חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להתבונן באינטראקציה בין שני חלבונים לתאים חיים בתרבית. זה מושג על ידי שיבוט משנה של ה-CDNAs עבור שני החלבונים המעניינים לפלסמידים המכילים את רצף הציפוי עבור לוציפראז או חלבון פלואורסצנטי צהוב, בקיצור YFP ליצירת וקטורים לביטוי חלבון בתאי יונקים. כשלב שני, הפלסמידים מועברים לתאים מתורבתים, מה שמוביל לביטוי של חלבוני היתוך YFP ולוציפראז.

לאחר מכן, מצע לוציפראז מתווסף לתאים על מנת ליזום פליטת אור מהלוציפראז. מתקבלות תוצאות המראות אינטראקציה בין שני חלבוני ההיתוך המבוססים על העברת אנרגיה מ-LUCIFERASE ל-YFP. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו משקעי קון, הוא שהיא מאפשרת לצפות באינטראקציות חלבון בתאים חיים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית על ידי קביעה אם מוטציה שנמצאה בחולה משפיעה על אינטראקציות חלבון. הדגמת השלב הראשון של ההליך תהיה RAB tric, דוקטורנט מהמעבדה שלי להתחיל ליצור את הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העריכו את ריכוזם על סמך ספיגה של 260 ננומטר.

קבע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות הבסיסים ב-650.דלטון. השתמש בריכוז ובמסה המולקולרית כדי לחשב את הריכוז המולרי של כל תכשיר פלסמיד. לדלל את תכשירי ה-DNA של הפלסמיד לריכוז של 36 ננו טוחנת.

אלה יהיו מלאי העבודה שישמש להכנת תערובות ה-DNA. לטרנספקציה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הגדרת תערובות ה-DNA כדי להבטיח הצלחה, אנו יוצרים גיליונות אלקטרוניים כדי לחשב מראש את הכמות הנכונה של כל רכיב, ואנו מקפידים מאוד.

בהגדרת תערובות ה- DN. הכן את תערובת ה-DNA הבקרה הראשונה המכילה 1800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של 20 מיקרוליטר מים. לאחר מכן הגדר תערובת DNA מבוקרת שנייה על ידי הכנת חמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת המראה P.

הוסף פלסמיד מילוי כדי להביא את מסת ה-DNA הכוללת ל-1800 ננוגרם. הוסף מים כדי להביא את הנפח הסופי ל -20 מיקרוליטר. הכן תערובת DNA בקרה שלישית המכילה חמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת מראה P, וחמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת PYFP.

הוסף פלסמיד מילוי ומים כמו קודם. לבסוף, הגדר תערובת DNA בקרה רביעית המכילה חמישה מיקרוליטרים של מבנה הבקרה החיובי. שוב, הוסף מילוי, פלסמיד ומים באותו אופן.

לאחר מכן, הכינו תערובות NA תלת-ממדיות כדי לבדוק הומודימריזציה של חלבון מעניין x. עבור כל תערובת DNA, שלב חמישה מיקרוליטרים של מבנה מראה P הרלוונטי וחמישה מיקרוליטר של מבנה PYFP, הוסף פלסמיד מילוי ומים. לאחר מכן הכינו תערובות DNA כדי לבדוק אינטראקציה בין זוג חלבונים מעניינים X ו-Y.עבור כל תערובת DNA, שלבו חמישה מיקרוליטרים של מבנה המראה P הרלוונטי וחמישה מיקרוליטרים של מבנה ה-PYFP יחד עם פלסמיד מילוי וקצירת מים תת-תאים hec 2 9 3 מבקבוק של 75 סנטימטר מרובע מדללים 10% מכלל התאים ל-13 מיליליטר של מדיום תרבית.

לאחר מכן הוציא 130 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה לבנה שקופה עם תחתית של 96 בארות לפני תרבית התאים למשך 24 שעות. לאחר מכן, חשב את מספר הבארות שיש לעבור על ידי הכפלת מספר תערובות ה-DNA בשלוש. הכן תערובת מאסטר המכילה 6.3 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, מדיום נטול סרום ו-0.18 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה לכל באר מעורבבת על ידי מערבולת לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן חילק 20 מיקרוליטר של תערובת ראשיגנטית בינונית ללא סרום למספר הצינורות הנדרש. הוסף שני מיקרוליטר מתערובת ה- DNA המתאימה לכל צינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לבסוף, יש להעביר שלוש בארות עם כל תערובת טרנספקציה.

הוצאת 6.5 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה לבאר לפני תרבית התאים למשך 36 עד 48 שעות נוספות. כדי למדוד את אות ה-BRET. ראשית ממיסים מצע לוציפראז תאים חיים ב-34 מיליגרם למיליליטר ב-DMSO על ידי מערבולת.

