Name: ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים Medicago truncatula רוט גושים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: למד הדמיה ספקטרומטרית MALDI לניתוח מטבוליטים ברקמות שורשי צמחים Medicago truncatula. שיטה זו מאפשרת זיהוי מרחבי של תרכובות ביולוגיות חשובות בגושי השורש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר ז&#39;אן מישל Ane במחלקה לאגרונומיה בUW-Madison עבור מתן דגימות truncatula Medicago. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מל&quot;ג-0,957,784, בית הספר למוסמכים באוניברסיטת ויסקונסין והקרן ויסקונסין בוגרי המחקר (WARF) ותכנית Romnes הפקולטה מלגת מחקר (לLL). EG מכיר בוגר מחקר אחוות NSF (DGE-1,256,259).

1. מכשור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSI MALDI-TOF/TOF. השתמש ספקטרומטר מסה מצויד במקור MALDI לניתוח של מולקולות קטנות (ראה טבלה של חומרים / ציוד). לבצע רכישות במצב יון חיובי או שלילי בהתאם לanalytes של עניין. ציין טווח המוני של עניין ולאסוף 500 יריות / כתם לייזר ב50 מיקרומטר מרווחים בשני x והממדים y על פני השטח של המדגם כדי ליצור תמונות ביון. רוחב סריקה ומספר יריות לייזר יכולים להיות מותאם כדי להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ועוצמת אות מקסימלי בהתאמה. השתמש פסגות מטריצת DHB או סטנדרטים פנימיים מוחלים על השקופית או ישירות לרקמה לכייל את הספקטרום ההמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההחלטה LC-MS גבוה. (ראה טבלה של חומרים / ציוד) מדגם תמציות הפעלה עם LC-MS או באמצעות LC שלב הפוך (RP) עם עמודת C-18, או שלב נורמלי (NP) עם עמודת HILIC בהתאם analytes של עניין. השתמש בשלבים וניידיםשיפועים מתאימים כמו לסוג מדגם המסוים. לבצע רכישות במצבי יון חיוביים או שליליים בהתאם לסוג המדגם. </li></ol> 2. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את גולה שורש מהצמח, ומשאיר 3-4 מ&quot;מ של שורש מחובר לגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר נתיחה, להשתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה בכוס cryostat ולכסות עם ג&#39;לטין (100 מ&quot;ג / מיליליטר במי deionized). זה חיוני לרקמה להיות דבוקה לתחתית הכוס ללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את הרקמה על ידי הנחת הכוס באמבט קרח / אתנול יבש עד ג&#39;לטין מתקשה והופך להיות אטום. דגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות ממקפיא -80 מעלות צלזיוס, לחתוך את כוס cryostat פלסטיק ולקצץ משם ג&#39;לטין העודף. הר הרקמות המשובצים לצ&#39;אק cryostat עם כמות בגודל מטבע של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) בתקשורת, ואילו לא לתת לאוקטובר לגעת ברקמה. הנח בcryostatתיבה עד מתמצק OCT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לצ&#39;אק וג&#39;לטין לאזן בתיבת cryostat (סט ל-20 או -25 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cryostat (ראה טבלה של חומרים / ציוד) לרקמות סעיף כ העובי של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג הרקמה) והפשרת הר כל פרוסה על גבי הזכוכית המצופה-איטו ידי ההתחממות בחזרה (לא איטו מצופה בצד) של שקופיות זכוכית מצופים איטו על גב היד שלך. הנח את הצד המצופה איטו של השקופית התחממה ליד פרוסת הרקמה הקפואה ולאפשר הפרוסה להיצמד לשקופית. הצבת החלקים קרוב זה לזה בשקופית תספק התאמה טובה יותר במהלך MSI. </li></ol> 3. מטריקס יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום מברשת אוויר של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את כל הליכי מברשת האוויר במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את מיכל airbrush פתרון וזרבובית (ראה טבלה של חומרים / ציוד) עם מתנול ולמלא את מיכל הפתרון עם פתרון מטריצת DHB (150 מ&quot;ג / מיליליטר ב50%% methanol/0.1 v TFA / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מברשת האוויר כ 35 סנטימטר מהמדגם ולהחיל 10-15 שכבות של מטריקס על פני השטח של השקופית עם משך 10 תרסיס שניות ו30 זמן ייבוש שניות בין כל מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את מברשת האוויר שוב עם מתנול כאשר סיימתי, כדי למנוע סתימה מפתרון המטריצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוטומטי מרסס יישום של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות הזנק המסופקות על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור MSI של מטבוליטים בגושי שורש באמצעות 40 מ&quot;ג / מיליליטר (ב50%% methanol/0.1 v TFA / V) DHB כמטריצה, הגדר את הטמפרטורה ל ~ 80 מעלות צלזיוס, מהירות ל1,250 מ&quot;מ / דקה, קצב זרימה ל50 μl / min, ומספר עובר ל24. לקבלת