אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד היצמדות חזקה של נויטרופילים באמצעות בדיקת תאית זרימה (flow chamber assay) המאפשרת היצמדות של נויטרופילים אנושיים בנוכחות מאמץ גזירה. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת מצע של מולקולות היצמדות מטוהרות או משטח של תאי אנדותל, כגון תאי אנדותל של וריד טביליות אנושי (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs). השלב השני הוא הפרדת נויטרופילים מדם פריפריאלי אנושי באמצעות שיטת סבב צנטריפוגה בשתי שכבות (Ficoll centrifugation method).

בשלב הבא, תא הזרימה מורכב כדי לאפשר הזרקה של נויטרופילים אנושיים מבודדים תחת מאמץ גזירה על מצע של ליגנדים להצמדה או ve. השלב הסופי הוא תיעוד אירועי הצמדה של נויטרופילים בתא הזרימה, ולאחריו כימות מדויק של הצמדה יציבה. בסופו של דבר, בדיקת תא הזרימה משמשת להדגמת הצמדה יציבה של נויטרופילים כלפי מולקולות הצמדה מנוקות ומשטח HX.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחלות האוטואימוניות, כגון החשיבות הפונקציונלית של וריאציות גנטיות במולקולות רקמה הידועות כקשורות להתפתחות של אוטואימוניות. מחקרים גנטיים בחולים עם לופוס אריתמטוזי סיסטמי הדגימו קשר חזק לווריאנטים ב-Abeta two integrin, חלבון המעורב בהיצמדות חזקה (firm adhesion) של נויטרופילים. פיתחנו את מערכת בדיקה זו כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של וריאציה גנטית ב-beta two endocrine זה, הנקרא Mac one, על היצמדות חזקה. להכנת צלחות התרבית לשימוש בתא הזרימה.

הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת פיברין וג'לטין לכל צלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מילימטר, ובצעו פיפטור מספר פעמים כדי להבטיח כי כל שטח הפנים של הצלחת מצופה. הסירו את עודפי תמיסת הפיברונקטין והג'לטין והניחו לצלחות להתייבש באוויר למשך 30 דקות לפחות. כדי למקסם את היווצרות מטריקס החלבון, אספו תאי אנדותל של וריד טהורי אדם או qve שגודלו עד להגעה ל-80 עד 90% confluence באמצעות trypsin EDTA, וזרעו 500,000 תאים לכל צלחת תרבית רקמה מצופה.

הוסיפו שני מיליליטרים של מצע גידול לכל צלחת והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. יש לבחון את התאים באופן חזותי מדי יום ולהחליף את המצע מדי יומיים. אפשרו לתאים לגדול עד להגעה ל-80% עד 90% confluence.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו בטוש או בעט כדי לצייר עיגול בקוטר של 0.5 centimeters במרכזו של צלחת תרבית רקמה במידה של 35 millimeter. טפטפו 20 µL של תמיסת חלבון A בריכוז של 20 µg/mL לאזור המסומן. השתמשו בקצה הפ pipette כדי לפרוס את תמיסת חלבון A כך שתכסה את כל השטח בתוך העיגול שקוטרו 0.5 centimeter.

חשוב להימנע מנגיעה או משריטה של פני השטח של הצלחת. דגרו את צלחות תרבית הרקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו כל צלחת מצופה בחלבון שלוש פעמים עם 1 mL של PBS.

לאחר הסרת ה-PBS מלוח השטיפה השלישי, יש להוסיף 50 µL של 1%BSA לאזור המסומן כדי לחסום קישור לא ספציפי על הלוח. יש להדגיר בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים.

שטפו את הפלטה החסומה שלוש פעמים ב-1 mL של PBS. הכינו את תמיסות החלבונים הכימריים של ליגנדים לקולטן היצמדות FC עבור הציפוי וניסוי זה; יש להשתמש ב-ICAM 1 FC Kyra בריכוז של 25 µg/mL וב-P selectin FC Kyra בריכוז של 0.5 µg/mL. צפו את האזור המסומן ב-50 µL של התסבך, והדגירו את צלחות תרבית הרקמה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

יש להשתמש בצלחות תוך יומיים ולא לאפשר לאזור המצופה להתייבש. במידת הצורך, יש להוסיף PBS כדי לשמור על 50 µL של תמיסה בצלחת.

נויטרופילים למחקר זה מבודלים מדם של משתתפים שנתנו הסכמה מדעת בכתב. לאחר איסוף דם באמצעות פלבוטומיה למבחנת איסוף דם עם נוגד קרישה או vacutainer, יש לדלל את הדם ביחס של אחד לאחד עם PBS ולבצע את כל השלבים בפרוצדורה זו. בטמפרטורת החדר, הכין שכבה כפולה של phy להפרדת תאים חד גרעיים מדם פריפרי (p BMCs) ונויטרופילים במבחנות צנטריפוגה של 50 milliliters.

ראשית, יש להוסיף 15 milliliters של PHI call כבד ולאחר מכן להוסיף בזהירות שכבה של 10 milliliters של fi call קל מעל ה-heavy fi call. צריכה להיות גבול חד בין שכבת ה-light fi call לשכבת ה-heavy fi call. לבסוף, יש להוסיף בזהירות שכבה של 25 milliliters של דגימת הדם המדוללת מעל ה-light fi call מבלי להפריע ל-PHI.

סבב את המבחנות בצנטריפוגה לשכבות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הצנטריפוגה, אמורות להופיע מספר שכבות. שכבת הנויטרופילים עם מעט תאי דם אדומים נמצאת בין השכבה הקלה לשכבה הכבדה. השתמש בפיפטת העברה כדי לאסוף ולהעביר את שכבת הנויטרופילים למבחנה חדשה של 50 מיליליטר והוסף PBS עד לנפח סופי של 50 מיליליטר.

