הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב Xenopus חלץ ביצה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש במערכת תמצית ביצי קסנופוס ביוכימית נטולת תאים כדי לנתח בטא קטין במחזור. זה מושג על ידי הוספה ו/או דלדול אפקטורים חשודים לתמצית ביצי XIP מופעלת על מנת לזהות מודולטורים של תחלופת בטא-קטנין כשלב שני אקסוגני במבחנה, מתומלל ומתורגם, מתווסף לתמצית ביצי XUS, המתפרקת באופן פעיל בתנאים טבעיים. לאחר מכן, אספו נקודות זמן על מנת להעריך את השינויים ברמות הבטא קטין והחלבון לאורך זמן.

מתקבלות תוצאות המראות אם אפנון מסוים של תמצית ביצי קסנופוס מגדיל או מקטין את שיעורי הבטא קטין והשפלה על סמך רדיוגרפיה אוטומטית ו/או זיהוי זוהר. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון ניסויי מרדף דופק או מרדף מחזורי היידה בתאים מתורבתים הוא שתמצית ביצי קסנופוס מספקת מערכת ביוכימית נטולת תאים בה ניתן לנתח את ויסות החלבון ברמת החלבון, והיא חסרה את המורכבות הנוספת של שעתוק פעיל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום העברת האותות על ידי זיהוי מווסתים של חלבוני איתות מרכזיים כגון בטא קטינה.

עבודה עם תמצית קסנופוס מאפשרת למשתמש לרוקן בקלות רכיבים של מסלול ולהוסיף בחזרה כמות מוגדרת של חלבון. כדי לקבוע את ההשפעות התלויות במינון, השתמש בתמצית ביצי XUS שהוכנה טרייה או הפשיר במהירות, תמצית קפואה והניח על קרח. בצע את כל המניפולציות בקור, הכין נוגדנים או חרוזי זיקה בעשירית מנפח התמצית על מנת למזער את דילול התמצית, למשוך כמה שיותר נוזלים מהחרוזים לפני הוספת התמצית.

באמצעות טיפים לטעינת ג'ל עם קצוות מחודדים ארוכים כאן מוסיפים את התמצית לשרף קשירת GST. סובבו את תערובת חרוזי התמצית בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן סובבו את תערובת חרוזי התמצית ב-12, 600 גרם במיקרו פוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

מקפידים לא להעביר חרוזים עם התמצית. העבירו את התמצית המדולדלת לצינור מיקרו פוגה טרי על קרח. אשר את יעילות הדלדול על ידי ספיגה חיסונית, הן תמצית מדולדלת והן חרוזים.

מכיוון ש-T ופירוק תלויים באנרגיה, הם מרוקנים במהירות את מאגרי ה-A TP האנדוגניים. כתוצאה מכך, על מנת לשמור על פירוק T חזק, עליך להשתמש בתערובת התחדשות אנרגיה. הכן חידוש אנרגיה פי 20 או תערובת ER כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הפשירו במהירות תמצית ביצי אופוס על ידי שפשוף הצינור הקפוא בין הידיים. הניחו את הצינור על קרח רגע לפני שכל התמצית נמסה. הוסף 10 מיקרוליטר של התחדשות אנרגיה.

מערבבים לתוך כמות תמצית ביצי קסנופוס. מערבבים היטב על ידי לחיצה מהירה על הצינור ומערבולת דופק סיבוב, ומניחים מיד על קרח. ציטט את הנפחים המתאימים לבדיקת הפירוק לצינורות מיקרו פוגה מקוררים מראש על קרח.

כדי להתכונן לבדיקות בטא קטין ופירוק עם תווית רדיו, משוך שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תמצית עבור כל נקודת זמן כדי לבצע את בדיקת פירוק בטא-קטנין המסומנת ברדיו בתמצית ביצי XUS. ראשית, הכן את הרדיו המסומן בטא-קטנין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסף 1 עד 3 מיקרוליטר של בטא-קטנין מתורגם במבחנה ל-20 מיקרוליטר של תערובת תגובת XIP על ערבוב קרח ביסודיות על ידי לחיצה מהירה של הצינור ופולס קצר של מערבולת.

