הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

הגנות מולדות לזיהומים נגיפיים מופעלות על ידי קולטנים לזיהוי דפוסים או prrs. קיים בתאים של מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום. עין מתקן PRRS ציטופלזמית ו-PKR נקשרים לחתימות נגיפיות, משנים אישור של כל עיני הליגה ומפעילים איתות אנטי-ויראלי כדי לנטר את השינויים המאשרים את עין האסדה ו-PKR וכל הרצועות במבחנה אנושית A 5 49 נגועים בנגיף קדחת עמק הריפט.

שיבוט 13 כדי לעורר את הפעלת PRR. לאחר מכן מוכנים ליזטים של תאים לבקרה ותאים נגועים לנתח שינויים בעין האסדה וב-PKR. מתבצע עיכול ניסיון מוגבל

אם התרחשו שינויים מאשרים במבנה החלבון, החלבון עמיד יותר לעיכול ורצועות ייראו עם ניתוח כתמים מערביים לניתוח להיווצרות דף מקורי של allgas מבוצע ואחריו ניתוח כתמים מערביים. אם כל הרצועות התרחשו גבוה יותר, נראים כל קומפלקסי העין של הליגה ו-PKR. היתרון העיקרי של עיכול פרוטאז מוגבל ודף מקורי הוא שטכניקות אלו מקלות על מדידה ישירה של הפעלת רגה ו-PKR.

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החסינות המולדת, כגון מהו האופי והמקור המדויקים של מיני ה-RNA הרלוונטיים להפעלת עין אסדה ו-PKR. שיטות אלו יכולות לספק תובנה לגבי אגוניסטים של עין אסדה ו-PKR. ניתן ליישם אותם גם על חלבוני חיישן ציטופלזמיים אחרים כגון MDA 5, מה שמדגים את ההליך יהיה מילה ויוה, דוקטורנטית מהמעבדה שלי לפני תחילת הליך זה.

שימו לב כי שיבוט 13 של נגיף קדחת עמק השבר המכונה להלן CL 13 הוא מוטציה של נגיף מוחלש, אשר בגרמניה יש לטפל בו בתנאי BSL שני כדי לחמם מראש מדיום נטול סרום PBS ומדיום תרבית תאים המכיל 5% FCS. הניחו אותם באמבט מים בצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הכן 1.25 כפול 10 ל-PFU השביעי למיליליטר של CL 13 במדיום נטול סרום כדי להדביק 2.5 כפול 10 לשישי.

5 49 תאים עם ריבוי זיהום או MOI של חמישה מכינים בערך 10% יותר מהנדרש כדי להסביר שגיאות פיפטינג. הסר את תאי A 5 49 מהחממה, שאב את המדיום והוסף 10 מיליליטר PBS מערבולת או הטה את בקבוק התרבית כדי לשטוף את התאים ואז להסיר את ה- PBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של ה-CL 13 המדולל או לבקרה הלא נגועה או לזיהום מדומה.

יש להוסיף מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום ולדגור במשך שעה כל 15 דקות. הטה בזהירות את הבקבוק כדי להבטיח חלוקה שווה של המדיום. לאחר שעה אחת של הדבקה, הסר את החיסון.

הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים חם מראש עם 5% FCS, ודגר במשך חמש שעות. הכן PBS עם 0.5% טריטון X 100 והניח אותו על ארבע מעלות צלזיוס. אין להוסיף מעכבי פרוטאז סוריים.

לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS קר והוסיפו 10 מיליליטר PBS טרי. לאחר מכן בעזרת מגרד תאים, נתק את התאים מהצלחת. העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 800 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-30 מיקרוליטר PBS עם 0.5% טריטון X 100. העבירו את הליזאט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר ודגרו לפחות 10 דקות על קרח. צנטריפוגה את הליזאט ב -10,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את ליזאט התא המובהר לצינור טרי. בצע בדיקת ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון בחנות הליזאט של התא המובהר במינוס 20 מעלות צלזיוס או המשך מיד לנסות לעכל או דף מקורי כדי לבדוק שינויים מאשרים של קולטני זיהוי דפוסים לדלל תחילה L אחד טוסטו כלורו, מתיל קטון מטופל או TPCK טריפסין ב-PBS לריכוז עבודה סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר בשני צינורות חדשים לכל מצב, התאם את ריכוז החלבון הסופי של CL 13 וחלבון בקרה לא נגוע ליזאטים ל-25 מיקרוגרם בנפח סופי של תשעה מיקרוליטר עם PBS, סט אחד של ליזטים ישמש כבקרת קלט והשני יטופל בטריפסין TPCK לצינורות הבקרה הלא מטופלים. הוסף מיקרוליטר אחד של PBS לשני הצינורות הנותרים.

