Name: הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: למדו לנטר שינויים קונפורמציונליים בקולטנים RIG-I ו-PKR בתגובה לזיהום ויראלי. השיטה משתמשת בעיכוב פרוטאזה מוגבל ודף נייטיב כדי לחקור מנגנוני איתות נגד-ויראליים בתאי A549.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאלחנדרו ברון מCISA-INIA למתן סרה נגיף קדחת העמק נגד הבקעה. עבודה במעבדות שלנו נתמכת על ידי פנינת Forschungsförderung. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum גיסן und מרבורג, בית הספר למוסמכים לייבניץ למחלות ויראליות מתעוררים (EIDIS), Sonderforschungsbereich DFG (SFB) 1021, וSchwerpunktprogramm DFG (SPP) 1596.

1. זריעה של תאי A549 לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפח את בקבוק T75 של תאי A549 על 37 ° C ו 5% CO 2 בתרבית תאים בינונית (DMEM בתוספת FCS 10%, L-גלוטמין 526.6 מ&quot;ג / ליטר, 50.000 פניצילין U / ליטר, ו50 סטרפטומיצין מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל לקצור את התאים, לחמם את המדיום סלולרי תרבות, PBS ו0.05% טריפסין-EDTA בwaterbath מחומם ל37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את PBS שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של טריפסין-EDTA ולהפיץ באופן שווה בבקבוק. מעביר את הבקבוק באינקובטור עם 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 7 מיליליטר של מדיום תרבות תא, resuspend התאים, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם חדר ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 x 10 6 תאים ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא בשתי צלוחיות T25 כל אחד. דגירה של 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. בקבוק אחד משמש לשליטה מדומה ואחד לזיהום Cl 13. </li></ol> 2. זיהום עם Clone וירוס בקעת קדחת 13 (13 Cl) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: 13 Cl הוא מוטציה נגיף מוחלשת שבגרמניה יכול להיות מטופלים תחת BSL-2 תנאים. אנא עיין בכללים לאומיים רלוונטיים. מעוררי IFN אופייניים אחרים יהיו וירוס סנדאי (זן Cantell) או וירוס מחלת ניוקאסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בינוני סרום ללא טרום חם PBS, ומדיום תרבית תאים המכיל FCS 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.25 x 10 7 PFU / מיליליטר של 13 Cl במדיום סרום ללא להדביק 2.5 x 10 6 תאי A549 עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5. הכן כמות מעט (בערך 10%) גדולה יותר מהדרוש כדי להסביר שגיאות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS כמתואר תחת 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של דילול Cl 13 אושל מדיום סרום ללא (שליטה נגוע, מדומה) לתאים, ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2. הזז את הבקבוק בזהירות כל 15 דקות כדי להבטיח חלוקה שווה של Cl 13 דילול ובינוני סרום ללא, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של זיהום, להסיר את inocula, מוסיף 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא מחומם מראש עם FCS 5%, ו דגירה במשך 5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. הכנת lysates התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS / 0.5% טריטון X-100 ב 4 ° C. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז סרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS הקר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את התאים כבויים, להעביר את ההשעיה התא בצינור בז, ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 30 PBS / 0.5% טריטון X-100. העבר את lysate לתוך צינור מיליליטר טרי 1.5 ודגירה של לפחות 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב10.000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את lysate הבהיר התא (supernatant) לתוך צינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד כמתואר במקום אחר 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -20 ° C או להמשיך לעיכול טריפסין (4.1) או עמוד ילידים (5.1). </li></ol> 4. קביעת קונפורמציה השינויים של זיהוי התבניות רצפטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול TPCK-טריפסין של lysates התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl טופלו קטון chloromethyl (TPCK) ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם בשני צינורות חדשים ריכוז חלבון סופי של 25 מיקרוגרם של כל lysate חלבון (מדומה או 13 Cl) בנפח סופי של μl 9 עם PBS. לכן, זה צריך להיות ארבעה צינורות עם 25 lysate מיקרוגרם כל אחת, שתי פעמים מדומה ושתי פעמים Cl זיהום 13. אחד מוגדר כשליטת קלט (ללא טיפול) וקבוצה אחת לטיפול בTPCK-טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של PBS (ללא טיפול)או 1 μl של 2 מיקרוגרם / μl TPCK-טריפסין (ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם / μl) לlysates התא ומערבבים את התגובות על ידי pipetting. לא להקפיא ולהפשיר aliquots TPCK-טריפסין, כי זה יפגע ביעילות של מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5x denaturing חיץ מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl pH 6.8, 10% SDS, גליצרול 50%, 25% β-mercaptoethanol, bromphenol 0.5% הכחולים) ועל ידי רתחה במשך 5 דקות ב95 ° C. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה טריפסין. במקרה לא שברי פרוטאז עמיד הם לגילוי, הזמן של עיכול טריפסין חייב להתקצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרתיחה, ניתן לאחסן הדגימות ב-20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד) ומערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות על נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ג&#39;ל polyacrylamide המכיל לערום 5% מעל 12% ג&#39;ל פתרון. הפרד את החלבונים ב25 mA לג&#39;ל עדbromphenol הכחול שנגמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קרום polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך חיץ העברה (48 מ&quot;מ טריס, 39 מ&quot;מ glycin, 1.3 מ&quot;מ SDS, מתנול 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סופג עם מערכת סופג semidry ולאפשר העברת החלבונים ב10 V במשך שעה 1. קח את הממברנה החוצה, לשטוף אותו לזמן קצר במים, ולתת לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחדש את הקרום על ידי זמן קצר העברה למתנול. שטוף למשך 5 דקות עם TBS. לחסום עם 10% חלב דל שומן בכפות עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ לשטוף 3x הקרום במשך 5 דקות כל אחד עם TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול נוגדן כפי שהומלץ בטבלה 1 ו דגירה הקרום עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T. מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים בשילוב עם חזרת peroxidase בדילול 1:20,000 ב1% חלב דל שומן בכפות. דגירה 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T, וoזמן נוסף ne עם TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי אות להשתמש במערכת הדמיה דיגיטלית ג&#39;ל ערכת chemiluminescense מסחרית ו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים כחולי G-250 מבריקים Coomassie <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע-SDS כמתואר ב4.2.1. דגימות עומס על ג&#39;ל polyacrylamide SDS ולהפעיל את הג&#39;ל על 25 mA לג&#39;ל עד bromphenol הכחול שנגמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים הכחול G-250 מבריק Coomassie ב RT. האם כל incubations תחת טלטול מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הג&#39;ל לפתרון הקיבעון המכיל מתנול 40% ו10% חומצה אצטית ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את החיץ לפתרון destaining (25% אתנול ו -8% חומצה אצטית) ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל עם 0.2% Coomassie Brillant Blue-G-250 במתנול 40% וחומצה אצטית 10% במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל עם פתרון destaining ולהחליף את החיץ לאחר 10 דקות, 30 דקות, ו60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הג&#39;ל ב25% אתנול, 8% חומצה אצטית, וגליצרול 4% ב 4 ° C. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה וניתוח כפי שתואר תחת 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח Oligomeric הברית של זיהוי התבניות רצפטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוד Native <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיקרוגרם של lysate תא בנפח סופי של μl 10 עם PBS ולהוסיף 5 × חיץ האם של מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl pH 6.8, 1% deoxycholate נתרן, גליצרול 50%, bromphenol 0.5% הכחולים) לריכוז סופי של 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות באופן מיידי על ג&#39;ל polyacrylamide יליד עם 5% כלערום ו -8% כפתרון ג&#39;ל. כל עיכוב יגרום לאובדן של קומפלקסי ילידים 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל על 20 mA לג&#39;ל על 4 מעלות צלזיוס עם 50 מ&quot;מ טריס-NaOH pH 9.0, 384 מ&quot;מ glycin כמו האנודה ו50 מ&quot;מ טריס pH 8.3, 384 מ&quot;מ glycin, 1% deoxycholate נתרן כחיץ קתודה. לאחר 1.5-2 שעה (להקה הכחולה bromphenol הותירה את הג&#39;ל כ 45 דקות קודם לכן) אלקטרופורזה הוא סיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופג מערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל polyvinylidene פלואוריד קרום (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך מאגר טובין (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ glycin, 0.1% SDS, מתנול 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב קאמרי כתם רטוב על פי הוראות היצרן ולמלא את המכל עם חיץ Towin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הסופג עם 250 mA ל1.5 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהסופג הוא סיים המשך כמתואר מ4.2.3 הלאה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurtler, C., Bowie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+detection+of+microbial+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune detection of microbial nucleic acids.</a> Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).</li>
<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RIG-I+has+an+essential+function+in+double-stranded+RNA-induced+innate+antiviral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.</a> Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).</li>
<li>Andrejeva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+proteins+of+paramyxoviruses+bind+the+IFN-inducible+RNA+helicase%2C+mda-5%2C+and+inhibit+its+activation+of+the+IFN-beta+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+innate+antiviral+defenses+through+a+shared+repressor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22in+RIG-I+and+LGP2+Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain.</a> in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).</li>
<li>Ferrage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+second+CARD+of+human+RIG-I+provide+mechanistic+insights+into+regulation+of+RIG-I+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).</li>
<li>Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolakofsky%2C+D+%22A+structure-based+model+of+RIG-I+activation%22">A structure-based model of RIG-I activation</a>. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).</li>
<li>Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+determinants+of+viral+RNA+recognition+by+innate+immune+sensor+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).</li>
<li>Kowalinski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+activation+of+innate+immune+pattern-recognition+receptor+RIG-I+by+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA.</a> Cell. 147, 423-435 (2011).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+RNA+recognition+by+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into RNA recognition by RIG-I.</a> Cell. 147, 409-422 (2011).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+genome+5%26%2334%3B+termini+as+a+strategy+of+negative-strand+RNA+viruses+to+avoid+RIG-I-dependent+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Processing of genome 5&#34; termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction.</a> PloS One. 3, e2032(2008).</li>
<li>Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+viral+Achilles%27+recognition+of+5%27-triphosphate+RNA+in+innate+anti-viral+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence.</a> Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPichlmair%2C+A+%22RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%22">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates</a>. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornung%2C+V+%225%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%22">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I</a>. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).</li>