הכיסוי הטוב ביותר, מומלץ לסובב את הזרבובית 90 מעלות ו / או לקזז את מ&quot;מ זרבובית 1.5 בין כל מעבר. התחל בשיטת ריסוס. כsiהערה דה, מערכת מרסס המסוימת משמשת כאן מחממת את הזרבובית לאידוי מהיר יותר של הממס. כממס מתאדה, הריכוז של המטריצה ​​מגביר מהירות. יש המטריצה ​​מוחלת על המדגם עם מברשת האוויר והמרסס האוטומטי ריכוזים דומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הוראות הכיבוי שסופקו על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום העידון של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 300 DHB מ&quot;ג לחלק התחתון של חדר סובלימציה (ראה טבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד שקופיות זכוכית לאצבע הקרה (חלק העליון של חדר סובלימציה) עם סעיפי הרקמות כלפי מטה עם קלטת דו צדדית, מוליך. מכסה את כל החלק האחורי של השקופית עם הסרט דו צדדי לאף מוליכות, ייצור אפילו מטריצה ​​בתצהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את החצאים העליונים ותחתונים של חדר סובלימציה יחד עם ה-C-המהדק. חבר את הוואקום ומודעותקרח ד ומים קרים למאגר העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קאמרי סובלימציה במעטפת חימום שהיא בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת הוואקום. חכה 15 דקות ולהדליק את מעטפת החימום. מעטפת החימום צריכה להגיע 120 מעלות צלזיוס במהלך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, מכבה את האש, קרוב לשסתום ואקום (כך הפנימי של החדר נשאר תחת ואקום) ולכבות את משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר החדר כדי להגיע לטמפרטורת חדר, פתח את שסתום שחרור לחץ הוואקום ולהסיר את המדגם. הגודל של חדר סובלימציה יקבע את הסכום של מטריצה ​​בסובלימציה לשקופית הזכוכית. תאי סובלימציה גדולים יותר (בגודל של כוס מיליליטר 400) ישתמשו כ 300 מ&quot;ג DHB תוך התאים הקטנים (בגודל של כוס מיליליטר 150) ישתמשו כ 100 מ&quot;ג DHB וידרשו חיתוך שקופיות הזכוכית, כך שהוא מתאים בתא. </li></ol></li></ol> 4. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מארק דפוס + בכל פינה של המדגם עם עט נוזל תיקון WiteOut כדי לשמש &quot;נקודות ללמד&quot;. מניחים את שקף הזכוכית לתוך צלחת מתאם שקופיות MALDI ולקחת תמונה אופטית של המדגם באמצעות סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קובץ תמונת רכישה באמצעות התוכנה המסופקת על ידי חברת המכשיר עם גודל סריקה צעד של 50 מיקרומטר וקוטר לייזר שווה או קטן יותר מגודל צעד סריקה. במכשיר הספציפי הזה, הגדרת לייזר המינימום נותנת קוטר לייזר של הגדרת לייזר כ 10 מיקרומטר וקטן בעל קוטר 40-50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התמונה האופטית לתוך התוכנה וליישר את הצלחת עם התמונה האופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את המכשיר לפני תחילת הרכישה באמצעות יונים נפוצים מטריצת אשכול, סטנדרטים פנימיים, או שילוב כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את האזורים של רקמה להיות מנותחים עם MSI, כולל מקום של מטריצה ​​טהורה בשקופית כדי לשמש &quot;ריק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין acquisition. </li></ol> 5. דור תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ ההדמיה בתוכנה זמינה באופן מסחרי הניתנת על ידי הספק ולחלץ את תמונות יון. תוכנות קוד פתוח אחרות זמינה עבור עיבוד נתונים MSI 19. </li></ol> 6. זיהוי המטבוליט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מ &#39;/ z ספציפי של עניין מהספקטרום ההמוני באמצעות התוכנה ספציפית הספק (ראה טבלה של חומרים / ציוד). אנליטי ניתן להבחין בין יון מטריצה ​​כאשר שיא אנליטי נבחר מהספקטרום ההמוני ותמונות יון נוצרות במיוחד מקומית לקטע הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור רשימה של analytes של עניין ולבצע ניסויי MS / MS. ראה טבלת 1 וטבלה 2 בנציג תוצאות עבור רשימות מדגם של analytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח LC-MS ממוקד בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה המוני (או ברזולוציה גבוהה MALDI-MS אם זמין) כדי להשיג מדויקמדידות מסה של analytes של עניין וגם לבצע LC-MS/MS של analytes היעד להשיג דפוסי פיצול אופייניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חיפוש באתר כדי לקבוע הזדהויות המשוערת לanalytes הממוקד. דוגמאות למאגרי מידע המטבוליט כוללים: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, וHMDB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את ההזדהויות המשוערת מחיפוש מסד הנתונים מסה מדויק, להתאים את MS / MS מanalytes הממוקד לMS / MS הספקטרום של סטנדרטים, ספרות, ו / או תוכנת חיזוי פיצול. </li></ol>

