Name: חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: למד לחקור אינטראקציות חלבונים בתאים חיים באמצעות BRET. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר אינטראקציות חלבון-חלבון והערכת השפעת מוטציות פתוגניות על תפקודן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק.

1. יצירת פלסמידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone cDNAs עבור כל חלבון של עניין לשני וקטורי pLuc וpYFP, ​​תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (איור 1). לפרוטוקולים מפורטים רואה הירוק ואח&#39; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף כל הבונה כדי לוודא שהחלבונים של עניין נמצאים במסגרת עם רצף לוק / YFP ללא קודונים להפסיק להתערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מבחני פונקציונליים כמו רצוי כדי לאשר שחלבוני ההיתוך לשמור על פעילות ביולוגית. במקרה שהוצג כאן לוקליזציה subcellular של חלבוני היתוך YFP הובררה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פלסמידים ביטוי לחלבוני בקרה מתאימים לוק וYFP על ידי הנדסת אותות מיקוד הרלוונטיים לוקטורי ביטוי pLuc וpYFP. במקרה שהוצג כאן, ליצור מבני לוק וYFP ממוקדים גרעיניים על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית לוקטורי pLuc וpYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשותמבנה שליטה חיובי שבו לוק וYFP הם התמזגו לתוך פוליפפטיד אחד. במקרה שהוצג כאן, לייצר שליטה חיובית שבו רצף קידוד YFP מוכנס לתוך וקטור pLuc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלסמיד מילוי ניטראלי לשמש כדי להשוות את המסה של ה-DNA בתערובות transfection. השתמש פלסמיד שאין לו אמרגן אוקריוטים ועל כן יהיה תעתיק לא פעיל בתאי יונקים, כגון וקטור שיבוט חיידקים. </li></ol> 2. הכנה של ה-DNA תערובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז של כל פלסמידים שתוארו בסעיף 1 המבוסס על הספיגה ב 260 ננומטר (יחידת ספיגת 1 היא שווה ערך ל50 מיקרוגרם / מיליליטר של ה-DNA). לקבוע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות בסיסים ידי 650 דא. השתמש בריכוז ומסה מולקולרית כדי לחשב את הריכוז טוחנת של כל הכנת פלסמיד. לדלל את הכנות פלסמיד דנ&quot;א לריכוז של 36 ננומטר. אלה יהיו המניות עובדותשישמש להכנת תערובות DNA עבור transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת המכילה DNA שליטת 1,800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של μl 20 של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc השליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc שליטה ו5 μl של מבנה pYFP שליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה שליטה חיובי. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת homodimerization של חלבון של העניין, X. לכל ערבוב של ה-DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pyFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. א) pLuc שליטה וpYFP-X B) pLuc-X וpYFP בקרה ג) pLuc-X ו-X pYFP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת אינטראקציה בין זוג החלבונים של עניין, X וי &#39;לכל תערובת DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pYFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. א) pLuc שליטה וpYFP-X B) pLuc-X וpYFP בקרה ג) pLuc שליטה וpYFP-Y D) pLuc-Y וpYFP בקרה E) pLuc-X ו-Y pYFP F) pLuc-Y ו-X pYFP </li></ol> 3. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר subconfluent HEK293 תאים מבקבוק 75 2 סנטימטר. לדלל 10% מהתאים בסך הכל ל13 מיליליטר של מדיום התרבות. לוותר 130 μl של השעיה תא לתוך באר כל לבןברור תחתית צלחת תרבית רקמת 96 היטב. תרבות תאים ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הבארות להיות transfected על ידי הכפלת מספר תערובות-DNA על ידי 3. תביא מדיום סרום ללא תרבות לטמפרטורת חדר. הכן תערובת אב המכילה 6.3 μl של מדיום סרום ללא ו0.18 מגיב transfection μl לכל טוב. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת transfection על ידי הוספת 2 μl תמהיל ה-DNA כדי 20 μl של תמהיל אב סרום ללא בינוני / transfection מגיב. לא מערבולת. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect שלוש בארות עם כל תערובת transfection מחלק 6.5 μl של תערובת transfection לכל טוב. תרבות התאים לשעה 36-48 נוספת. </li></ol> 4. מדידה של ברט איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר מצע לוציפראז לחיות תאים ב34 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מצע לוציפראז לחיות תאים מחדש ב1:1,000 בעמ הבינוני דילול המצעמחדש לחמם 37 ° C. לאפשר 50 μl של מדיום דילול מצע לכל טוב. מערבולת לערבב. משקע עלול להיווצר, אבל לא יפריע לassay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות מצלחת 96 היטב. לוותר 50 μl של מצע לוציפראז לחיות תאים מדולל היטב כל אחד. תרבות תאים לפחות 2 שעה (עד 24hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 96 היטב דגירה את הצלחת ל10 דקות בטמפרטורת חדר בתוך luminometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד פליטה מלוק וYFP אחד טובה בכל פעם. למדוד פליטה מלוק באמצעות מסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר. למדוד פליטה מYFP באמצעות מסנן להקה עובר 500-600 ננומטר. שלב את אותות פליטה מעל 10 שניות. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע קריאות פליטת לוק מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת לוק האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע לוק.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע קריאות פליטת YFP מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת YFP האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל טוב, יש לחלק את ערך הפליטה מופחת רקע YFP ידי ערך הפליטה מופחת רקע לוק לתת יחס ברט שלא תוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע יחסי ברט שלא תוקנו משלוש הבארות שהיו transfected עם רק פלסמיד pLuc השליטה. לחסר ערך זה מכל יחסי ברט לא מתוקנים האחרים כדי לתת את יחס ברט המתוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחת מהקבוצות שנותרו ביחסי ברט מתוקנים, ממוצע הערכים משלוש בארות transfected לקבל יחס ברט סופי. </li></ol>