<li>Saito, T., Gale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+double-stranded+RNA+by+RIG-I-like+receptors+in+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonself+RNA-sensing+mechanism+of+RIG-I+helicase+and+activation+of+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses.</a> Mol Cell. 29, 428-440 (2008).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+signal+perception+and+integration+by+the+innate+immune+sensor+retinoic+acid-inducible+gene-I+%28RIG-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I).</a> J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-induced+oligomerization+of+the+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA5+activates+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response.</a> Immunity. 36, 959-973 (2012).</li>
<li>Civril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIG-I+ATPase+domain+structure+reveals+insights+into+ATP-dependent+antiviral+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling.</a> EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).</li>
<li>Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+the+innate+antiviral+response+through+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).</li>
<li>Hertzog, P. J., Williams, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+type+I+interferon+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokin.%2C+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fine tuning type I interferon responses.</a> Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).</li>
<li>Pindel, A., Sadler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+R+in+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase R in the interferon response.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).</li>
<li>Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2alpha+kinases%3A+their+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">The eIF2alpha kinases: their structures and functions.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).</li>
<li>Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PKR+an+open+and+shut+case%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of PKR an open and shut case.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).</li>
<li>Dauber, B., Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Antiviral+Kinase+PKR+and+Viral+Countermeasures%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures.</a> Viruses. 1, 523-544 (2009).</li>
<li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+PKR+dimerization%2C+autophosphorylation%2C+and+eIF2alpha+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition.</a> Cell. 122, 901-913 (2005).</li>
<li>Gack, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM25+RING-finger+E3+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RIG-I-mediated+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity.</a> Nature. 446, 916-920 (2007).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+RIG-I+pathway+reveals+a+signaling+role+of+unanchored+polyubiquitin+chains+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity.</a> Cell. 141, 315-330 (2010).</li>
<li>Anderson, E., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+stabilities+in+protein+kinase+R+%28PKR%29%3A+evidence+for+weak+interdomain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions.</a> Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incoming+RNA+virus+nucleocapsids+containing+a+5%27-triphosphorylated+genome+activate+RIG-I+and+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling.</a> Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native.</a> 5, 4338-4346 (2005).</li>
<li>Muller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Bouloy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Ikegami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells+%3A+Devoted+to+Molecula.%2C+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).</li>
<li>Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+IRF-3+activation+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Control of IRF-3 activation by phosphorylation.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).</li>
<li>Bamming, D., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signal+transduction+by+enzymatically+inactive+antiviral+RNA+helicase+proteins+MDA5+RIG-I+and+LGP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+dsRNA+recognition%2C+filament+formation%2C+and+antiviral+signal+activation+by+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5.</a> Cell. 152, 276-289 (2013).</li>
<li>Berke, I. C., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA5+cooperatively+forms+dimers+and+ATP-sensitive+filaments+upon+binding+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA.</a> The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).</li>
<li>Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+evasion+of+type+I+interferon+responses+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses.</a> Virus Research. 162, 12-18 (2011).</li>
<li>Taylor, K. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+viral+evasion+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon.</a> Immunology. 138, 190-197 (2013).</li>
<li>Goodbourn, S., Randall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+type+I+interferon+production+by+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).</li>
<li>Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tricks+to+grid-lock+the+type+I+interferon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tricks to grid-lock the type I interferon system.</a> Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חישה נוכחותם של וירוסים והפעלה של הסוג אנטי אני IFN מערכת חיוני לתגובה חיסונית מולדת מוצלחת 22. זיהוי וירוסים הוא בתיווך ובכך על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs) כמו RIG-I ו PKR, ומאפשר תגובה והפעלה של מנגנוני הגנה אנטי מהירים. כאן, אנו מתארים שתי שיטות על מנת להעריך את מצב ההפעלה של RIG-I ו PKR ישירות. עיכול פרוטאז מוגבל ככלי לניטור שינויי קונפורמציה של RIG-I ו PKR תואר לראשונה על ידי הקבוצות של מ &#39...

