אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד הידבקות של חברת נויטרופילים באמצעות בדיקת תא זרימה המאפשרת הידבקות נויטרופילים אנושיים בנוכחות מתח גזירה. זה מושג על ידי הכנת מצע של מולקולות הידבקות מטוהרות או משטח תא אנדותל, כגון וריד טבור אנושי, תאי אנדותל או ve. השלב השני הוא הפרדת נויטרופילים מדם היקפי אנושי בשיטת צנטריפוגה דו-שכבתית הנקראת PHI.

לאחר מכן, תא הזרימה מורכב כדי לאפשר הזרקה של הנויטרופילים האנושיים המבודדים תחת לחץ גזירה על המצע של הידבקות, ליגנדים או ve. השלב האחרון הוא רישום אירועי הידבקות נויטרופילים בתא הזרימה, ולאחר מכן כימות זהיר של הידבקות מוצקה. בסופו של דבר, בדיקת תא הזרימה משמשת להצגת הידבקות איתנה של נויטרופילים לעבר מולקולות הידבקות מטוהרות ומשטח HX.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האוטואימוני, כגון חשיבות תפקודית של וריאציות גנטיות במולקולות רקמה הידועות כקשורות להתפתחות אוטואימוניות. מחקרים גנטיים בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית הראו קשר חזק עם וריאנטים ו-Abeta two integrin, חלבון המעורב בהידבקות של חברת נויטרופילים. פיתחנו מערכת בדיקה זו כדי להעריך את ההשלכות התפקודיות של שונות גנטית בבטא 2 אנדוקרינית זו הנקראת Mac one על הידבקות איתנה להכנת כלי התרבות לשימוש בתא הזרימה.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פיברין וג'לטין לכל צלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר ופיפטה מספר פעמים כדי לוודא שכל משטח הצלחת מצופה. הסר את עודפי הפיברונקטין ותמיסת הג'לטין וייבש את הצלחות באוויר למשך 30 דקות לפחות. כדי לייעל את היווצרות מטריצת החלבון, קצרו תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי או qve שעברו תרבית של 80 עד 90% באמצעות זרעי טריפסין EDTA 500,000 תאים לכל צלחת תרבית רקמה מצופה.

הוסף שני מיליליטר של מצע גידול לכל מנה ודגר בחום של 37 מעלות צלזיוס. יש לבדוק ויזואלית תאי CO2 של 5% מדי יום עם שינויים בינוניים כל יומיים. אפשר לתאים לגדול למפגש של 80 עד 90%.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בטוש או בעט כדי לצייר עיגול בקוטר 0.5 סנטימטרים במרכז צלחת צלחת תרבית רקמות בגודל 35 מילימטר. 20 מיקרוליטר של חלבון של 20 מיקרוגרם למיליליטר, תמיסה באזור המסומן. השתמש בקצה הפיפטה כדי להפיץ את החלבון, תמיסה לכיסוי כל האזור בתוך העיגול בקוטר 0.5 סנטימטר.

חשוב לא לגעת או לשרוט את פני המנה. דגרו את כלי תרבית הרקמה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, שטפו כל חלבון בצלחת מצופה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS.

לאחר הוצאת ה-PBS מצלחת הכביסה השלישית, 50 מיקרוליטר של 1% BSA באזור המסומן כדי לחסום כריכה לא ספציפית על הצלחת. דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אחרי שעתיים.

שטפו את הצלחת החסומה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. הכן את תמיסות החלבון הכימרי של קולטן ההדבקה FC לציפוי וניסוי זה ו-ICAM אחד FC Kyra ב-25 מיקרוגרם למיליליטר ו-P סלקטין FC Kyra ב-0.5 מיקרוגרם למיליליטר ישמשו. מצפים את האזור המסומן ב -50 מיקרוליטר מהמצע, דוגרים את כלי תרבית הרקמות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

יש להשתמש בכלים תוך יומיים ואין לאפשר לאזור המצופה להתייבש. במידת הצורך. הוסף PBS כדי לשמור על 50 מיקרוליטר התמיסה על הצלחת.

נויטרופילים למחקר זה מבודדים מדמם של משתתפים שנתנו הסכמה מדעת בכתב. לאחר איסוף דם על ידי פלבוטומיה לתוך צינור איסוף דם נוגד קרישה או ואקוטיינר, יש לדלל את הדם אחד לאחד עם PBS לבצע את כל השלבים בהליך זה. בטמפרטורת החדר, הכינו קריאת פיזיקה דו-שכבתית להפרדת תאים חד-גרעיניים בדם היקפי או p BMCs ונויטרופילים בצינורות צנטריפוגות של 50 מיליליטר.

ראשית, הוסף 15 מיליליטר של קריאת PHI כבדה ולאחר מכן שכב בזהירות 10 מיליליטר של קריאה קלה על גבי שיחת ה-Fi הכבדה. צריך להיות גבול חד בין שכבות ה-fi הקלות לשכבות ה-fi-call הכבדות. לבסוף, שכבו בזהירות 25 מיליליטר של דגימת הדם המדוללת על גבי קריאת האור מבלי להפריע ל-PHI.