זהו צעד חשוב. תמצית ביצת XUS היא צמיגה מאוד וערבוב לא שלם ישפיע על עקביות התוצאות הדופקות, מסתובבות ומניחות על הקרח. התחל את תגובת הפירוק של בטא-קטנין על ידי העברת הצינורות לטמפרטורת החדר בנקודת הזמן המיועדת.

הסר אחד עד חמישה מיקרוליטר מהדגימה וערבב מיד עם נפח פי חמישה של מאגר דגימת SDS כדי לעצור את התגובה כדי לוודא שתגובת הפירוק מסתיימת לחלוטין. החלק את הצינור מספר פעמים ומערבול במרץ כדי לבצע דף SDS. רדיוגרפיה אוטומטית מפעילה שקילות מיקרוליטר אחת של התמצית עבור כל נקודת זמן לכל נתיב.

ניתן לכמת את התוצאות באמצעות תמונה, קוונטית תמונה J או תוכנת הדמיה מועדפת אחרת. יש להוכיח פירוק של בטא-קטנין בתמצית ביצי xap על ידי הירידה התלויה בזמן בעוצמת הבטא קיין בלהקה. להכנת בטא-קטנין לוציפראז סנתז לוציפראז מתויג ללא תווית רדיו.

שימוש במערכת תרגום השעתוק המשולבת עם תערובת חומצות אמינו מלאה. אשר את ייצור הבטא-קטנין המתויג של לוציפראז על ידי מדידת פעילות לוציפראז מ-0.5 למיקרוליטר אחד של התגובה. העריכו את זוהר הרקע על ידי מדידת זוהר מתערובת תגובה לא מתורגמת כדי לבצע את בדיקת פירוק בטא קטין לוציפראז תחילה להפשיר ולהכין תמצית ביצי קסנופוס כמו קודם.

לאחר מכן הוסף את היתוך בטא קטין ולוציפראז המתורגם במבחנה לתגובת ה-XIP המוכנה. מערבבים על קרח ומערבבים היטב. כמו קודם, העבירו את התמצית לטמפרטורת החדר כדי להתחיל את תגובת הפירוק.

הסר חלק מהתגובה בנקודת הזמן המצוינת והקפיא בחנקן נוזלי. הסר דגימות משולשות לניתוח בכל נקודת זמן. ניתן לאחסן תמצית קפואה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לניתוח.

הפשירו את הדגימות על קרח והעבירו את הדגימות לצלחות לבנות סטנדרטיות של 96 בארות על קרח לפני העיבוד. עבור פעילות לוציפראז, ניתן להדגים בקלות את הפירוק התלוי של GS GSK 3 של בטא-קטנין במספר דרכים באמצעות תמצית ביצי XUS. פירוק של בטא-קטנין S 35 המסומן ברדיו בתמצית XUS מעוכב על ידי הוספת מעכב הפרוטאזום MG 1 32.

מוטנט הבטא-קטנין מיוצב בתמצית ביצי XUS ביחס למעכבי בטאין וחלבון מסוג בר של GSK, שלושה מעכבים באופן דומה פירוק של בטא-קטנין. לבסוף, ניתן להציל את דלדול GSK 3 מתמצית ביצי xip המעכב את פירוק הבטא-קטנין על ידי הוספת GSK 3 אקסוגני. בדיקת פירוק בטא-קטנין לוציפראז בתמצית ביצי XIP שימשה להערכת פירוק של בטא קטין ולוציפראז.

קצב הפירוק של בטא קטין ולוציפראז דומה לחלבון בטא-קטנין הלא מתויג. ויסות הפירוק עבור היתוך בטא קטין ולוציפראז זהה במהותו לחלבון שאינו היתוך. מכיוון שתוספת ליתיום כלוריד הביאה לעיכוב תחלופת בטא קטין ולוציפראז, שינויים באות הרדיואקטיבי של הבטא קטינה.

חלבון לוציפראז מקביל לשינויים בפעילות האנזימטית של לוציפראז לאורך זמן תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לשמור את כל הריאגנטים על הקרח ולערבב את התגובות ביסודיות לפני שמנסים לבצע בדיקה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות רגולטורים ולנתח בטא קטין ותחלופה באמצעות מערכת תמצית ביצי קסנופוס נטולת תאים.