<ol><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li>
<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BRET%29.+Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li>
<li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BRET+versus+FRET.+Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li>
<li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28eBRET%29+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li>
<li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+%CE%B2-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li>
<li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li>
<li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li>
<li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204(2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li>
<li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+genetics+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li>
<li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li>
<li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability%2C+autism%2C+and+language+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li>
<li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li>
<li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1%2F2%2F4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li>
<li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li>
<li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

העיצוב של מבני ביטוי חלבון ההיתוך הוא שלב קריטי בהקמת assay ברט. בניסויים שהוצגו כאן, החלבונים של העניין היו התמזגו C-הסופית של בלוציפראז או YFP. זה גם אפשרי, וייתכן שיהיה צורך, הפתיל חלבונים N-הסופית של בלוציפראז / YFP. עבור חלק מחלבונים, התכה עשויה להתקבל רק בבית או N-או C-הסופית על מנת למנוע שיבוש של מבנה חלבון ותפקודו. יתר על כן, לחלבונים הטרנסממברני בי N וTermini C מתגוררים בתאי subcellular שונים, לוציפראז / חלבון YFP יש התמזגו לתחנה הסופית שבו נמצאת באותו התא ששותף האינטראקצ...

גם הצמדה קלאסית והדור הבא רצף ניתוחים של הפרעות אדם מגלים את הרלוונטיות הקלינית של חלבונים מעורבים במגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. זה קורה לעתים קרובות כי, לפני זיהוי שלהם במחקרים מסוג זה, יש כבר חקירה מועטת או ללא התפקיד הביולוגי של החלבונים האלה. השדרה פורה אחד להתחיל לחקור את התפקוד הביולוגי של חלבון של עניין היא לזהות אילו חלבונים אחרים הוא מקיים אינטראקציה עם בהקשר הפיזיולוגי שלו. אפיון רשתות מולקולריות באופן זה מספק תובנות לגבי המסלולים הביולוגיים העומדים בבסיס הפנוטיפ האנושי. ההקרנה בקנה מידה גדולה ביותר בשימוש לעתים קרובות גישות לזיהוי שותפי אינטראקציה מועמד לחלבונים של עניין הן שמרי הקרנת שתי היברידית 1 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסת 2. שיטות אלו יכולות להיות מוצלחות מאוד שבמרמזות חלבוני אינטראקציה פוטנציאל, אבל arדואר חשוף לתוצאות חיוביות כוזבות. לפיכך, אישור של אינטראקציה זוהתה על ידי שמרי שני היברידיים או הקרנת ספקטרומטריית מסה דורש אימות של האינטראקציה באמצעות טכניקה שנייה. בדרך כלל שיתוף immunoprecipitation או assay הנפתח משמש למטרה זו 3. אחד חסרונות של שימוש בטכניקות כגון לאימות הוא הדרישה לתמוגה תא, שהורסת את התנאים תאיים שעשויה להיות חיוני לשמירה על אינטראקציות חלבון מסוימות. חסרון שני הוא שאינטראקציות חלבון חלשות או חולפות עשויות להיות מופרים במהלך שלבי כביסה. יתר על כן, מבחני אלה דורשים ידיים על זמן משמעותיים, מוגבלים במספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, ולעתים קרובות דורשים אופטימיזציה זמן רב של חומרים כימיים ופרוטוקולים. כדי להתגבר על חלק מהבעיות הקשורות לשיתוף immunoprecipitation ניסויים, כמה מבחני שפותחו על בסיס ניאון וbiolumחלבוני inescent שניתן להשתמש בתאים חיים. מבחני הראשונים מסוג זה היו מבוססים על הקרינה (או