חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה
26 במאי 2014
אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להתבונן באינטראקציה בין שני חלבונים לתאים חיים בתרבית. זה מושג על ידי שיבוט משנה של ה-CDNAs עבור שני החלבונים המעניינים לפלסמידים המכילים את רצף הציפוי עבור לוציפראז או חלבון פלואורסצנטי צהוב, בקיצור YFP ליצירת וקטורים לביטוי חלבון בתאי יונקים. כשלב שני, הפלסמידים מועברים לתאים מתורבתים, מה שמוביל לביטוי של חלבוני היתוך YFP ולוציפראז.
לאחר מכן, מצע לוציפראז מתווסף לתאים על מנת ליזום פליטת אור מהלוציפראז. מתקבלות תוצאות המראות אינטראקציה בין שני חלבוני ההיתוך המבוססים על העברת אנרגיה מ-LUCIFERASE ל-YFP. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו משקעי קון, הוא שהיא מאפשרת לצפות באינטראקציות חלבון בתאים חיים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית על ידי קביעה אם מוטציה שנמצאה בחולה משפיעה על אינטראקציות חלבון. הדגמת השלב הראשון של ההליך תהיה RAB tric, דוקטורנט מהמעבדה שלי להתחיל ליצור את הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העריכו את ריכוזם על סמך ספיגה של 260 ננומטר.
קבע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות הבסיסים ב-650.דלטון. השתמש בריכוז ובמסה המולקולרית כדי לחשב את הריכוז המולרי של כל תכשיר פלסמיד. לדלל את תכשירי ה-DNA של הפלסמיד לריכוז של 36 ננו טוחנת.
אלה יהיו מלאי העבודה שישמש להכנת תערובות ה-DNA. לטרנספקציה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הגדרת תערובות ה-DNA כדי להבטיח הצלחה, אנו יוצרים גיליונות אלקטרוניים כדי לחשב מראש את הכמות הנכונה של כל רכיב, ואנו מקפידים מאוד.
בהגדרת תערובות ה- DN. הכן את תערובת ה-DNA הבקרה הראשונה המכילה 1800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של 20 מיקרוליטר מים. לאחר מכן הגדר תערובת DNA מבוקרת שנייה על ידי הכנת חמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת המראה P.
הוסף פלסמיד מילוי כדי להביא את מסת ה-DNA הכוללת ל-1800 ננוגרם. הוסף מים כדי להביא את הנפח הסופי ל -20 מיקרוליטר. הכן תערובת DNA בקרה שלישית המכילה חמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת מראה P, וחמישה מיקרוליטרים של מבנה בקרת PYFP.
הוסף פלסמיד מילוי ומים כמו קודם. לבסוף, הגדר תערובת DNA בקרה רביעית המכילה חמישה מיקרוליטרים של מבנה הבקרה החיובי. שוב, הוסף מילוי, פלסמיד ומים באותו אופן.
לאחר מכן, הכינו תערובות NA תלת-ממדיות כדי לבדוק הומודימריזציה של חלבון מעניין x. עבור כל תערובת DNA, שלב חמישה מיקרוליטרים של מבנה מראה P הרלוונטי וחמישה מיקרוליטר של מבנה PYFP, הוסף פלסמיד מילוי ומים. לאחר מכן הכינו תערובות DNA כדי לבדוק אינטראקציה בין זוג חלבונים מעניינים X ו-Y.עבור כל תערובת DNA, שלבו חמישה מיקרוליטרים של מבנה המראה P הרלוונטי וחמישה מיקרוליטרים של מבנה ה-PYFP יחד עם פלסמיד מילוי וקצירת מים תת-תאים hec 2 9 3 מבקבוק של 75 סנטימטר מרובע מדללים 10% מכלל התאים ל-13 מיליליטר של מדיום תרבית.