סבב במצנטריפוגה ב-225 ×g למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, לאחר הסבב, ייתכן שעדיין יהיו תאי דם אדומים המעורבבים עם הנויטרופילים. שאב את עליון הנוזל (supernatant) עד לנפח של 10 milliliter.

סספנסיה מחדש. יש לסספנד את משקע התאיים הנויטרופילים ותאי הדם האדומים על ידי ערבוב קצר ב-vortex במהירות נמוכה, ולאחר מכן לשטוף שוב עם 50 milliliters של PBS ולשאוב את העלייה כדי להסיר את תאי הדם האדומים המזהמים. יש לסספנד מחדש את התאים במשקע ב-PBS שנותר באמצעות ערבוב קצר ב-vortex במהירות נמוכה.

הוסף 25 milliliters של מים וערבב בעדינות במערבל וורטקס למשך 10 שניות. כדי לליזס את כדוריות הדם האדומות, הוסף 25 milliliters של 1.8% sodium chloride וערוב מיד באמצעות סבוב במ centri-fuge ב-225 times G למשך 10 דקות.

כעת יש לבצע ליזיס לתאי הדם האדומים המזהמים, כך שיישאר משקע של תאי נויטרופילים לבנים. יש לשטוף את משקע תאי הנויטרופילים ב-PBS, להסיר את הנוזל העליון ולסספנד מחדש את הנויטרופילים המבודדים במצע RPMI עם 10%FBS. לאחר קביעת ריכוז התאים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות המוציטומטר, יש להתאים את צפיפות התאים ל-500,000 תאים למיליליטר באמצעות מצע RPMI 10%FBS מלא.

לפני תחילת בדיקת ההיצמדות בתאית הזרימה (flow chamber), יש להכין את ה-VE באמצעות 20 nanograms per milliliter של human TNF alpha למשך ארבע עד שש שעות כדי להגביר ולעורר את הביטוי של מולקולות היצמדות. כאשר ה-VE מוכנים, יש להרכיב את תאית הזרימה. הנח את הצלחת בקוטר 35 millimeter המכילה את ה-VE בהצמיה (confluent) על שולחן המיקרוסקופ.

לצורך סרטון זה, ייבחן רק ההיצמדות של נויטרופילים ל-VE, אך אותו הליך חל גם על חקר היצמדות נויטרופילים למולקולות היצמדות מנוקות. חברו את תא הזרימה בעל הפלטות המקבילות למשאבת המזרק ולמערכת הוואקום, והשאירו קו אחד פתוח להחדרת הנויטרופילים. הכניסו את תא הזרימה לראש הפלטה והדקו את מכלול תא הזרימה. הפעילו את תוכנת הקלטת הווידאו במחשב המחובר למיקרוסקופ.

כוון את השדה ואת המיקוד של המיקרוסקופ עד ששדה ברור עם VE גדל במלואו יהיה גלוי. בעזרת משאבת המזרק, שטוף את תא הזרימה במדיום RPMI. ודא שאין בועות אוויר בתוך התא או בקו הכנסת הנויטרופילים.

השתמשו במשאבת מזרקים כדי להזריק את הנויטרופילים לתא הזרימה במהירויות מוגדרות. הקליטו וידאו מכיוון שהיצמדות של נויטרופילים יכולה להתרחש במהירות; סרטון של ארבע עד חמש דקות מספיק בדרך כלל כדי לכמת את אירועי ההיצמדות לצורך ניתוח. סרטון זה מציג דוגמה של נויטרופילים הנקשרים לתא זרימה מצופה ב-HU E.

תא נצמד מוגדר כתא שנע פחות מקוטר תא אחד בתוך חמש שניות על פני שטח מצופה ב-HU e. מוצגים כאן צילומי מסך בנקודות זמן שונות מתוך סרטוני דגימה של נויטרופילים הנצמדים לפני שטח מצופים ב-ICAM one P selectin, או לפני שטח מצופים ב-uve.

בשני הניסויים, מהירות זרימת הנויטרופילים היא 350 microliters per minute עם צפיפות נויטרופילים של 500, 000 תאים per milliliter. בתנאים טיפוסיים, נצפה כי 50 עד 70 נויטרופילים אנושיים נצמדו בחוזקה לליגנד או למשטח המצופה ב-VE במהלך תקופת הקלטה של ארבע דקות. עם זאת, וריאנטים אלליים של מולקולות היצמדות של נויטרופילים או וריאנטים אלליים במצע עלולים לשנות באופן משמעותי את היצמדות הנויטרופילים הכמותית, כפי שעלה מהקלטת סרטונים באורך דומה עם תורמים שונים.

עבור נויטרופילים, ניתן לחשב את מספר התאים הנצמדים לדקה כדי להשוות את תכונות ההיצמדות בין תורמים שונים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבדוק ויזואלית את הנויטרופילים כדי לוודא שאין התגבשות תאים (cell clamping) הנגרמת מהפעלה תאית שנוצרה כתוצאה מהבידוד. בנוסף, ניתן לבצע הערכה מקבילה של הפעלת התאים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להבטיח שמצב ההפעלה של התאים תואם בין תורמים ובין ניסויים.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטואימוניות לבחון היצמדות תאים בתאים אנושיים ראשוניים מתורמים עם גנוטיפים בעלי אללים שונים באזור המקודד של שרשרת CD 11 B של האינטגרין בטא שני, MAC one. מחקרים אלו אפשרו הערכה מדויקת וכמותית של ההשפעה התפקודית של וריאנטים אלליים אלו במערכת האנושית.