אירוע מכריע בהגנת מארחת נגיפים הוא האיתור המהיר של הפתוגן על ידי קולטנים שנקרא זיהוי תבניות (PRRs) 1,2. איתור תאיים של זיהום בנגיף RNA תלוי בשני helicases cytoplasmic RNA, RIG-I (אני גן מושרה חומצה רטינואית) וMDA5 (חלבון בידול מלנומה קשור 5) 3-5. RIG-מורכב משני תחומים N-מסוף גיוס caspase (כרטיסים), תחום helicase RNA סוג DECH התיבה מרכזי, ותחום בטרמינל C-(CTD) 4,6. ואילו CTD ותחום helicase נדרשים להכרה של RNAs אינו עצמי (ויראלי), הכרטיסים לתווך איתות במורד הזרם שתוביל להקמת מעמד מארח אנטי. אם RIG-אני נמצא במצב השקט, כלומר בהיעדר ליגנד RNA ספציפי, הכרטיס השני אינטראקציה עם תחום helicase המרכזי ושומר RIG-I בקונפורמציה אוטומטית מעכבת 7-11. RIG-I נקשר קצר כפולגדיל RNA (DS) נושאות 5&#39;-טריפוספט (5&#39;PPP), dsRNA הארוך, ו-RNA PolyU / UC-עשיר, מבני חתימה קלאסיים אשר נמצאים בגנומים של וירוסי RNA רבים 12-16. שני מאפיינים עיקריים של RIG-I הפעלה הם מעבר לקונפורמציה סגורה 6,17 וההומו-oligomerization 6,18,19. מתג קונפורמציה משפר RNA מחייב, חושף את הקלפים לאיתות במורד הזרם, וreconstitutes אתר ATPase פעיל 8,9,11,20. היווצרות של קומפלקסי RIG-I oligomeric מובילה לגיוס מוגבר של מולקולות איתות במורד הזרם מתאם כדי ליצור פלטפורמה להעברת אותות אנטי 11. שרשרת האיתות המוסדרת RIG-סופו של דבר מפעילה את גורם שעתוק IRF-3 לעד ויסות של אינטרפרון גנים (IFN-alpha/beta) ומכאן ביטוי גנים של גנים אינטרפרון מגורה (ISGs) לתגובה אנטי מלאה 21,22 . אחד ISGs המאופיין ביותר הוא protei מופעל RNAקינאז n (PKR) 23. PKR שייך למשפחה של ייזום תרגום גורם 2 אלפא אוקריוטים קינאז (eIF2α) והוא מורכב מתחום N-מסוף פעמיים תקוע RNA מחייב ותחום קינאז C-מסוף. תחום קינאז מהווה ממשק dimerization חיוני להפעלת PKR ומבצע את הפונקציות הקטליטית של החלבון. עקידת PKR לdsRNA הנגיפי מובילה לשינוי קונפורמציה התרת dimerization והאוטומטי זירחון בThr 446 בין שאריות אחרות. PKR אז מתווך זירחון של eIF2α, ובכך חוסם את התרגום של mRNAs הנגיפי 23-27. שני RIG-I ו PKR לעבור שחלופים מבניים גדולים, יצירת קומפלקסי oligomeric והם פוסט translationally שונה על ידי זירחון / dephosphorylation וubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. להבנה טובה יותר של מבנים שרנ&quot;א נגיפיים מפעילים RIG-I ו PKR (ובאיזה שלב יריבים נגיפיים יכולים bדואר להתערב), חשוב על מנת לקבוע את מצב ההפעלה בדיוק. עבור שניהם PRRs שתואר בעבר על כך שהפעיל גורם להופעתה של שברי טריפסין עמיד חלבון 6,17,30 וoligomers מסדר גבוה 6,18,19. עם זאת, בהתחשב בעושר של ספרות על גורמי מפתח אלה של תגובת המארח אנטי 1,2,24, יישום של שיטות ישירות נראה יחסית נדיר. בתקווה להגביר את השימוש רחב יותר, אנו מספקים פרוטוקולים נוחים ורגישים כדי לנתח וחסונה מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR. A549 שורת תאים אנושי המוסמך IFN נגוע בactivator הוקם RIG-I ו PKR, שיבוט נגיף קדחת עמק השבר נחלש המוטציה 13 (13 Cl) 31,32. לאחר הליך lysing פשוט, תמציות של תאים נגועים נבדקות על ידי עיכול / ניתוח כתם מוגבל טריפסין מערבי להעריך מיתוג קונפורמציה, ועל ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים הכחול (עמוד) / analys כתם המערביהוא למדוד היווצרות oligomers.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>כימיקלים</חזק></td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-מטופל (TPCK) טריפסין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><נוגדנים חזקים></חזקים>נוגדנים</td></tr> <tr><td>חד-שבטיים נגד RIG-I (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% בעכבר TBS</td></tr><tr><td> חד שבטי נגד PKR (B10)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr><tr><td>ארנב חד-שבטי אנטי-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000 ב-5% BSA ב-TBS</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-IRF-3</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% ב-TBS ארנב</td></tr><tr><td>חד-שבטי אנטי-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr><tr><td>סרום ארנב נגד RVFV היפר-אימוני "C2" (MP-12)</td><td>מסופק באדיבות על ידי אלחנדרו ברון CISA-INIA</td><td></td><td>WB: 1:2,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr><tr><td>עכבר חד-שבטי אנטי-בטא-אקטין (8H10D10)</td><td>איתות תאים</td><td>3700</td><td>WB: 1:1,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr><tr><td>עיזים מצומד פרוקסידאז פוליקלונלי נגד ארנב</td><td>תרמו פישר</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr><tr><td>פוליקלונל פרוקסידאז מצומד עז נגד עכבר</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS</td></tr></tbody></table>