לאחר מכן הוציא 130 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה לבנה שקופה עם תחתית של 96 בארות לפני תרבית התאים למשך 24 שעות. לאחר מכן, חשב את מספר הבארות שיש לעבור על ידי הכפלת מספר תערובות ה-DNA בשלוש. הכן תערובת מאסטר המכילה 6.3 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, מדיום נטול סרום ו-0.18 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה לכל באר מעורבבת על ידי מערבולת לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לאחר מכן חילק 20 מיקרוליטר של תערובת ראשיגנטית בינונית ללא סרום למספר הצינורות הנדרש. הוסף שני מיקרוליטר מתערובת ה- DNA המתאימה לכל צינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לבסוף, יש להעביר שלוש בארות עם כל תערובת טרנספקציה.
הוצאת 6.5 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה לבאר לפני תרבית התאים למשך 36 עד 48 שעות נוספות. כדי למדוד את אות ה-BRET. ראשית ממיסים מצע לוציפראז תאים חיים ב-34 מיליגרם למיליליטר ב-DMSO על ידי מערבולת.
מדלל סובסטרט לוציפראז של תאים חיים משוחזרים באחד עד 1000 במצע דילול בינוני טרום חם 37 מעלות צלזיוס. אפשר לערבב 50 מיקרוליטר של מדיום דילול מצע לכל מערבולת באר. משקע עשוי להיווצר, אך לא יפריע לבדיקה.
שאפו את מדיום התרבית מצלחת 96 הבאר והוציאו 50 מיקרוליטר של מצע לוציפראז תאים חיים מדולל לכל באר לאחר תרבית התאים למשך שעתיים לפחות. הסר את המכסה מצלחת 96 הבאר ודגר את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך הלומינומטר. מדוד פליטה מ-LUCIFERASE ו-YFP באר אחת בכל פעם על פי הפרטים בפרוטוקול הטקסט, שלב אותות פליטה במשך 10 שניות.
חברים במשפחת Fox P של מדכאי שעתוק ממלאים תפקיד בהתפתחות המוח. מוטציות מעורבות בהפרעות דיבור וספקטרום האוטיזם. ידוע כי FOX P 2 יוצר הומודימרים כדי לאמת את בדיקת ברט לגילוי פוקס.
P שני תאי הומודיים הועברו עם מבנים לביטוי של לוציפראז כתורם או YFP כמקבל התמזג ל-Fox P 2 או לאות לוקליזציה גרעינית. חלבוני LUCIFERASE ו-YFP הממוקדים בגרעין משמשים כבקרות שליליות כבקרה חיובית לזיהוי ברט. תאי אות הועברו גם עם מבנה לביטוי של חלבון היתוך YFP לוציפראז.
העלייה באות ה-BRET מראה כי בדיקת ברט יעילה בזיהוי תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של Fox P שני הומודימרים של תאים שהועברו עם YFP התמזגו לאות לוקליזציה גרעינית, או עם YFP התמזגו ל-FOX P שתיים מוצגות כאן. הספציפיות של האינטראקציה הודגמה על ידי הכנסת מוטציה ל-FOX P 2, הידועה כמשבשת דימריזציה. כאשר לוציפראז, פוקס P, שני דלתא E 400 ו-YFP פוקס B, שני חלבוני היתוך באו לידי ביטוי במשותף.
נצפתה ירידה באות הנשימה בהשוואה למצב שבו Fox B 2 ו-YFP Fox B 2 באו לידי ביטוי במשותף. הפחתת אות זו לא נבעה משינוי בלוקליזציה התת-תאית של החלבון המוטנטי כדי להעריך את היעילות של בדיקת ברט בזיהוי אינטראקציות טיפוסיות, נבדקה האינטראקציה של Fox P two עם Fox P one, אות ברט נצפה בשתי התצורות האפשריות של הבדיקה. בנוסף, נבדקה ההתאמה של בדיקת ברט או זיהוי אינטראקציה של Fox P two עם חלבונים שאינם FOX P על ידי בחינת האינטראקציה עם CT BP one, מדכא משותף שעתוק ושותף אינטראקציה ידוע של Fox P two.
