הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

מגננות הגנה מולדת מפני זיהומים נגיפיים מופעלות על ידי קולטני זיהוי תבניות (pattern recognition receptors) או prrs. קולטנים אלו נמצאים בתאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום. קולטני PRR ציטופלזמיים, RIG-I ו-PKR, נקשרים ל-RNAs בעלי חתימה נגיפית, משנים את קונפורמצייתם לאחר ליגציה ומפעילים סיגנל אנטי-ויראלי. כדי לנטר את השינויים הקונפורמציונליים של RIG-I ו-PKR ואת הליגציה שלהם in vitro, תאי A549 אנושיים מודבקים בנגיף חום עמק השריף (Rift Valley fever virus).

שימוש בשיבוט 13 כדי לעורר הפעלה של PRR. לאחר מכן מכינים ליזאטים של תאים מהקבוצה השליטה ומתאים מזוהמים כדי לנתח שינויים קונפורמציונליים ב-rig eye וב-PKR. מבוצע עיכול מוגבל באמצעות tryin.

אם התרחשו שינויים קונפורמציוניים במבנה החלבון, החלבון יהיה עמיד יותר לעיכול ופסים ייראו בניתוח Western blotting כדי לנתח את היווצרות ה-allgas; בניתוח זה מבוצע native page ולאחריו ניתוח western blotting. אם התרחשה ליגנטיזציה מלאה, ייראו קומפלקסים גבוהים יותר של all liga rig eye ו-PKR. היתרון המרכזי של עיכול פרוטאז מוגבל ו-native page הוא שטכניקות אלו מאפשרות מדידה ישירה של הפעלת rega ו-PKR.

שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום החסינות המולדת, כגון מהו הטבע המדויק והמקור של מיני ה-RNA הרלוונטיים להפעלת RIG-I ו-PKR. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי אגוניסטים של RIG-I ו-PKR. ניתן ליישמן גם על חלבוני חיישן ציטופלזמיים אחרים כגון MDA5; את הפרוצדורה תדגים מילה ויווה, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי, לפני תחילת הפרוצדורה.

שימו לב כי שיבט 13 של נגיף חום עמק הריפט, אשר יכונה להלן CL 13, הוא מוטציה נגיפית מוחלשת, שבגרמניה יש לטפל בה בתנאי BSL 2. יש לחמם מראש מצע PBS נטול סרום ומצע לתרבית תאים המכיל 5% FCS. הניח אותם באמבט מים בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הכן תמיסס של 1.25 × 10⁷ PFU למילו ליטר של CL 13 במצע נטול סרום כדי להדביק 2.5 × 10⁶.

הדבקו תאי A 5 49 בריבוי זיהום (MOI) של חמש; הכינו כ-10% יותר מהכמות הדרושה כדי לפצות על שגיאות פיפטינג. הוציאו את תאי ה-A 5 49 מהאינקובטור, שאבו את המצע והוסיפו 10 milliliters של PBS; סובבו או הטו את בקבוק התרבית כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן הסירו את ה-PBS. בשלב הבא, הוסיפו one milliliter של CL 13 מדולל, או עבור ביקורת לא מזוהמת (mock infection).

הוסיפו 1 mL של מצע ללא סרום והדגירו למשך שעה, עם ערבוב כל 15 דקות. הטו את הבקבוק בזהירות כדי להבטיח פיזור שווה של המצע. לאחר שעה אחת של הדבקה, הסירו את האינוקולום.

הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע תרבית תאים שחומם מראש עם 5%FCS, והדגרירו למשך חמש שעות. הכינו PBS עם 0.5%tritton X 100 והניחו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אין להוסיף מעכבי פרוטאז סיריים.

בשלב הבא, שטפו את התאים ב-PBS קר והוסיפו 10 milliliters של PBS טרי. לאחר מכן, בעזרת גורר תאים (cell scraper), נתקו את התאים מהצלחית. העבירו את תרחיף התאים לפרועת קונית של 15 milliliter וסבבו בצנטריפוגה ב-800 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסבוב, הסר את העל-נוזל (supernatant) וסספנד מחדש את משקע התאים ב-30 µL של PBS עם 0.5% Triton X 100. העבר את הלייזט לפרונטה נקייה של 1.5 mL והדגר למשך 10 דקות לפחות על קרח. סבב את הלייזט בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את ליזט התאים המזוקק לפרועת מבחנה חדשה. בצעו בדיקת Bradford כדי לקבוע את ריכוז החלבון בליזט התאים המזוקק. אחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או המשיכו מיד לעיכול בטריפסין או ל-native PAGE כדי לבחון שינויים קונפורמציונליים של קולטני זיהוי תבניות (pattern recognition receptors). ראשית, דללו TPCK trypsin או chloro-methyl ketone treated trypsin ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 µg/mL בשתי מבחנות חדשות עבור כל תנאי. בשתי מבחנות נוספות, כוון את ריכוז החלבון הסופי של ה-CL 13 ושל ליזטים של חלבוני ביקורת לא מזוהמים ל-25 µg בנפח סופי של 9 µL עם PBS. סט אחד של ליזטים ישמש כביקרת קלט (input control) והשני יעובד עם TPCK trypsin. למבחנות הביקורת שאינן מעובדות, הוסיפו 1 µL של PBS לשתי המבחנות הנותרות.