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה rig-i ו pkr ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד native

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

הגנה מארחת לזיהום בנגיף תלוי באיתור מהיר על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) של מערכת החיסון המולדת. בציטופלסמה, PRRs RIG-I ו לאגד PKR לליגנד רנ&quot;א הנגיפי הספציפי. זה מתווך ראשון מיתוג וoligomerization קונפורמציה, ולאחר מכן מאפשר הפעלה של תגובת אינטרפרון אנטי. בעוד שיטות כדי למדוד ביטוי גני מארח נגיפים מבוססות היטב, שיטות לניטור ישירות מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR הן רק באופן חלקי ופחות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים שתי שיטות לניטור RIG-I ו PKR גירוי על זיהום עם inducer הוקמה אינטרפרון, נגיף קדחת בקעת שיבוט מוטציה 13 (Cl 13). עיכול טריפסין מוגבל מאפשר לנתח שינויים ברגישות פרוטאז, המצביע על שינויי קונפורמציה של PRRs. עיכול טריפסין של lysates מתוצאות תאים נגועים מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I ו PKR, whereaזיהום של Cl 13 מוביל להופעתה של פרוטאז עמיד RIG-שבר. גם PKR מראה התנגדות חלקית מושרה וירוס לעיכול טריפסין, אשר עולה בקנה אחד עם זירחון סימן ההיכר שלה בThr 446. היווצרות RIG-I ו oligomers PKR היה תוקף על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד). עם הזיהום, יש הצטברות חזקה של RIG-I ו מתחמי oligomeric PKR, ואילו חלבונים אלה נותרו כמונומרים בדגימות נגועות מדומה. עיכול מוגבל פרוטאז ועמוד מקורי, שניהם יחד לניתוח כתם מערבי, מאפשרים מדידה רגישה וישירה של שני שלבים שונים של RIG-I ו הפעלת PKR. טכניקות אלה קלות ומהיר יחסית לביצוע ואינו דורשות ציוד יקר.