<ol><li>Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Intact+Tissue+Sections%3A+Moving+beyond+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope.</a> J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).</li>
<li>van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+review+of+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A concise review of mass spectrometry imaging.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).</li>
<li>Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+drugs+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75, 130-145 (2013).</li>
<li>Ye, H., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+better+health%3A+mass+spectrometry+imaging+for+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics.</a> Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).</li>
<li>Wei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+Its+Practical+Value+in+Pharmaceutical+Industry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry.</a> Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Serum+Metabolomics-Based+Diagnostic+Approach+to+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidem.+Biomar%22%5BJournal%5D)">A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).</li>
<li>West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+human+developmental+toxicity+of+pharmaceuticals+using+human+embryonic+stem+cells+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).</li>
<li>Spegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+metabolomics+analysis+of+beta-cells+implicates+the+pentose+phosphate+pathway+in+the+control+of+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release.</a> Biochem. J. 450, 595-605 (2013).</li>
<li>Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+neuroAIDS%3A+The+widening+scope+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics.</a> J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).</li>
<li>Prell, J., Poole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+of+rhizobia+in+legume+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes of rhizobia in legume nodules.</a> Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).</li>
<li>Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+analysis+of+neuropeptides+by+MALDI+FTMS+in-cell+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation.</a> Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li>
<li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+%28APSGFLGMRamide%2C+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide%29+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li>
<li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+signaling+peptides+in+single+mammalian+cells+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).</li>
<li>Neupert, S., Predel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+single+identified+neurons+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li>
<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li>
<li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li>
<li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption%2Fionization-imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li>
<li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids%3A+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1%2C5-diaminonapthalene+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3%2C4%2C5-Tetrakis%283%27%2C4%27-dihydroxylphenyl%29thiophene%3A+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li>
<li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li>
<li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+sponge%3A+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li>
<li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+%28m%2Fz+616%29+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom.+Soc.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li>
<li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li>
<li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omniSpect%3A+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאמור לעיל, הכנת מדגם היא השלב הקריטי ביותר בתהליך העבודה של MSI. הטבעת הרקמה בצורה לא אחידה תגרום חתך להיות קשה או בלתי אפשרי במקרים מסוימים. גודל הסעיף וזמן איזון נאות הם קריטיים לשמירה על שלמות הרקמה וההימנעות מתקפל ודמעות. בחירה של מטריצה ​​ואת טכניקת יישום תשחק תפקיד בקביעת הסוגים של analytes כדי להתגלות, ברזולוציה מרחבית, ושחזור של התוצאות. באמצעות שילוב של מטריצות או טכניקות יישום יכול לספק תוצאות משלימות. ...

