקומות הותאמו למשוואה מעריכית.יעילות השיטה בתאי HT 10 80 חיים הוערכה באמצעות अमोनियम כלוריד, בסיס חלש המעלה את ה-pH התאי. הבסיס העלה את ה-pH הן של הציטוזול והן של הוויזקולות. השיטה הוערכה גם באמצעות B mycin, A one, מעכב של va a TPAs. bamy, A one השרה alkalinitization של המדורים האנדוזומליים והליזוזומליים, אך לא שינה את ה-pH הציטוזולי.לבסוף, נבדק EIPA, מעכב של NHE 1. הוא חמצץ את הציתוזול עד pH של 6.62, אך לא השפיע על pH. נכון לעכשיו.המחקר של הומיאוסטזיס של ה-pH התאי הוגבל הן בשל שינויי pH מהירים המתרחשים בתוך תאים, והן בשל מחסור בכלים למשקוף ה-pH בתוך התאים. אנו מתארים היום גישה פשוטה שלב-אחרי-שלב למדידה בו-זמנית של pH ציטוזולי ואנדוזומלי בתאים חיים בודדים. דבר זה חשוב במיוחד למחקר של הומיאוסטזיס של ה-pH התאי בתאים שבהם מוטציות או תרופות עשויות להשפיע על זרימת הפרוטונים פנימה והחוצה בתוך המדור האנדוזומלי.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מדגים מדידה סימולטנית של רמות סידן תוך-תאיות ושינויים בפוטנציאל הממברנה בתאי אנדותל של מקטעי עורק מוח עכברי. צינורית האנדותל המבודדת עמוסה במחוון סידן פלואורסצנטי ומטופלת בתרופה הגורמת לשחרור סידן תוך תאי, וכתוצאה מכך לשינוי בפוטנציאל הממברנה. הפלואורסצנטיות של המחוון מאפשרת מדידה של רמות הסידן, ואלקטרודת הקלטה מוחדרת לתא כדי למדוד שינויים בפוטנציאל הממברנה.

מדידה סימולטנית של פוטנציאל הסידן והקרום התוך-תאי באנדותל מוחי של עכבר

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

pH פגוזומי משפיע על התבגרות הפגוזומים, ייצור מחמצן, הרג פגוזומי וכן הצגת אנטיגן. כאן אנו מתארים שיטה רציומטרית למדידת שינויי pH במהלך הזמן ובנקודת הקצה בפאגוזומים בודדים בפגוציטים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדידת ה-pH והשטח הפגוזומלי וכן את ה-pH הציטופלזמי של נויטרופילים אנושיים ועכברים באמצעות האינדיקטור היחסי seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, או S-1. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים וניתוח תמונה.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

הפרוטוקול מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים בודדים. הפלטפורמה מודדת עד שלושה ציטוקינים במקביל (IL-6, TNFα ו-IL-1β) עבור כל תא בודד המגורה באמצעות ליפופוליסכריד כדוגמה.

גישה מיקרופלואידית לפתרון הפרשת ציטוקינים סימולטנית ורציפה של תאים רב-תפקודיים בודדים 

למד מדידת pH סימולטנית בחלליות אנדוציטיות ובציטוזול בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה משתמשת בחיישני pH HPTS ו-SNARF-1 לניתוח דינמיקה תוך-תאית בזמן אמת.

מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

גלה סרטונים נוספים