הכרה באגוניסט ויראלי ידי RIG-I או PKR מפעיל מיתוג קונפורמציה 6,17,30 וoligomerization 6,18,27. אנו assayed שני סמני הפעלה אלה על ידי עיכול פרוטאז מוגבל וג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד), בהתאמה. תאי A549 אדם היו נגועים בנגיף קדחת שיבוט בקעת 13 (Cl 13), אשר מאופיין על ידי מוטציה של אנטגוניסט IFN NSS 35,36. בשל העדרו של NSS הפונקציונלי, 13 Clone חזק גורם RIG-I ו PKR,...

הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות.

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

מגננות הגנה מולדת מפני זיהומים נגיפיים מופעלות על ידי קולטני זיהוי תבניות (pattern recognition receptors) או prrs. קולטנים אלו נמצאים בתאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום. קולטני PRR ציטופלזמיים, RIG-I ו-PKR, נקשרים ל-RNAs בעלי חתימה נגיפית, משנים את קונפורמצייתם לאחר ליגציה ומפעילים סיגנל אנטי-ויראלי. כדי לנטר את השינויים הקונפורמציונליים של RIG-I ו-PKR ואת הליגציה שלהם in vitro, תאי A549 אנושיים מודבקים בנגיף חום עמק השריף (Rift Valley fever virus).שימוש בשיבוט 13 כדי לעורר הפעלה של PRR. לאחר מכן מכינים ליזאטים של תאים מהקבוצה השליטה ומתאים מזוהמים כדי לנתח שינויים קונפורמציונליים ב-rig eye וב-PKR. מבוצע עיכול מוגבל באמצעות tryin.אם התרחשו שינויים קונפורמציוניים במבנה החלבון, החלבון יהיה עמיד יותר לעיכול ופסים ייראו בניתוח Western blotting כדי לנתח את היווצרות ה-allgas; בניתוח זה מבוצע native page ולאחריו ניתוח western blotting. אם התרחשה ליגנטיזציה מלאה, ייראו קומפלקסים גבוהים יותר של all liga rig eye ו-PKR. היתרון המרכזי של עיכול פרוטאז מוגבל ו-native page הוא שטכניקות אלו מאפשרות מדידה ישירה של הפעלת rega ו-PKR.שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום החסינות המולדת, כגון מהו הטבע המדויק והמקור של מיני ה-RNA הרלוונטיים להפעלת RIG-I ו-PKR. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי אגוניסטים של RIG-I ו-PKR. ניתן ליישמן גם על חלבוני חיישן ציטופלזמיים אחרים כגון MDA5; את הפרוצדורה תדגים מילה ויווה, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי, לפני תחילת הפרוצדורה.שימו לב כי שיבט 13 של נגיף חום עמק הריפט, אשר יכונה להלן CL 13, הוא מוטציה נגיפית מוחלשת, שבגרמניה יש לטפל בה בתנאי BSL 2. יש לחמם מראש מצע PBS נטול סרום ומצע לתרבית תאים המכיל 5% FCS. הניח אותם באמבט מים בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הכן תמיסס של 1.25 × 10⁷ PFU למילו ליטר של CL 13 במצע נטול סרום כדי להדביק 2.5 × 10⁶.הדבקו תאי A 5 49 בריבוי זיהום (MOI) של חמש; הכינו כ-10% יותר מהכמות הדרושה כדי לפצות על שגיאות פיפטינג. הוציאו את תאי ה-A 5 49 מהאינקובטור, שאבו את המצע והוסיפו 10 milliliters של PBS; סובבו או הטו את בקבוק התרבית כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן הסירו את ה-PBS. בשלב הבא, הוסיפו one milliliter של CL 13 מדולל, או עבור ביקורת לא מזוהמת (mock infection).הוסיפו 1 mL של מצע ללא סרום והדגירו למשך שעה, עם ערבוב כל 15 דקות. הטו את הבקבוק בזהירות כדי להבטיח פיזור שווה של המצע. לאחר שעה אחת של הדבקה, הסירו את האינוקולום.הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע תרבית תאים שחומם מראש עם 5%FCS, והדגרירו למשך חמש שעות. הכינו PBS עם 0.5%tritton X 100 והניחו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אין להוסיף מעכבי פרוטאז סיריים.בשלב הבא, שטפו את התאים ב-PBS קר והוסיפו 10 milliliters של PBS טרי. לאחר מכן, בעזרת גורר תאים (cell scraper), נתקו את התאים מהצלחית. העבירו את תרחיף התאים לפרועת קונית של 15 milliliter וסבבו בצנטריפוגה ב-800 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הסבוב, הסר את העל-נוזל (supernatant) וסספנד מחדש את משקע התאים ב-30 µL של PBS עם 0.5% Triton X 100. העבר את הלייזט לפרונטה נקייה של 1.5 mL והדגר למשך 10 דקות לפחות על קרח. סבב את הלייזט בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את ליזט התאים המזוקק לפרועת מבחנה חדשה. בצעו בדיקת Bradford כדי לקבוע את ריכוז החלבון בליזט התאים המזוקק. אחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או המשיכו מיד לעיכול בטריפסין או ל-native PAGE כדי לבחון שינויים קונפורמציונליים של קולטני זיהוי תבניות (pattern recognition receptors). ראשית, דללו TPCK trypsin או chloro-methyl ketone treated trypsin ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 µg/mL בשתי מבחנות חדשות עבור כל תנאי. בשתי מבחנות נוספות, כוון את ריכוז החלבון הסופי של ה-CL 13 ושל ליזטים של חלבוני ביקורת לא מזוהמים ל-25 µg בנפח סופי של 9 µL עם PBS. סט אחד של ליזטים ישמש כביקרת קלט (input control) והשני יעובד עם TPCK trypsin. למבחנות הביקורת שאינן מעובדות, הוסיפו 1 µL של PBS לשתי המבחנות הנותרות.