השדה הולך וגדל של metabolomics יש יישומים ביולוגיים חשובים רבים, כולל גילוי סמן ביולוגי, פענוח מסלולים מטבוליים בצמחים ומערכות ביולוגיות אחרות, ופרופיל טוקסיקולוגיה 4,6-10. אתגר טכני עיקרי כאשר לומדים במערכות ביולוגיות הוא ללמוד מסלולי metabolomic מבלי לשבשם 11. MALDI-MSI מאפשר ניתוח ישיר של רקמות שלמות המאפשר זיהוי רגיש של analytes באיברים בודדים 12,13 ואפילו תאים בודדים 14,15. הכנת מדגם היא צעד חיוני בייצור דימויי רפאים המוניים לשחזור ואמינים. האיכות של התמונות מאוד תלויה בגורמים כגון בינוני רקמות הטבעה, עובי פרוס, מטריקס MALDI, ויישום טכניקת מטריצה. עבור יישומי הדמיה, עובי סעיף אידיאלי הוא הרוחב של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג המדגם). MALDI דורש תצהיר של אורגני, Crystallinמתחם מטריצת דואר, בדרך כלל חומצה חלשה, על המדגם כדי לסייע אבלציה ויינון אנליטי. 16 מטריצות שונות מספקים עוצמות שונות אות, יונים מפריעים, ויעילות יינון של סוגים שונים של תרכובות. טכניקת יישום המטריצה ​​גם משחקת תפקיד באיכות של מסת תמונות רפאים וטכניקות שונות מתאימים לסוגים שונים של analytes. שלוש שיטות יישום מטריצה ​​מוצגות בפרוטוקול זה: מברשת אוויר, מרסס אוטומטי, ומראה. יישום מטריצת Airbrush כבר בשימוש נרחב בתחום ההדמיה MALDI. היתרון של יישום מטריצת מברשת אוויר הוא שזה הוא יחסית מהיר וקל. עם זאת, האיכות של יישום מטריצת airbrush מאוד תלויה במיומנות של המשתמש ונוטה להיות פחות לשחזור ולגרום לדיפוזיה של analytes, במיוחד מולקולות קטנות 17. יש מערכות מרסס אוטומטיות מכניקה דומה לairbrush יישום מטריצה, אבל havדואר פותחו כדי להסיר את ההשתנות ראו עם יישום airbrush ידני, מה שהופך את ספריי לשחזור יותר. שיטה זו יכולה לפעמים להיות יותר זמן רב יותר מאשר יישום מטריצת מברשת האוויר מסורתי. שני airbrush הידני ומערכות מרסס אוטומטיות שיטות יישום מטריצה ​​ממיסים מבוססות. העידון הוא טכניקת יישום מטריצה ​​יבשה שהופכת יותר ויותר פופולרי עבור ההדמיה ספקטרלי המונית של מטבוליטים ומולקולות קטנות משום שהיא מפחיתה דיפוזיה אנליטי, עם זאת, היא חסרה את צורך ממס כדי לחלץ ולבחון תרכובות מסה גבוהות יותר 18. זיהוי בטוח של מטבוליטים בדרך כלל דורש מדידות מסה מדויקות כדי להשיג הזדהויות המשוערות אחריו מסת טנדם ניסויים (MS / MS) עבור אימות, עם MS / MS ספקטרום שהשוואה לסטנדרטים, ספרות, או ספקטרום תיאורטי. , כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה פרוטוקול זה (מסת פתרון כוח של 60,000 במ &#39;/ z 400) (LC)-MS הוא מצמידים את MALDI-MSI לקבל גם מידע במרחב ובהזדהויות בטוחים של מטבוליטים אנדוגני, באמצעות Medicago truncatula שורשים וגושי שורש כמערכת הביולוגית. ניתן לבצע ניסויי MS / MS ישירות על הרקמה עם MALDI-MSI או על תמציות רקמה עם LC-MS ומשמשים לאימות של הזדהויות המטבוליט. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה למפה מטבוליטים אנדוגני בתוך: מ &#39; truncatula, אשר יכול להיות מותאם ומיושם על MSI של מולקולות קטנות בסוגי רקמות שונים ומערכות ביולוגיות.

