ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה
13 במאי 2014
אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לסמן באופן פלואורסצנטי ולכמת את כמות ה-RNA הנולד המיוצר תחת תנאי טיפול, וזאת באמצעות ניתוח דימוי כמותי. תאים בתרבית שנשתלו על זכוכית כיסוי מטופלים בבסיס המodified alkein, שנקרא להלן 5-EU, ומודגסים תחת תנאי היפוקסיה.
במהלך הדגירה, 5 EU נטמעים בזמן סינתזת ה-RNA מבלי להפריע למנגנון התעתוק התאי. לאחר מכן, ה-5 EU הנטמעים מסומנים פלורסצנטית על ידי ביצוע תגובת click, או cycloaddition של azide-alkyne המזוירה על ידי נחושת. ה-RNA העודף המסומן פלורסצנטית נדגם לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיית פלורסצנציה, והתמונות שהתקבלו מנותחות כדי להשוות את כמות ה-RNA שהופקה תחת תנאי טיפול ותנאי בקרה.
ניתוח סטטיסטי של הנתונים שהתקבלו מראה את השינויים ביצירת RNA ראשוני בתגובה להיפוקסיה, באמצעות כימות של חמישה מקרי שילוב של EU וזיהוי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון BCR כמותי, הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה ישירה של ייצור RNA בתאים ברמה של תא בודד. למרות שבמקרה זה אנו משתמשים בשיטה זו כדי לבחון כיצד תאים מגיבים לרמות חמצן נמוכות, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון תגובות לתרופות כימותרפיות.
התגובות שלנו לתגובות דחק נוספות המדגימות פרוצדורה יבוצעו על ידי ג'ון לסטון, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, בעזרת איש קובה, גם הוא סטודנט לתואר שני, והומנה דרוקר, עמיתת פוסט-דוקטורט. לבסוף, גאס פרגוסון ידגים את השימוש בתוכנה להדמיה ויזואלית. התחילו את הניסוי על ידי טבילה של מספר כיסויי זכוכית ב-70% ethanol כדי לעקר אותם.
הניחו את לבישי הזכוכית (cover slips) על קצה פלטה בתוך מבת תרביות רקמה והניחו להם להתייבש באוויר תחת זרימה למינרית. לאחר שהלבישיים יבשו, הניחו לביש אחד בכל אחת משש צלחניות בנפח 3.5 סנטימטר. הוסיפו שתי מיליליטר של DMEM מלא וחם לכל צלחנייה.
לחצו בעזרת פינצטה כדי להבטיח שכל זכוכית כיסוי נשארת צמודה לתחתית הבאר. כדי לנתק את תאי U2 OS מכלית תרבית הרקמה, שטפו פעם אחת עם 3 mL של PBS. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של trypsin 0.05% חם ו-EDTA 1%, והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך שבע דקות.
לאחר שבע דקות של Resus, השעו את התאים ב-6 mL של DMEM מלא וחמים כדי לנטרל את ה-trypsin EDTA. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והזרקו לכל אחת מהצלחות בקוטר 3.5 cm המכילות זכוכית כיסוי 2×10⁵ תאים. נערו בעדינות את הצלחית כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים, והדגרירו למשך לילה ב-37 °C, 21% oxygen ו-5% carbon dioxide כדי לאפשר לתאים להיקשר.
ביום למחרת, הוציאו חמישה מהצלחות מהאינקובטור. השאירו את הצלחת הנותרת ללא הפרעה; היא תשמש כביקורת חיובית נורמוקסית.
הניחו ארבעה מבין הצלחות המעבדה בתחנת העבודה להיפוקסיה. חשפו את התאים לתנאי היפוקסיה למשך 75 דקות, 90 דקות, שעתיים ו-24 שעות. עבור הצלחת היתרה.
הוסיפו actinomycin D למצע עד לריכוז סופי של 10 µg/mL והחזירו את הכלי לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C תחת תנאי חמצן רגילים למשך ארבע שעות. כלי זה משמש כביקורת שלילית נורמוקסית (normoxic negative control). בזמן שהתאים דוגרים, הכינו ורסמו את הרכיבים הבאים כהכנה לבדיקת ה-click it.
ערכת בדיקת click-it, PBS ב-pH של 7.2 עד 7.6, 3.7% Paraformaldehyde ב-PBS, 1% Triton X 100 ב-PBS, מים דה-יוניים, dimethyl sulfoxide, sodium hydroxide 10 molar, 37% hydrochloric acid וסרטי אינדיקטור ל-pH. עליך לתכנן להיות מוכן להתחיל את הבדיקה המסומנת תחת תנאי הטיפול. שעה לפני סיום הטיפול בהיפוקסיה, להסמנת התאים, הכן תמיסת עבודה דו-כפולת (2x) של EU מהמלאי של 100 millimolar במצע מלא שחומם מראש.