האינטראקציה של Fox P two CT BP one זוהתה על ידי בדיקת ברט כאשר Fox P 2 היה חלבון ההיתוך של התורם ו-CT P אחד היה המקבל, אך לא בתצורה הפוכה. האינטראקציה בין FOX P 2 ל-CT P 1 נצפתה למרות שרק חלק קטן מ-CT BP 1 היה ממוקם בגרעין, מה שמדגיש את הרגישות של בדיקה זו. לבסוף, נעשה שימוש במבחן ברט כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות פתוגניות ב-Fox P 2 על אינטראקציות חלבון חלבון.
שתי מוטציות נקודתיות ב-Fox P 2 דווחו כגורמות להפרעה אוטוזומלית דומיננטית נדירה המשפיעה על הדיבור והשפה. יכולתם של החלבונים המוטנטיים להתעמעם עם שועל בר מסוג P 2 הוערכה באמצעות בדיקת BRET. המוטציה R 3 28 X, אך לא המוטציה R 5 53 H, משבשת את הדימריזציה של התוצאות באמצעות סוג פרא Fox B 2 כתורם ומוטציה Fox B 2.
כפי שמוצג המקבל, אותן תוצאות נצפו עבור התצורה ההפוכה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את בדיקת הלחם כדי לפקח על אינטראקציות חלבון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים חיים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות נוספות כדי לבחון את פעילות החלבון המעניין שלך על מנת להעריך את ההשלכות התפקודיות של אינטראקציה חלבונית נצפית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בתצפית על האינטראקציה בין שני חלבונים בתאים תרביתיים חיים באמצעות העברה של אנרגיית תהודה ביולומינסנצית (BRET). טכניקה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של אינטראקציות בין חלבונים והערכה של השפעותיהן של מוטציות פתוגניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- אינטראקציות בין חלבונים
- דימיוג של תאים חיים
רקע
- אינטראקציות בין חלבונים הן קריטיות לתהליכים תאיים.
- לשיטות מסורתיות לחקר אינטראקציות אלו יש מגבלות.
- BRET מספקת גישה חדשנית לצפייה באינטראקציות בזמן אמת.
- טכניקה זו יכולה לסייע גם בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד החלבון.
מטרת המחקר
- לצפייה באינטראקציה בין שני חלבונים ספציפיים.
- לניצול BRET לצורך ניטור בזמן אמת בתאי חיים.
- להערכת ההשפעות של מוטציות פתוגניות פוטנציאליות על אינטראקציות אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סוב-קלונינג של CDNAs עבור החלבונים אל תוך פלסמידים.
- טרנספקציה של פלסמידים אל תוך תאי יונקים תרביתיים.
- ביטוי של חלבוני היתוך של YFP ולוסיפראז.
- הוספת סובסטרט לוסיפראז כדי להתחיל פליטת אור.
תוצאות עיקריות
- ביטוי מוצלח של חלבוני היתוך של YFP ולוציפראז בתאים חיים.
- תצפית על העברת אנרגיה המעידה על אינטראקציות בין חלבונים.
- הדגמת היתרונות של BRET על פני שיטות מסורתיות.
- תובנות לגבי השפעותיהן של מוטציות על אינטראקציות בין חלבונים.
מסקנות
- BRET היא שיטה יעילה לחקר אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים.
- טכניקה זו יכולה לספק תובנות בעלות ערך לגבי הדינמיקה של אינטראקציות בין חלבונים.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בהבנת ההשפעה של מוטציות על תהליכים תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
העברת אנרגיה רזוננסית בביולומינסנציה (BRET) מאפשרת ניטור כמותי בזמן אמת של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים, ובכך מספקת קריאה רגישה ורלוונטית פיזיולוגית לתיקוף מטרות. גישה זו תומכת בגילוי מוקדם על ידי אישור אינטראקציות חלשות, חולפות או תלויות-סביבה שעלולות להתפספס בבדיקות נקודת-סיום, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בהיפותזות טיפוליות. באמצעות זיהוי שיבושים באינטראקציה הנגרמים ממוטציות פתוגניות, BRET מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ומספקת מידע לקבלת החלטות go/no-go בבחירת מטרות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאשר אינטראקציות putative בין חלבונים שזוהו באמצעות שיטת yeast two-hybrid או ספקטרומטריית מסות בהקשר של תא חי.