הוסף מיקרוליטר אחד של שני מיקרוגרם למיקרוליטר TPCK טריפסין כדי להביא את הריכוז הסופי ל-0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר. מערבבים את התגובות על ידי פיפטינג. דגרו על הליזטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.

עצור את התגובה על ידי הוספת מאגר דגימת דנטורציה פי חמישה ולאחר מכן רתיחה במשך חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה של הטריפסין. שימו לב שתזמון מדויק של עיכול הטריפסין הוא קריטי לאיתור שברים עמידים ללא כל רקע אם לא מתגלים חלבונים עמידים או אם מתגלים יותר מדי, משך העיכול המותאם. בהתאם.

לאחר הרתיחה יש לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס או לטעון את הדגימות על שני נתרן דוקל סולפט. ג'ל פולי אקרילאמיד המורכב מג'ל ערמה של 5% על ג'ל ממיס 12%. הפרד את החלבונים ב-25 מיליאמפר לג'ל עד שנגמר הברומו פנול כחול.

לאחר הפעלת הג'לים, העבירו את החלבונים מג'ל אחד לקרום פלואוריד פולי גפן ונתחו על ידי Western Blotting עם נוגדנים המכוונים כנגד עין האסדה וצבע PKR את הג'ל השני עם קומאסי כחול מבריק G שניים 50. לאחר מכן אחסן את הג'ל ב-25% אתנול, 8% חומצה אצטית ו-4% גליצרול בארבע מעלות צלזיוס או המשך לבצע הדמיה וניתוח. כדי לנתח מצבים אוליגומריים של קולטנים לזיהוי דפוסים, הכינו 50 מיקרוגרם של ליזאט תאים בנפח סופי של 10 מיקרוליטר עם PBS והוסיפו מאגר דגימה של חמישה x לריכוז סופי של x אחד.

טען מיד את הדגימות על ג'ל פולי אקרילאמיד מקורי עם ערימה של 5% וג'ל מסלק 8%. כל עיכוב יגרום לאובדן מתחמים מקומיים. הפעל את הג'ל ב -20 מיליאמפר לג'ל בארבע מעלות צלזיוס.

הפסק את האלקטרופורזה 45 דקות לאחר שהפס הכחול של ברומו פנול עזב את הג'ל לאחר סך של כ-1.5 עד שעתיים לכל ביצוע כתמים מערביים באמצעות נוגדנים המכוונים כנגד עין המתקן ו-PKR כמתואר במסמך הנלווה לבדיקה להחלפת אישור ואוליגו המושרה על ידי זיהוי אגוניסט ויראלי על ידי עין אסדה או PKR עיכול פרוטאז מוגבל ודף מקורי בוצעו כמתואר בסרטון זה, עיכול טריפסין של ליזאטים של תאים נגועים מדומה הביא לפירוק מהיר של עין האסדה, בעוד שזיהום בשיבוט 13 הוביל ליצירת שבר עין אסדה עמיד של 30 קילודלטון. PKR מראה גם עמידות חלקית לעיכול טריפסין בדגימות נגועות, מה שעולה בקנה אחד עם הזרחן שלו כדי לנטר את היעילות והספציפיות של ג'ל העיכול של טריפסין שנצבעו בכחול מבריק קומאסי G 2 50. דגימות לא מטופלות מראות כמויות שוות של חלבונים טעונים, חשיפה מדומה, וליזאטים של תאי C 13 לעיכול טריפסין מובילה לירידה דומה בכמויות החלבון העולמיות.

זה מוכיח שלטיפול בטריפסין יש את אותה יעילות עבור דגימות מדומות ודגימות נגועות CL 13 בתאים לא נגועים. רק מונומרים של R EYE ו-PKR זוהו כבקרה נוספת. גורם השעתוק IRF 3 נכלל, הקיים כמונומר, אך ידוע כמתעמעם עם ההפעלה באמצעות R Eye.

זיהום בשיבוט 13 מוביל להצטברות חזקה של קומפלקסים אוליגומריים של עין ריג בצורה של מריחה ושל PKR ו-IRF שלושה דימרים או אוליגומרים כפס חלבון מוגדר. תוצאות אלה מדגימות כי נסיעות מוגבלות בעיכול ודף מקורי הם כלים שימושיים לניטור שינויים מאשרים והיווצרות אוליגו של עין אסדה ו-PKR בעת זיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפקח על מיתוג ואישור WIC ואישור PKR לאחר שליטה.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים לאחר הליך זה. כשיטה כמו בדיקות מקצועיות ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם יש אינטראקציה יציבה עם הליגנד המגרה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החסינות המולדת לחקור את מצב ההפעלה של קולטני זיהוי דפוסים בתאים מגורים ויראליים.