מדלל סובסטרט לוציפראז של תאים חיים משוחזרים באחד עד 1000 במצע דילול בינוני טרום חם 37 מעלות צלזיוס. אפשר לערבב 50 מיקרוליטר של מדיום דילול מצע לכל מערבולת באר. משקע עשוי להיווצר, אך לא יפריע לבדיקה.

שאפו את מדיום התרבית מצלחת 96 הבאר והוציאו 50 מיקרוליטר של מצע לוציפראז תאים חיים מדולל לכל באר לאחר תרבית התאים למשך שעתיים לפחות. הסר את המכסה מצלחת 96 הבאר ודגר את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך הלומינומטר. מדוד פליטה מ-LUCIFERASE ו-YFP באר אחת בכל פעם על פי הפרטים בפרוטוקול הטקסט, שלב אותות פליטה במשך 10 שניות.

חברים במשפחת Fox P של מדכאי שעתוק ממלאים תפקיד בהתפתחות המוח. מוטציות מעורבות בהפרעות דיבור וספקטרום האוטיזם. ידוע כי FOX P 2 יוצר הומודימרים כדי לאמת את בדיקת ברט לגילוי פוקס.

P שני תאי הומודיים הועברו עם מבנים לביטוי של לוציפראז כתורם או YFP כמקבל התמזג ל-Fox P 2 או לאות לוקליזציה גרעינית. חלבוני LUCIFERASE ו-YFP הממוקדים בגרעין משמשים כבקרות שליליות כבקרה חיובית לזיהוי ברט. תאי אות הועברו גם עם מבנה לביטוי של חלבון היתוך YFP לוציפראז.

העלייה באות ה-BRET מראה כי בדיקת ברט יעילה בזיהוי תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של Fox P שני הומודימרים של תאים שהועברו עם YFP התמזגו לאות לוקליזציה גרעינית, או עם YFP התמזגו ל-FOX P שתיים מוצגות כאן. הספציפיות של האינטראקציה הודגמה על ידי הכנסת מוטציה ל-FOX P 2, הידועה כמשבשת דימריזציה. כאשר לוציפראז, פוקס P, שני דלתא E 400 ו-YFP פוקס B, שני חלבוני היתוך באו לידי ביטוי במשותף.

נצפתה ירידה באות הנשימה בהשוואה למצב שבו Fox B 2 ו-YFP Fox B 2 באו לידי ביטוי במשותף. הפחתת אות זו לא נבעה משינוי בלוקליזציה התת-תאית של החלבון המוטנטי כדי להעריך את היעילות של בדיקת ברט בזיהוי אינטראקציות טיפוסיות, נבדקה האינטראקציה של Fox P two עם Fox P one, אות ברט נצפה בשתי התצורות האפשריות של הבדיקה. בנוסף, נבדקה ההתאמה של בדיקת ברט או זיהוי אינטראקציה של Fox P two עם חלבונים שאינם FOX P על ידי בחינת האינטראקציה עם CT BP one, מדכא משותף שעתוק ושותף אינטראקציה ידוע של Fox P two.

האינטראקציה של Fox P two CT BP one זוהתה על ידי בדיקת ברט כאשר Fox P 2 היה חלבון ההיתוך של התורם ו-CT P אחד היה המקבל, אך לא בתצורה הפוכה. האינטראקציה בין FOX P 2 ל-CT P 1 נצפתה למרות שרק חלק קטן מ-CT BP 1 היה ממוקם בגרעין, מה שמדגיש את הרגישות של בדיקה זו. לבסוף, נעשה שימוש במבחן ברט כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות פתוגניות ב-Fox P 2 על אינטראקציות חלבון חלבון.

שתי מוטציות נקודתיות ב-Fox P 2 דווחו כגורמות להפרעה אוטוזומלית דומיננטית נדירה המשפיעה על הדיבור והשפה. יכולתם של החלבונים המוטנטיים להתעמעם עם שועל בר מסוג P 2 הוערכה באמצעות בדיקת BRET. המוטציה R 3 28 X, אך לא המוטציה R 5 53 H, משבשת את הדימריזציה של התוצאות באמצעות סוג פרא Fox B 2 כתורם ומוטציה Fox B 2.

כפי שמוצג המקבל, אותן תוצאות נצפו עבור התצורה ההפוכה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את בדיקת הלחם כדי לפקח על אינטראקציות חלבון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים חיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות נוספות כדי לבחון את פעילות החלבון המעניין שלך על מנת להעריך את ההשלכות התפקודיות של אינטראקציה חלבונית נצפית.