בשלב הבא, הוסיפו לנבדי התרבית המכילים את התאים שעובדו עם actinomycin D נפח שווה של two XEU, ובכך דללו את ה-EU לריכוז העבודה. לאחר מכן, בתוך תא ההיפוקסיה, הוסיפו את מלאי ה-EU לתאים שעובדו בהיפוקסיה. דגרו למשך שעה אחת בתנאי תרבית תאים תחת הטיפול לאחר טיפול ההיפוקסיה, או למשך ארבע שעות עבור הביקרות.
שטפו כל כלי פעם אחת ב-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת Stock של 3.7% Paraformaldehyde תחת תנאי הטיפול, והדגרימו למשך 15 דקות תחת תנאי הטיפול. לאחר הקיבוע, הוציאו את התאים מתא ההיפוקסיה והעבירו אותם למכסוף. שפכו את חומר הקיבוע תוך הקפדה על השלכה אחראית של פסולת ה-para formaldehyde.
לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS. בצעו את השלבים הבאים בטמפרטורת החדר, תוך שמירת כל התמיסות על קרח בטמפרטורה של 2 עד 6 מעלות צלזיוס. כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization), הסירו את תמיסת השטיפה והוסיפו לכל באר 1 מיליליטר של 1% Triton X 100 ב-PBS; דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הסיר את באפר החדירה (permeation buffer) ושטוף כל באר פעם אחת עם PBS. הסר את תמיסת השטיפה מהתאים והוסף 500 microliters של תערובת תגובה (reaction cocktail) מהערכה לדימוי RNA שהוכנה טרי לכל דגימה. הגן על התאים מאור והדגס למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, הסר את תערובת התגובה, הקוקטייל והשטיפה של ערכת דימוי ה-RNA. לאחר שטיפה אחת עם 1 mL של תמיסת שטיפה (rinse buffer) מתוך ערכת דימוי ה-RNA, ניתן לבצע בשלב זה סימון של נוגדנים נוספים. כדי לצבוע את ה-DNA, שטוף את הדגימות ב-PBS, ולאחר מכן דלל את ה-herst 3, 3, 3, 4, 2 ביחס של 1:1000.
ב-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת HERC המדוללת לכל אחד. הגנו היטב מאור והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הסירו את תמיסת ה-HERC ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS לצורך הרכבת זכוכיות הכיסוי.
הניחו 10 µL של מדיום קיבוע (mounting medium) במרכז של זכוכית מיקרוסקופ סטנדרטית. הנחו את זכוכית הכיסוי כאשר צד התא פונה כלפי מטה על טיפת מדיום הקיבוע. הימנעו מיצירת בועות, שכן אלו יסתירו את רכישת התמונות בהמשך.
מרחו לק שקוף סביב היקף זכוכית הכיסוי כדי לקבע אותה לפסנתר המיקרוסקופ. המתינו לייבוש הלק במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס, תוך הגנה מאור.
לאחר ההרכבה, רכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב המסוגל לגילוי פלואורסצנציה. בצעו דימיון באמצעות עדשת טבילה בשמן 40 V 1.30 NA ודגמו תמונות עם מצלמת CCD מקוררת. יש לדגום לפחות 30 תאים לאחר רכישת התמונות.
השתמשו בתוכנה לעיבוד תמונות כדי לבצע דה-קונבולוציה (deconvolution) לתמונות. פעולה זו תתקן עיוותים אופטיים על ידי החלת נוסחה מתמטית מבוססת תוכנה על התמונות שהוצגו. התוצאה היא תמונה ברורה יותר שתבטיח שהניתוח הבא יתמקד בתאים המצולמים בלבד.
בשלב הבא, ייבא את התמונות לתוכנת הלקוח של Omer O. תמניות של כל התמונות שהתקבלו יוצגו לצורך נרמול הגדרות הרינדור עבור כל התמונות באותו ניסוי. החל את הגדרות הרינדור מהתאים הנורמוקסיים של הביקורת על כל שאר התנאים באמצעות כלי ה-ROI (אזור עניין) בתוכנת הניתוח.
בחרו גרעינים מכל תמונה בתוכנה. בחרו באפשרות של ניתוח עוצמה (intensity analysis) והשיגו עוצמות ממוצעות עבור כל ROI עבור 30 עד 50 תאים. שמרו את הנתונים ולאחר מכן חשבו את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל תנאי.