הוסיפו 1 µL של TPCK trypsin בריכוז של 2 µg/µL כדי להביא את הריכוז הסופי ל-0.2 µg/µL. ערבבו את התגובות באמצעות פיפוט. דגרו את הליזטים בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות.עצרו את התגובה על ידי הוספת פי חמישה מתמיס דגימה דנטורטיבי (denaturing sample buffer) ולאחר מכן הרתיחו במשך חמש דקות ב-95 °C. חשוב שלא להאריך את זמן דגראציה של ה-trypsin. שימו לב כי תזמון מדויק של עיכול ה-trypsin הוא קריטי לזיהוי מקטעים עמידים ללא רעש רקע; אם לא זוהו חלבונים עמידים, או אם זוהו רבים מדי, התאימו את משך העיכול בהתאם.לאחר ההרתחה, יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או להעמיס את הדגימות על שני ג'לים של sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, המורכבים מ-stacking gel בריכוז 5% מעל resolving gel בריכוז 12%. יש להפריד את החלבונים בזרם של 25 מיליאמפר לכל ג'ל עד להגעה של ה-bromophenol blue לקצה.לאחר הרצת הג'לים, העבירו את החלבונים מג'ל אחד לממברנת פוליביניליד פלואוריד (PVDF) ובצעו ניתוח באמצעות Western blotting עם נוגדנים המופנים ל-RIG-I ו-PKR. צבעו את הג'ל השני ב-Coomassie Brilliant Blue G-250. לאחר מכן, אחסנו את הג'ל ב-25% ethanol, 8% acetic acid ו-4% glycerol בטמפרטורה של 4°C, או המשיכו לביצוע הדמיה וניתוח. כדי לנתח מצבים אוליגומריים של קולטנים לזיהוי תבניות (PRRs), הכינו 50 µg של ליזט תאים בנפח סופי של 10 µL עם PBS והוסיפו 5x sample buffer עד לריכוז סופי של 1x.העמיסו מיד את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד (poly acrylamide) טבעי עם ג'ל ריכוז 5%stacking וג'ל ריכוז 8%resolving. כל עיכוב יוביל לאובדן של קומפלקסים טבעיים. הרצו את הג'ל בזרם של 20 milliamps לכל ג'ל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הפסיקו את האלקטרופורזה 45 דקות לאחר שפס ה-Bromo phenol blue עזב את הג'ל, לאחר סה"כ של כ-1.5 עד שתי שעות. לאחר מכן, בצעו Western blotting באמצעות נוגדנים המכוונים נגד RIG-I ו-PKR כפי שמתואר במסמך המצורף, כדי לבחון מעבר קונפורמציונלי והשראת אוליגו עקב זיהוי של אגוניסט ויראלי על ידי RIG-I או PKR. עיכול חלקי על ידי פרוטאוז ו-native PAGE בוצעו כפי שמתואר בסרטון זה; עיכול של ליזאטים של תאים שסריקו (mock infected) באמצעות טריפסין הוביל לפירוק מהיר של RIG-I, בעוד שזיהום על ידי clone 13 הוביל ליצירה של פרגמנט עמיד של RIG-I במשקל 30 kilodalton. PKR מראה אף הוא עמידות חלקית לעיכול בטריפסין בדגימות מזוהמות, דבר החופף לפוספורילציה שלו. כדי לנטר את היעילות והספציפיות של עיכול הטריפסין, הג'לים נצבעו ב-Coomassie brilliant blue G-250. דגימות לא מטופלות מראות כמויות שוות של חלבונים שהועמסו; עיכול של ליזאטים של תאי mock ו-C13 באמצעות טריפסין מוביל לירידה דומה בכמויות החלבון הכלליות.הדבר מוכיח כי הטיפול ב-tripsin בעל אותה יעילות עבור דגימות mock ודגימות שהודבקו ב-CL 13 בתאים שאינם מזוהמים. רק מונומרים של R EYE ו-PKR זוהו כבקרת נוספת. גורם השעתוק IRF three נכלל במחקר; הוא קיים כמונומר, אך ידוע כי הוא עובר דימרציה בעקבות הפעלה באמצעות R Eye.הדבקה ב-Clone 13 מובילה להצטברות חזקה של קומפלקסים אוליגומריים של rig eye בצורה של מריחה (smear), ושל דימרים או אוליגומרים של PKR ו-IRF three כפס חלבון מוגדר. תוצאות אלו מדגימות כי עיכור מוגבל בביצוע עיכול ו-native page הם כלים שימושיים לניטור שינויים קונפורמציוניים ויצירת אוליגומרים של rig eye ו-PKR בעקבות הדבקה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של האופן שבו ניתן לנטר את מעבר הקונפורמציה ואת האוליגומריזציה של WIC eye ו-PKR לאחר רכישת המיומנות.ניתן לבצע טכניקה זו במשך יומיים בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע בדיקות דומות למדידת קישוריות (like pro assays) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קיומה של אינטראקציה יציבה עם הליגנד הממריץ לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום החסינות המולדת לבחון את מצב ההפעלה של קולטני זיהוי תבניות בתאים שעברוהסטימולציה נגיפית.