הוסיפו 1 µL של TPCK trypsin בריכוז של 2 µg/µL כדי להביא את הריכוז הסופי ל-0.2 µg/µL. ערבבו את התגובות באמצעות פיפוט. דגרו את הליזטים בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות.

עצרו את התגובה על ידי הוספת פי חמישה מתמיס דגימה דנטורטיבי (denaturing sample buffer) ולאחר מכן הרתיחו במשך חמש דקות ב-95 °C. חשוב שלא להאריך את זמן דגראציה של ה-trypsin. שימו לב כי תזמון מדויק של עיכול ה-trypsin הוא קריטי לזיהוי מקטעים עמידים ללא רעש רקע; אם לא זוהו חלבונים עמידים, או אם זוהו רבים מדי, התאימו את משך העיכול בהתאם.

לאחר ההרתחה, יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או להעמיס את הדגימות על שני ג'לים של sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, המורכבים מ-stacking gel בריכוז 5% מעל resolving gel בריכוז 12%. יש להפריד את החלבונים בזרם של 25 מיליאמפר לכל ג'ל עד להגעה של ה-bromophenol blue לקצה.

לאחר הרצת הג'לים, העבירו את החלבונים מג'ל אחד לממברנת פוליביניליד פלואוריד (PVDF) ובצעו ניתוח באמצעות Western blotting עם נוגדנים המופנים ל-RIG-I ו-PKR. צבעו את הג'ל השני ב-Coomassie Brilliant Blue G-250. לאחר מכן, אחסנו את הג'ל ב-25% ethanol, 8% acetic acid ו-4% glycerol בטמפרטורה של 4°C, או המשיכו לביצוע הדמיה וניתוח. כדי לנתח מצבים אוליגומריים של קולטנים לזיהוי תבניות (PRRs), הכינו 50 µg של ליזט תאים בנפח סופי של 10 µL עם PBS והוסיפו 5x sample buffer עד לריכוז סופי של 1x.

העמיסו מיד את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד (poly acrylamide) טבעי עם ג'ל ריכוז 5%stacking וג'ל ריכוז 8%resolving. כל עיכוב יוביל לאובדן של קומפלקסים טבעיים. הרצו את הג'ל בזרם של 20 milliamps לכל ג'ל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הפסיקו את האלקטרופורזה 45 דקות לאחר שפס ה-Bromo phenol blue עזב את הג'ל, לאחר סה"כ של כ-1.5 עד שתי שעות. לאחר מכן, בצעו Western blotting באמצעות נוגדנים המכוונים נגד RIG-I ו-PKR כפי שמתואר במסמך המצורף, כדי לבחון מעבר קונפורמציונלי והשראת אוליגו עקב זיהוי של אגוניסט ויראלי על ידי RIG-I או PKR. עיכול חלקי על ידי פרוטאוז ו-native PAGE בוצעו כפי שמתואר בסרטון זה; עיכול של ליזאטים של תאים שסריקו (mock infected) באמצעות טריפסין הוביל לפירוק מהיר של RIG-I, בעוד שזיהום על ידי clone 13 הוביל ליצירה של פרגמנט עמיד של RIG-I במשקל 30 kilodalton. PKR מראה אף הוא עמידות חלקית לעיכול בטריפסין בדגימות מזוהמות, דבר החופף לפוספורילציה שלו. כדי לנטר את היעילות והספציפיות של עיכול הטריפסין, הג'לים נצבעו ב-Coomassie brilliant blue G-250. דגימות לא מטופלות מראות כמויות שוות של חלבונים שהועמסו; עיכול של ליזאטים של תאי mock ו-C13 באמצעות טריפסין מוביל לירידה דומה בכמויות החלבון הכלליות.

הדבר מוכיח כי הטיפול ב-tripsin בעל אותה יעילות עבור דגימות mock ודגימות שהודבקו ב-CL 13 בתאים שאינם מזוהמים. רק מונומרים של R EYE ו-PKR זוהו כבקרת נוספת. גורם השעתוק IRF three נכלל במחקר; הוא קיים כמונומר, אך ידוע כי הוא עובר דימרציה בעקבות הפעלה באמצעות R Eye.

הדבקה ב-Clone 13 מובילה להצטברות חזקה של קומפלקסים אוליגומריים של rig eye בצורה של מריחה (smear), ושל דימרים או אוליגומרים של PKR ו-IRF three כפס חלבון מוגדר. תוצאות אלו מדגימות כי עיכור מוגבל בביצוע עיכול ו-native page הם כלים שימושיים לניטור שינויים קונפורמציוניים ויצירת אוליגומרים של rig eye ו-PKR בעקבות הדבקה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של האופן שבו ניתן לנטר את מעבר הקונפורמציה ואת האוליגומריזציה של WIC eye ו-PKR לאחר רכישת המיומנות.

ניתן לבצע טכניקה זו במשך יומיים בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע בדיקות דומות למדידת קישוריות (like pro assays) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קיומה של אינטראקציה יציבה עם הליגנד הממריץ לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום החסינות המולדת לבחון את מצב ההפעלה של קולטני זיהוי תבניות בתאים שעברוהסטימולציה נגיפית.