לבסוף, באמצעות תוכנה לגרף נתונים, צור גרפי פיזור של כל ערכי העוצמה הממוצעים האינדיבידואליים כדי לשקף את השונות בין התאים תחת כל תנאי. הצגת נתוני העוצמה באופן זה היא יעילה מכיוון שהיא מאפשרת השוואה מהירה של תוצאות הטיפולים ומדגימה בבירור הטרוגניות משמעותית בתוך אוכלוסיית תאי הטיפול, שאלמלא כן הייתה מוסתרת בייצוג נתונים סטנדרטי. לחלופין, צור גרפי עמודות כדי לייצג את העוצמה הממוצעת הפלוס סטיית תקן של RNA ראשוני (nascent RNA), כדי לקבוע כמותית את סך סינתזת ה-RNA. תאי U2 OS שטופלו בהיפוקסיה ותורגדו בנוכחות 5-ethynyl uridine או EU עובדו ואושלחו לניתוח.
כפי שהודגם בסרטון זה, עוצמות הפלואורסצנציה מכל התאים בכל אוכלוסיית טיפול חושבו כממוצע ושרטטו בגרף. בתרשים עמודות זה, נעשה שימוש במבחן t של סטודנט כדי לחשב את ההסתברות הסטטיסטית של כל קבוצת טיפול להוות הבדל משמעותי מהביקורת. באופן מעניין, נתונים אלו מראים כי קיימת עלייה מובהקת סטטיסטית בסינתזה גלובלית של RNA לאורך זמן.
כאשר תאי U2 OS מטופלים בהיפוקסיה למשך זמן העולה על שעה וחצי, כפי שצפוי, טיפול ב-ACTO mycin D מבטל לחלוטין את עוצמת הפלואורסצנציה. נתונים אלו מצביעים על כך שלאחר תקופות ארוכות יותר של טיפול בהיפוקסיה, התא ממקד את מאמציו בייצור RNA, גם בסביבה היפוקסית עוינת זו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הסימון והכימות של RNA נולד (nascent RNA) ברמת התא הבודד בתנאי היפוקסיה ונורמוקסיה; ברגע שהטכניקה תהיה שולטת, ניתן לבצע אותה תוך שעתיים בהתאם להליך זה.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעה משולבת עם נוגדנים ל-RNA polymerase ול-HIF, כדי לקבוע אם רמות ה-RNA polymerase השתנו והאם HIF הופעל. זכרו כי עבודה עם פורמלהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר במהלך ביצוע הליך זה. הקפידו תמיד להשתמש בכפפות ולעבוד תחת מapay.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה חדשנית לניתוח סינתזת RNA גלובלית בתנאי היפוקסיה באמצעות דימות. השיטה עושה שימוש בסימון RNA באמצעות כימיית קליק (click-chemistry), המאפשרת ויזואליזציה של שינויים ב-RNA ברמת התא הבודד, ובכך משלימה טכניקות מסורתיות של מדידת RNA ממוצע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- ניתוח RNA
רקע
- הבנת סינתזת RNA תחת היפוקסיה היא חיונית לחקר התגובות התאיות לרמות חמצן נמוכות.
- שיטות קיימות מבצעות לעיתים קרובות מיצוע של נתוני RNA, ובכך מסתירות תגובות של תאים בודדים.
- סימון באמצעות כימיית קליק (Click-chemistry) מאפשר ויזואליזציה ישירה של ייצור RNA.
- ניתן ליישם טכניקה זו גם כדי לחקור תגובות לתרופות כימותרפיות.
מטרת המחקר
- לסימון פלואורסצנטי וכמות של RNA ראשוני המיוצר בתנאי היפוקסיה.
- להדמיה של שינויים בסנתזת RNA בין תאים.
- לשיפור טכניקות קיימות לניתוח RNA.
שיטות שהשתמשו בהן
- תאים מטופלים בבסיס שעבר מודיפיקציה של אלקין ומודג 갑רים בתנאי היפוקסיה.
- RNA שהטמע בסיס מסומן פלואורסצנטית באמצעות תגובת קליק.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשת לדמיון של ה-RNA המסומן.
- ניתוח סטטיסטי מבוצע כדי להשוות בין ייצור RNA בתנאים שונים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של ייצור RNA ברמת התא הבודד.
- ניתוח סטטיסטי חושף שינויים משמעותיים בסינתזת RNA בתגובה להיפוקסיה.
- השיטה מדגימה יתרונות על פני טכניקות כמותיות מסורתיות.
- יישומים פוטנציאליים משתגברים לחקר תגובות דחק שונות בתאים.
מסקנות
- גישה חדשנית זו משפרת את ההבנה של דינמיקת RNA תחת תנאי עקה.
- היא מספקת כלי רב עוצמה לחוקרים הלומדים תגובות תאיות להיפוקסיה ולטיפולים אחרים.