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח...

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

כפול גדילי RNA שהופק במהלך שכפול וירוס רנ א ניתן לזהות על ידי קולטנים זיהוי תבנית כדי ליצור תגובה חיסונית מולדת. וירוסים RNA שלילי-סנס, האינטראקציה בין dsRNA ברמה נמוכה PRRs עדיין לא ברור. פיתחנו שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש arenavirus dsRNA ו- PRR בתאים בודדים.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.

מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות

שיטת כתמי האבן המערבית המקומית לניתוח מקדם אינטרפרון הרגולציה האנדוגניים מהווה 5 דימרזציה בשורת התא הדנדריאיד של CAL-1 מתוארת. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על קווי תאים אחרים.

מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.

ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

פרוטוקול זה מתאר שיטה מקיפה להערכת הפעלת קספאז (קספאז-1, קספאז-3, קספאז-7, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-11) בתגובה הן למודלים במבחנה והן ב-in vivo (בעכברים) של זיהום, עלבונות סטריליים וסרטן כדי לקבוע את התחלתם של מסלולי מוות תאי, כגון פירופטוזיס, אפופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis.

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

הגברת אות טירמיד במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית מאפשרת זיהוי רגיש של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון במהלך נקרופטוזיס הנגרם על-ידי ZBP1 לאחר זיהום ב-HSV-1.

הגברת אות טירמיד להכתמה אימונופלואורסצנטית של זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו- MLKL לאחר זיהום HSV-1 בתאים אנושיים

למדו לנטר שינויים קונפורמציונליים בקולטנים RIG-I ו-PKR בתגובה לזיהום ויראלי. השיטה משתמשת בעיכוב פרוטאזה מוגבל ודף נייטיב כדי לחקור מנגנוני איתות נגד-ויראליים בתאי A549.

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

גלה סרטונים נוספים