התקשר לצנטריפוגה שכבת הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגה, שכבות מרובות צריכות להיות נוכחות. שכבת הנויטרופילים עם מעט כדוריות דם אדומות נמצאת בין ה-phi הקל לכבד. התקשרו באמצעות קציר פיפטות העברה והעבירו את שכבת הנויטרופילים לצינור חדש של 50 מיליליטר והוסיפו PBS לנפח סופי של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה ב 225 פעמים G למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגה, עדיין עשויים להיות כדוריות דם אדומות מעורבבות עם הנויטרופילים. שאפו את הסופרנטנט עד ל-10 מיליליטר.

מארק רסוס. השעו את כדור כדוריות הדם האדומות של הנויטרופילים על ידי מערבולת קצרה במהירות נמוכה ולאחר מכן שטפו שוב עם 50 מיליליטר PBS שאפו את הסופרנטנט כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות המזהמות. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-PBS השיורי על ידי מערבולת קצרה במהירות נמוכה.

מוסיפים 25 מיליליטר מים ומערבלים בעדינות למשך 10 שניות. לכינים. תאי הדם האדומים מוסיפים 25 מיליליטר של 1.8% נתרן כלורי ומערבבים מיד על ידי צנטריפוגה ב -225 פעמים G למשך 10 דקות.

כעת יש להניח את כדוריות הדם האדומות המזהמות ולהשאיר כדור תאי נויטרופילים לבן. שטפו את כדור תאי הנויטרופילים עם PBS, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הנויטרופילים המבודדים במדיום RPMI עם 10% FBS. לאחר קביעת ריכוז התאים במיקרוסקופ אור עם ציטומטר המו, התאם את צפיפות התאים ל-500,000 תאים למיליליטר עם מדיום RPMI מלא של 10% FBS.

לפני תחילת בדיקת ההידבקות של תא הזרימה, יש להניע את ה-VE ב-20 ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא אנושי למשך ארבע עד שש שעות כדי לווסת ולעורר את ביטוי מולקולות ההדבקה. כאשר ה-VE מוכן, הרכיבו את תא הזרימה. הנח את צלחת ה-35 מילימטר המכילה את ה-VE המשולב על שולחן המיקרוסקופ.

למטרות סרטון זה, תיבדק רק הידבקות נויטרופילים ל-VE, אך אותו הליך חל על חקר הידבקות נויטרופילים למולקולות הידבקות מטוהרות המחברות את תא זרימת הצלחת המקביל עם משאבת המזרק ומערכת הוואקום ומשאירות קו אחד פתוח לכניסת הנויטרופילים. הכנס את תא הזרימה על גבי הצלחת והדק את מכלול תא הזרימה. הפעל את תוכנית הקלטת הווידיאו במחשב המחובר למיקרוסקופ.

כוונן את השדה והמיקוד של המיקרוסקופ עד שנראה שדה ברור עם VE בוגר במלואו. בעזרת משאבת המזרק, שטפו את תא הזרימה במדיום RPMI. ודא שאין בועות אוויר בתוך החדר או קו הכניסה של הנויטרופילים.

השתמש במשאבת המזרק כדי להזריק את הנויטרופילים לתא הזרימה במהירויות מוגדרות. הקלט את הסרטון מכיוון שהדבקה של נויטרופילים יכולה להתרחש במהירות, סרטון של ארבע עד חמש דקות בדרך כלל מספיק כדי לכמת אירועי הידבקות לניתוח. סרטון וידאו זה מציג דוגמה של נויטרופילים הנקשרים לתא זרימה מצופה HU E.

תא דבק מוגדר כתא שנע בקוטר של פחות מתא אחד תוך חמש שניות. על המשטח המצופה HU. מוצגים כאן צילומי מסך בנקודות זמן שונות מסרטונים לדוגמה של נויטרופילים הנצמדים למשטח מצופה ICAM אחד P סלקטין, או משטח מצופה uve.

בשני הניסויים, מהירות זרימת הנויטרופילים היא 350 מיקרוליטר לדקה עם צפיפות נויטרופילים של 500,000 תאים למיליליטר. בתנאים טיפוסיים, נצפה כי 50 עד 70 נויטרופילים אנושיים נצמדו היטב למשטח הליגנד או המצופה VE במהלך תקופת הקלטה של ארבע דקות. עם זאת, גרסאות אלליות של מולקולות הידבקות נויטרופילים או גרסאות אלליות במצע יכולות לשנות באופן מהותי את הידבקות הנויטרופילים הכמותית על ידי הקלטת סרטונים באורך דומה עם תורמים שונים.

נויטרופילים, ניתן לחשב את מספר תאי ההדבקה לדקה כדי להשוות את תכונות ההדבקה בין תורמים שונים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק ויזואלית את הנויטרופילים לאיתור הידוק תאים הנגרם על ידי הפעלת תאים המושרה על ידי בידוד. בנוסף, ניתן לבצע הערכה ציטומטרית של זרימה מקבילה של הפעלת התאים כדי להבטיח התאמה של מצב ההפעלה של התאים בין התורמים ובין הניסויים.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האוטואימוניות לחקור הידבקות תאים בתאים אנושיים ראשוניים מתורמי גנוטיפ שיש להם אללים שונים של אזור קידוד של שרשרת CD 11 B של אינטגרין בטא 2, MAC אחד. מחקרים אלה אפשרו הערכה זהירה וכמותית של ההשפעה התפקודית של וריאנטים אלליים אלה במערכת האנושית.