פורסטר) העברת התהודה אנרגיה (סריג), ההעברה לא מקרינה אנרגיה בין שני חלבוני ניאון עם פליטה חופפות וספקטרום עירור 4. היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, ולכן התבוננות בתופעת סריג דורשת כי fluorophores תורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם fluorophore התורם (החלבון פלואורסצנטי נפוץ ציאן; CFP), והשני כהתמזגות עם fluorophore acceptor (החלבון פלואורסצנטי נפוץ צהוב; YFP). אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא fluorophores תורם acceptor מספיק הקרוב ללהתרחש העברת אנרגיה, מה שיגרום לעלייה במדידת הפליטה של ​​אור מביחס acceptor YFP לתורם CFP. FRET היה מוצלח באיתור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים 4. החסרון העיקרי של שימוש בסריג לאיתור חלבונים אינטראקציות הוא הדרישה לתאורה חיצונית לעירור של fluorophore התורם. תוצאות תאורה חיצוניות ברקע גבוה באות הפליטה, עירור לא רצוי של acceptor, וphotobleaching של שניהם תורמים וfluorophores acceptor. השפעות אלה מפחיתים את הרגישות של assay לאיתור חלבונים אינטראקציות. שינוי של assay סריג שמתגבר על הבעיה של רקע גבוה מתאורה חיצונית הוא העברת פליטת אור התהודה האנרגיה 5,6 assay (ברט). במערכת ברט fluorophore התורם הוא הוחלף על ידי אנזים בלוציפראז. לכן האנרגיה לעירור של fluorophore acceptor נוצרה בתוך המערכת על ידי החמצון של מצע לוציפראז, עיבוד תאורה חיצונית מיותרת. ברובתצורה נפוצה של assay זה, התורם הוא Renilla reniformis לוציפראז וacceptor הוא YFP (לדיון של תורם חלופי וחלבונים acceptor לראות Pfleger et al. 5). בהתאם לכך, במערכת זו, חלבון של עניין הוא קבע את לוציפראז וחלבון באופן פוטנציאלי, באינטראקציה לYFP, או להיפך. Assay ברט דורש תוספת של coelenterazine כמצע ללוציפראז. בגלל coelenterazine הוא תא חדיר, ניתן לבצע מבחני ברט בתאים חיים. עם זאת, coelenterazine ילידים אינם יציב בתמיסה מימית, ואת פירוט האנזים עצמאי של coelenterazine הן מפחית את ריכוז המצע זמין עבור assay ומייצר autoluminescence, אשר מפחיתה את הרגישות של מדידות של פעילות לוציפראז. השימוש בברט בתאים חיים כבר בהנחייתם של פיתוח coelenterazines המוגן, שהם יציבים בתמיסה מימית אבל הם ביקע ידי esterase cytosolicים לאחר דיפוזיה על פני קרום התא כדי לייצר coelenterazine הפעיל בתוך התא 7. בעקבות תוספת של מצע לתאים לבטא לוציפראז וחלבוני YFP-Fusion, העברת אנרגיה וכתוצאה מאינטראקציות בין חלבונים היא לכמת על ידי ניטור פליטה מלוציפראז וYFP. מכיוון שניתן לנטר אינטראקציות חלבון ישירות בתאים חיים בצלחות רב גם, assay ברט מהווה שיטה פשוטה, ניתן להרחבה לאימות אינטראקציות המשוערות שהיא עלות והזמן יעיל. בנוסף לאימות interactors המשוער שזוהה במחקרי הקרנת proteomic, מערכת ברט יכולה לשמש גם לinteractors מועמד מבחן הנובע ממחקרים ביוכימיים ומבניים מוקדמים בחלבון של עניין. ברגע שהקיום של אינטראקציה בין חלבונים כבר נקבע (בין אם באמצעות assay ברט או בטכניקות אחרות), קיימת פוטנציאל לassay ברט להיות EMPloyed נוסף כדי לאפיין את האינטראקציה. לדוגמא, ניתן למפות אזורי האינטראקציה על ידי יצירת גרסאות מקוצצות של החלבונים, ואת מעורבותם של שאריות ספציפיות באינטראקציה ניתן להדגים על ידי יצירת מוטציות נקודתיות. יתר על כן, השפעת הוויסות של שינויי posttranslational או מולקולות קטנות (כגון סמים או ligands) על אינטראקציות בין חלבונים יכולה להיחקר 8-10. Assay ברט יש גם פוטנציאל גדול לחקר מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל. במקרים בהם תפקיד סיבתי מוטציה כבר נקבע, שחקר את ההשפעה של המוטציה על אינטראקציות בין חלבונים באמצעות ברט עשוי לחשוף עוד על אטיולוגיה המולקולרית של פנוטיפ 11. מאז כניסתו של מתודולוגיות הדור הבא של רצף, זה נפוץ יותר ויותר במשך כמה מוטציות שעלולים להיות מזיקות להיות מזוהות בתוך פרט, ובמקרה זה ברור שהם releVant לפנוטיפ 12. במצב זה assay ברט עשוי להיות בעל ערך בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד חלבון ומכאן את הרלוונטיות שלהם להפרעה.