<table><tbody><tr><td>ג'לטין</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>חום להמסת</td></tr><tr><td>Cryostat- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מצופות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)&nbsp;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 מ"מ x 75 מ"מ x 0.8 מ"מ (רוחב x אורך x עובי)</td></tr> <tr><td>מטריצת 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB)&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx? ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>Airbrush</td><td>חברת Paasche Airbrush Company</td><td>TG-100D</td><td>יחד עם מיכל פלדה 75 מ"ל</td></tr><tr><td>מערכת מרסס מטריצה אוטומטית- TM-Sspray</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX. TMSP. H021-U</td><td>הוראות הפעלה וכיבוי ספציפיות יינתנו בעת התקנת</td></tr><tr><td>המכשיר מכשיר סובלימציה&nbsp;</td><td>Chemglass Life Science</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום- Alcatel 2008 מוצרי</td><td>ואקום אידיאליים</td><td>P10976</td><td>לחץ אולטימטיבי = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>דוגמה אחת ל"תוכנה ספציפית למוכר"MALDI</td></tr> <tr><td>LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>מכשיר MALDI ברזולוציה גבוהה למדידות מסה מדויקות</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>מכשיר LC-MS ברזולוציה גבוהה למדידות מסה מדויקות</td></tr></tbody></table>

ההדמיה maldi-mass spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

רוב הטכניקות המשמשות ללמוד מולקולות קטנות, כגון תרופות סמים או מטבוליטים אנדוגני, להעסיק תמציות רקמה הדורשות הומוגניות של הרקמות של עניין שעלול לגרום לשינויים במסלולים מטבוליים נחקרים 1. ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי אנליטי רב עוצמה שיכול לספק מידע המרחבי של analytes בתוך פרוסות שלמות של דגימות רקמה ביולוגיות 1-5. טכניקה זו נעשתה שימוש נרחב ללמוד סוגים שונים של תרכובות כוללים חלבונים, פפטידים, שומנים, ומולקולות קטנות, כגון מטבוליטים אנדוגני. עם desorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס (MALDI)-MSI, הפצות המרחבי של מטבוליטים רבים ניתן לאתר בו זמנית. בזאת, שיטה שפותחה במיוחד עבור ביצוע ניסויי MSI metabolomics לא ממוקדים בשורשי קטניות וגושי שורש מוצגת שיכול לחשוף תובנות התהליכים הביולוגיים המתרחשים.שיטה שהוצגה כאן מראה זרימת עבודה MSI טיפוסית, מהכנת מדגם לרכישת תמונה, ומתמקדת בשלב יישום מטריקס, הוכחת כמה טכניקות יישום מטריצה ​​כי הם שימושיים לאיתור מולקולות קטנות. ברגע שהתמונות של הטרשת הנפוצה שנוצרו, הניתוח וזיהוי של מטבוליטים של העניין נדון והפגינו. זרימת העבודה סטנדרטית שהוצגה כאן ניתן לשנות בקלות לסוגי רקמות שונים, מינים מולקולריים, ומכשור.

סקירה ניסיונית של MSI מוצגת באיור 1. בתחילת הניסוי מאוד, הכנת מדגם היא שלב קריטי. גושים הם גזומים משורש הצמח ומשובץ בג&#39;לטין. הרקמה חייבת להיות לחוצה אל כוס cryostat, ללא בועות, בזמן שהוא קפוא, זה יהיה להבטיח יישור קל ותקין של הרקמות בזמן שהוא מחולק. כאשר הרקמה נמצאת בפרוס, חשוב לחתוך את הרקמה בעובי הנכון; רזה מדי סעיפים יקרעו, הורס את שלמות הרקמות, ואילו עבים מדי סעיפים יפחית את מספר analytes חילוץ וזוהה מהרקמות. בחירה של מטריצה ​​ואת טכניקת יישום תהיה לקבוע א...

ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ביצוע דימוי רב-מסות אמין באמצעות ספקטרומטריית מסות של מולקולות קטנות ברקמת שורש של צמחים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת דגימות הרקמה לגודל המתאים. השלב השני הוא אופטימיזציה ויישום של מטריצת maldi על דגימת הרקמה.בשלב הבא, הדגימה עוברת MALDI, ונאספים MSI וספקטרה לאורך הרקמה. השלב הסופי הוא עיבוד נתונים שבו ניתן לזהות אנליטים בעלי חשיבות ביולוגית. בסופו של דבר, MALDI MSI משמש לזיהוי מטבוליטים אנדוגניים הנמצאים בקשרי שורשים של קטניות.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המטבוליטים הנוכחים ברקמת שורש של צמחים, אך ניתן ליישמה גם לחקר מולקולות קטנות ורקמות ממערכות מודל אחרות, כולל יונקים, חרקים מעקבי רגליים ועוד. ראשית, הוצא את דגימות רקמת הצמחים שהוכנו מראש מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C-. לאחר מכן, חתוך את כוס הקריוסטט מפלסטיק והסר את עודפי הג'לטין, והצמד את הרקמה המוטמעת למחזיק של הקריוסטט באמצעות כמות קטנה (בגודל של מטבע) של מדיום OCT (optimal cutting temperature), תוך הקפדה שה-OCT לא יבוא במגע עם הרקמה.הניחו את מחזיק הדגימה (chuck) של הקריוסטט בתוך תיבת קריוסטט שהוצבה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד להתמצקות ה-OCT. לאחר השארת המחזיק והג'לטין להישיווי טמפרטורה בתיבת הקריוסטט למשך כ-15 דקות, השתמשו בקריוסטט לחיתוך הרקמה לעובי של תא אחד בקירוב. לאחר מכן, העבירו כל

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

מקור הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) המופעל בלחץ אטמוספרי פותח על ידי צימוד ספיגת לייזר אינפרא אדום בינוני ופוסט-יינון אלקטרוספריי. מטריצת קרח אקסוגנית שימשה כמטריצה סופגת אנרגיה כדי להקל על ספיגה תהודה של חומר הקשור לרקמות. כתב יד זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע IR-MALDESI MSI של עכבר יילוד בכל הגוף.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה היא טכניקה ניתוח כימי ישיר זה ממזער את הכנת הדוגמא ומסלקת כרומטוגרפיה, המאפשר איתור מהיר של מולקולות קטנות רקמות הצמח.

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

שיטה זו משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי להבין תהליכים מטבוליים בעלי S. alba כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. השיטה מאפשרת לוקליזציה מרחבית של תרכובות מעניינות ואת המטבוליטים החזויים שלהם בתוך רקמות ספציפיות ושלמות.

חקירת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בעלי אלבה סליקס באמצעות הדמיה ספקטרומטרית מסה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

במחקר זה מוצגת סדרה של שיטות להכנת דגימות DESI-MSI מצמחים, ומתואר בפירוט הליך של התקנת הרכבה של DESI, רכישת נתוני MSI ועיבודם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במספר תנאים לרכישת מידע מטבולי מרחבי בצמחים.

הדמיה של מטבוליטים שזוהו במטבוליזם המרחבי של הרפואה הסינית המסורתית באמצעות DESI-MSI

פרוטוקול זה נועד לתאר הנחיות מפורטות להכנת קטעי דגימת זרעים קשים עם תכולת מים נמוכה לניתוח MALDI-IMS, שמירה על הפיזור והשפע המקוריים של האנליסטים ומתן אות ורזולוציה מרחבית באיכות גבוהה.

הכנת זרעי דקל קשים לניתוח ספקטרומטריית מסה בסיוע מטריקס בלייזר/יינון-הדמיה

פותחה שיטה מתקדמת להדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) של אורגנואידים במוח המאפשרת מיפוי התפלגות מטבוליט בתוך מודלים אלה. טכנולוגיה זו מציעה תובנות לגבי מסלולים מטבוליים במוח וחתימות מטבוליטים במהלך התפתחות מוקדמת ובמחלות, ומבטיחה הבנה מעמיקה יותר של תפקוד המוח האנושי.

הדמיה מולקולרית של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ספקטרומטריית מסה 

אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך...

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

למד הדמיה ספקטרומטרית MALDI לניתוח מטבוליטים ברקמות שורשי צמחים Medicago truncatula. שיטה זו מאפשרת זיהוי מרחבי של תרכובות ביולוגיות חשובות בגושי השורש.

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים

גלה סרטונים נוספים