- ערך מדעי: מזהה אינטראקציות חלשות או חולפות הרגישות לסביבה הביוכימית הטבעית, ובכך מגביר את מידת הוודאות לגבי המטרה.
- ערך תפעולי: דורש זמן עבודה מעשי מינימלי ומספר מועט של ריאגנטים, מה שמאפשר חקירה בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput) של רשתות אינטראקציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר יחסי BRET כמותיים המשקפים את חוזק האינטראקציה והקרבה, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תואם לפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות ולקריאות של לומינומטר, מה שמקל על הגדלת ההיקף (scalability) עבור סריקת תרכובות או מוטציות.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה קינטית של דינמיקת האינטראקציה לאורך זמן, מה שמאפשר פורמטים של סריקה ברזולוציית זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מעריך את ההשפעה של מוטציות המופקות מחולים על אינטראקציות בין חלבונים, ומקשר בין ממצאים גנטיים להשלכות תפקודיות.
- ערך מדעי: ממפה דומייני אינטראקציה ומעריך השפעות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות, ובכך תומך בניתוח מבנה-תפקוד.
- ערך תפעולי: משתמש באותה מערכת תאים חיים לאורך שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים, מה שמבטיח רציפות תרגומית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-BRET משתלבת ברצף הגילוי, החל מהערכת המעורבות של המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, כאשר נתוני האינטראקציה מנחים את תעדוף המולקולות ואת מעקב המנגנונים.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת היפותזות טיפוליות על ידי אימות השאלה האם חלבונים רלוונטיים מקיימים אינטראקציה בתאים חיים, ובכך מפחיתה תוצאות חיוביות שגויות המהוות מאפיין של מערכות מלאכותיות.
- סריקה (Screening): מייצרת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המאפשרות השוואה בין חלבונים מסוג פרא (wild-type) לחלבונים מוטנטיים, או בחינת השפעת תרכובות על עוצמת האינטראקציה.
- אנליטיקה: פולטת אותות נפרדים של תורם (donor) ומקבל (acceptor) שניתן להפוך ליחסיים (ratio-metricized) כדי לנרמל את השונות בביטוי, ובכך לשפר את מהימנות הנתונים.
- מחקר תרגומי: מעריכה האם מוטציות הקשורות למחלה משבשות אינטראקציות מפתח, ובכך מספקת תיקוף פונקציונלי למטרות גנטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לסריקת אינטראקציות על פני מספר מטרות, ובכך מצמצמת את המאמץ הנדרש לפיתוח מחדש של הבדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי זיהוי אינטראקציות בסביבת תאים חיים הרלוונטית פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת האינטראקציה באמצעות הוספה עקבית של תסבסב ושילוב לומינומטר, המפחיתה את השונות בין בארות.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות מוקדמות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אישור או הפרכת השערות לגבי אינטראקציות לפני השקעה משמעותית.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעודוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על חוסן האינטראקציה ורגישות למוטציות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשבט מולקולרי ליצירת מבני איחוי של לוסיפרז ו-YFP.
- תלוי בגישה למדיד אור (luminometer) למדידה רצפית של פליטת תורם ומקבל.
- מחייב אופטימיזציה של יחסי ביטוי כדי למנוע רוויה של התורם או המקבל שעלולה לעוות את אותות ה-BRET.
- דורש בקרות להעברה לא-ספציפית של אנרגיה, כולל זוגות איחוי שאינם מקיימים אינטראקציה ומוטציות של לוקליזציה סוב-סלולרית.
- מוגבל לצורך בקרבה גבוהה (<10 nm) בין התורם למקבל, מה שעשוי שלא לשקף את כל האינטראקציות הרלוונטיות מבחינה ביולוגית.