<table><tbody><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Nanodrop</td><td></td><td>כל ספקטרופוטומטר המסוגל לקרוא ספיגות ב-260 ננומטר יתאים. קביעת המסה המולקולרית של הפלסמיד היא חיונית לחישוב כמויות ה-DNA שישמשו בתערובות טרנספקציה.</td></tr><tr><td>לוחות 96 מיקרובארות, תחתית שטוחה, לבן</td><td>Greiner Bio One</td><td>655098</td><td>לוחות לבנים מפחיתים את הדיבור בין בארות וממקסמים את הרגישות לזיהוי זוהר. בארות עם תחתית שקופה מאפשרות ניטור של צפיפות התאים. צלחות חייבות להיות מתאימות לתרבית תאים. אם משתמשים בלומינומטר קריאה עליונה, יש להסיר את מכסה הצלחת.</td></tr><tr><td>קורא צלחות אינסופי F200Pro עם תוכנת בקרה</td><td>TECAN</td><td></td><td>השתמש במסננים 'כחול 1' ו'ירוק 1' למדידת זוהר ובערכות המסננים והמראה הדיכואית עבור GFP למדידת פלואורסצנטיות. כל קורא לוחות קריאה עליונה עם יכולת למדוד זוהר ופלואורסצנטי בשני צבעים מתאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>pLuc, pYFP, פלסמיד בקרה חיובית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>פלסמידים זמינים מהמחברים על פי בקשה.</td></tr><tr><td>pGEM-3Zf(+)</td><td>Promega</td><td>P2271</td><td>פלסמיד מילוי לשיווי מסת DNA בתערובות טרנספקציה. כל פלסמיד חסר מקדם אוקריוטי יתאים.</td></tr><tr><td>תאי HEK293</td><td>ECACC</td><td>85120602</td><td>קווי תאים אחרים העוברים ביעילות סבירה עשויים להתאים.</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, עם פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>זהו המדיום המשמש לתרבית תאי HEK293. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש. אם אתה משתמש בקו תאים אחר, החלף את מצע הגידול המתואר כאן במדיום ספציפי לקו התא.</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, ללא פנול אדום (מדיום דילול סובסטרט)</td><td>Gibco</td><td>21063</td><td>זהו מדיום דילול הסובסטרט המשמש לדילול של מצע הלוציפראז (EnduRen) מכיוון שהוא אינו מכיל פנול אדום, מה שמפחית את רגישות הבדיקה. מכיל HEPES לשמירה על pH נכון במהלך מדידות זוהר בזמן שהתאים נמצאים מחוץ לחממת CO2. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985</td><td>OptiMEM משמש לדילול של מגיב טרנספקציה של GeneJuice. מדיה אחרת ללא סרום תתאים גם היא. יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>להשלמת מצע תרבית תאים בריכוז של 10% v/v.</td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה של GeneJuice</td><td>Novagen</td><td>70967</td><td>אם משתמשים בקו תאים שאינו HEK293, ייתכן שיהיה צורך להתאים את היחס בין מגיב טרנספקציה של Genejuice ל-DNA בתערובות הטרנספקציה. ניתן להשתמש בריאגנטים אחרים של טרנספקציה. אם משתמשים במגיב טרנספקציה חלופי, ייתכן שיהיה צורך לייעל את כמות ה-DNA המשמשת בתערובות הטרנספקציה על סמך הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>השתמש ב-DMSO סטרילי המתאים לתרבית רקמות.</td></tr><tr><td>מצע תאים חיים EnduRen</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Reconstruct EnduRen ב-34 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. עם דילול EnduRen במדיום תרבית עלול להיווצר משקעים. זה לא יפריע לבדיקה. אחסן EnduRen משוחזר ב-20 מעלות; C, והימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים. ודא ש-EnduRen המחודש מופשר לחלוטין לפני דילול במדיום תרבית.</td></tr></tbody></table>