- ורסטיליות השיטה מאפשרת יישומים רחבים יותר במחקר ביולוגיה תאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של סינתזת RNA ראשוני ברזולוציית תא בודד תחת תנאי היפוקסיה, ובכך היא נותנת מענה למגבלה מרכזית של בדיקות המבוססות על ממוצע אוכלוסייה, המטשטשות תגובות תאיות הטרוגניות. באמצעות כימות השונות הזמנית והשונות בין תאים בייצור RNA, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה ומשפרת את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים של מחלות המונעות על ידי היפוקסיה, כגון סרטן ואיסכמיה. גישה זו מחזקת את הרצף התרגומי על ידי קישור פנוטיפים מולקולריים לתוצאות פונקציונליות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הטרוגניות תעתוקית בסביבות מיקרו-היפוקסיות, ובכך מבהיר את הפעלת המסלולים ואת המעורבות של מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות מבוססות דימוי להערכת מודולציה של מטרות בתאים בודדים, ובכך מפחית את ההסתמכות על ממוצעים של אוכלוסיות תאים כוללות.
- ערך ניבוי: תומך בסריקה פנוטיפית על ידי זיהוי תת-אוכלוסיות בעלות תגובות שונות של סינתזת RNA למעקה היפוקסי או לטיפול בתרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של השתלבות RNA נבט (nascent RNA) באמצעות סימון EU וגילוי באמצעות כימיית קליק (click-chemistry).
- ערך תפעולי: תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולתהליכי ניתוח תמונות, מה שמאפשר פורמטים של בדיקות הניתנים להרחבה ולריבוי (multiplexable) לצורך סריקת תרכובות.
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתוני עוצמת פלואורסצנציה כמותיים שניתן לנרמל ולנתח סטטיסטית כדי להשוות השפעות של טיפולים בין תנאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה עקה היפוקסית בתאי סרטן (U2 OS), מערכת הרלוונטית למחקרים של מיקרו-סביבת הגידול ולטיפולים המכוונים לאנגיוגנזה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תגובות שעתק מוקדמות להתאמות פנוטיפיות במורד הזרם, ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות סיכון בפיתוח פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: חושף סינתזת RNA מתמשכת תחת היפוקסיה ממושכת, דבר המצביע על תוכניות שעתק אדפטיביות שעשויות להשפיע על עמידות טיפולית או על נתיבי הישרדות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך זיהוי מובילים (leads), ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד עבור מטרות המודולות על ידי איתות היפוקסי או הסתגלות מטבולית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי מסלולי חישוש חמצן ורגולטורים תעתוקיים באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת סינתזת RNA בזמן אמת ברזולוציה של תא בודד.
- סריקה: מאפשרת פיתוח בדיקות עבור תרכובות המשנות את התגובה להיפוקסיה, עם פלטי דימות כמותיים התומכים בתיקוף פגיעות (hit validation) ובמחקרים של קשר מבנה-פעילות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים של עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת וסטיית תקן לכל תנאי, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית (למשל, student’s T-test) של שינויים בסינתזת RNA בין קבוצות טיפול ובנקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשרת פעילות תעתוקית מושרית-היפוקסיה לאדפטציה תאית במודלים של מחלות, ובכך תומכת בהלימה של סמנים ביולוגיים ובתובנות מכניסטיות בתהליכי עבודה פרה-קליניים.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה מבוססת-דימות לשימוש חוזר להערכת תגובות תעתוקיות לגורמי עקה מגוונים, כולל חומרים כימותרפויטיים ומצבים איסכמיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי חשיפת ההטרוגניות בין תאים בסינתזת RNA, ובכך מפחית את מספר התוצאות השליליות השגויות הנובעות מנתונים ממוצעים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מדידת סינתזת RNA באמצעות סימון בכימיית קליק (click-chemistry) ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות וניסויים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות זיהוי תתי-אוכלוסיות עם פעילות שעתוק מתמשכת תחת עקה, המעידה על מנגנוני עמידות פוטנציאליים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעתן על תוכניות שעתוק היפוקסיות ותגובות סתגלניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, תפעול של תחנת עבודה להיפוקסיה ודימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בריאגנטים של כימיית קליק (EU, צבעי azide, זרז נחושת) ובמערכות דימות תואמות עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, פרמיאביליזציה וסימון כדי להבטיח גילוי אות עקבי בין דגימות.
- דורש התאמה של זמני האינקובציה וריכוזי EU כאשר מיישמים זאת על סוגי תאים שונים או תנאי עקה מעבר להיפוקסיה.
- מוגבל בשל הצורך בציוד אינקובציה מתמחה לבקרת היפוקסיה וטיפול זהיר במקבעים מבוססי פורמאלדהיד.