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

מבחני מבוססים על פליטת אור התהודה העברת אנרגיה (ברט) לספק אמצעי רגיש ואמין כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. ברט הוא ההעברה לא מקרינה אנרגיה מאנזים לוציפראז &#39;תורם&#39; לחלבון פלואורסצנטי &#39;acceptor&#39;. בתצורה הנפוצה ביותר של assay זה, התורם הוא לוציפראז reniformis Renilla וacceptor הוא חלבון צהוב פלורסנט (YFP). בגלל היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, התבוננות בתופעת ברט דורשת שהתורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין בתאי יונקים בתרבית, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם לוציפראז והשני כהתמזגות עם YFP. אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא תורם acceptor מספיק קרוב ללהתרחש העברת אנרגיה. לעומת טכניקות אחרות לחקירת חלבונים בteractions, assay ברט הוא רגיש, דורש ידיים על קצת זמן וכמה חומרים כימיים, והוא מסוגל לזהות אינטראקציות שהם חלשים, ארעיים, או תלויים בסביבה ביוכימית נמצאת בתוך תא חי. לכן גישה אידיאלית למאשרים אינטראקציות המשוערות שהוצעו על ידי שמרי שני היברידיים או ספקטרומטריית מסת מחקרי פרוטאומיקה, ובנוסף הוא מותאם היטב לאזורי מיפוי אינטראקציה, בוחן את ההשפעה של שינויים שלאחר translational על אינטראקציות בין חלבונים, ו בוחן את ההשפעה של מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל.

העיקרון של assay ברט המתואר באיור 2. התקנת assay בשימוש בכל הניסויים שהוצגו כאן מתוארת באיור 3. זיהוי של אות ברט חזקה מתאי transfected עם חלבון היתוך לוציפראז-YFP אישר כי העברת אנרגיה הייתה ניתן לצפייה בהתקנה ניסיונית זה (איור 4). המחקר שלנו מתמקד בתפקידה של משפחת FOXP של repressors תעתיק בהתפתחות המוח. מוטציות הטרוזיגוטיים משפיעות להוביל FOXP2 לצורה נדי...

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות באינטראקציה בין שני חלבונים לבין תאים חיים בתרבית. מטרה זו מושגת על ידי סב-שחזור (sub cloning) של ה-CDNAs עבור שני החלבונים המדוברים לתוך פלסמידים המכילים את רצף הקידוד עבור לוסיפראז או חלבון פלואורסצנטי צהוב, המכונה YFP, כדי ליצור וקטורים לביטוי של חלבון בתאי יונקים. כשלב שני, הפלסמידים מוחדרים (transfected) לתאי תרבית, דבר המוביל לביטוי של חלבוני היתוך של YFP ולוסיפראז.בשלב הבא, מוסיפים לתאים את תסביך הלוסיפראז על מנת להתניע את פליטת האור מהלוסיפראז. התוצאות המתקבלות מעידות על אינטראקציה בין שני חלבוני היתוך, על בסיס העברת אנרגיה מ-LUCIFERASE ל-YFP. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיקוע משותף (co-precipitation), הוא שהיא מאפשרת לצפות באינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה התפקודית, על ידי קביעה האם מוטציה שנמצאה במטופל משפיעה על אינטראקציות בין חלבונים. את השלב הראשון של הפרוצדורה תדגים RAB tric, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו את הפלסמידים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. העריכו את ריכוזם על סמך בליעה ב-260 nanometers.קבעו את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות הבסיסים ב-650 Daltons. השתמשו בריכוז ובמסה המולקולרית כדי לחשב את הריכוז המולר

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה...

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

מאמר זה מתאר את הממשל...

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

הסרטון מתאר את טכניקת ההדמיה FLIM-FRET כדי לקבוע את האינטראקציה חלבון-חלבון בחיידקים חיים המבטאים חלבונים ציטופלזמיים המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים, eGFP תורם ומקבל mCherry. הטכניקה המשולבת מאפשרת גם לכמת את החלבונים המקיימים אינטראקציה.

הדמיית FLIM-FRET לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים

הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.

שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)

אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור חלבון.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הדינמיקה המרחבית-זמנית של הפעלת Akt וזרחון בתאי HepG2 חיים. הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה המספק תובנות חשובות לגבי מסלולי איתות אינסולין וויסות מטבולי בתאי סרטן.

הדמיית העברת אנרגיית תהודה של תאים חיים של דינמיקת הפעלת Akt מווסתת מטבולית בתאי HepG2

למד לחקור אינטראקציות חלבונים בתאים חיים באמצעות BRET. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר אינטראקציות חלבון-חלבון והערכת השפעת מוטציות פתוגניות על תפקודן.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

גלה סרטונים נוספים