שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן באינטראקציה הדינמית בין חלבון קושר DNA יחיד למולקולת DNA. זה מושג על ידי שילוב במיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית, שתי טכניקות של מולקולה בודדת, פינצטה אופטית כפולה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מערך זה מצויד גם בתאורת שדה בהירה להדמיה וייצוב ננומטרי של הדגימה.

כשלב שני, תא זרימה רב-ערוצי המשולב במערכת מיקרו זרימה נבנה כדי לאפשר עד ארבע זרימות למינריות לגייס ולהרכיב ביעילות את כל הרכיבים הנדרשים לניסוי. לאחר מכן, מבנה המולקולה הבודדת מורכב על מנת לבצע את הניסויים. שתי המיקרוספירות הראשונות המצופות טיטין נתפסות עם הפינצטה האופטית הכפולה בערוץ הראשון.

שני החרוזים הלכודים מועברים לאחר מכן לערוץ השני כדי לאפשר את ההצמדה של תבנית הדנ"א המסומנת בביוטין בשתי הגפיים. נוכחותה של מולקולת DNA בודדת נבדקת בערוץ השלישי על ידי ניתוח הארכת כוח DNA. לבסוף, מבנה חרוז ה-DNA של החרוז הנקרא משקולת DNA מועבר לתעלת החלבון שבה קיים חלבון מדכא הלקטוז המסומן פלואורסצנטי.

מתקבלות תוצאות המראות דיפוזיה וקשירה ספציפית של מולקולות עין LAC בודדות על מולקולת DNA מתוחה אחת וכימות הפרמטרים הקינטיים של תנועת העין LAC. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות מולקולה בודדות קיימות הם האפשרות לשלוט במתח המופעל על המולקולה החדשה, האפשרות לעקוב במדויק אחר תנועות החלבונים המקשרים על פני נקודה יציבה ננומטרית, כמו גם היכולת לפעול הרחק ממשטח השינה המכוסה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על אינטראקציות DNA של חלבונים, במיוחד על המכניקה של ויסות ביטוי גנים, כמו גם הדינמיקה של דיפוזיה של חלבון לאורך ה-DNA במנגנוני חיפוש המטרה.

הדגמה זו של שיטה זו שימושית מאוד כדי להראות את ההיבטים המעשיים של בניית הטיפול בדגימת תאי הזרימה והרכבה של מבנה חרוז ה-DNA הפעם. סרטון זה ידגים תחילה כיצד לבדוק את יציבות ההצבעה של שני לייזרי הלכידה באמצעות מיקרו חרוזים שנתקעו על משטח החלקה של כיסוי כהפניה. פרטים על התכנון והבנייה של מערך הפינצטה האופטית ניתן למצוא בטקסט הפרוטוקול המצורף.

השתמש בהחלקת כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר כדי לפזר שני מיקרוליטר של חרוזי סיליקה על פני השטח של פתק כיסוי בגודל 24 על 32 מילימטר. בעזרת שתי חתיכות סרט דו צדדי. חבר את החלקת הכיסוי בגודל 24 על 32 מילימטר על שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור תא זרימה.

מלאו את תא הזרימה ב-50 מילימולר של מאגר פוספט ואטמו אותו בתמונת שומן סיליקון. חרוז סיליקה אחד במיקרוסקופ שדה בהיר, בהגדלה של פי 2000 בקירוב. שדה הראייה צריך להיות בערך שבעה על חמישה מיקרומטרים, נרכש ב-7, 68 על 5, 76 פיקסלים, כך שתמונת החרוז בקוטר של כ-190 פיקסלים, מפצה על סחיפות תרמיות באמצעות תוכנת משוב המחשבת מיקום XY ממרכז התמונה ו-Z מטבעות העקיפה ומתקנת סחיפה.

הזזת שלב פיזו בדיוק ננומטרי או חפיפה טובה יותר של מרכז המלכודת השמאלית עם מרכז החרוז ומדידת רעש המיקום וסטיית התקן שלו מדיודת הצילום של גלאי הרביע או QDP. חזרו על המדידה להשמנה הימנית. סטיית התקן של רעש המיקום צריכה להיות בטווח של כמה ננומטרים כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של חלבונים קושרי DNA כדי ליצור את תא הזרימה.

קצה יהלום משמש לראשונה לקידוח חורים בקוטר מילימטר אחד במיקרוסקופ בגודל 76 על 76 על מילימטר אחד. החלק כדי ליצור ארבעה כניסות ויציאה אחת. זה יאפשר עד ארבע זרימות חיץ מקבילות.

כל אחד מהם מכיל אחד מהרכיבים השונים הנדרשים לחרוזי הניסוי, חלבון עם תווית פלואורסצנטית של DNA ומאגר הדמיה. נקה את שקופית המיקרוסקופ עם אתנול ומרכז את היציאה כשטבעת ה-O מוכנסת וטבעת ההדבקה בשקופית המקיפה את חורי הגישה. חיוני ללבוש כפפות בשלב זה כדי למנוע טביעות אצבעות, שיפריעו לתהליך ההדבקה.

בעזרת שקופית שנייה מהדקים את יציאות הננו לשקופית ומכניסים לתנור שחומם מראש ל-180 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר חיבור מלא. בינתיים, צייר את תבנית המתאר של תא הזרימה על פיסת נייר. התעלה צריכה להיות ברוחב של כשלושה מילימטרים ולהתאים לכל המיקומים בשקופית המיקרוסקופ.

הניחו את הציור על גבי שתי חתיכות פרפיל ובעזרת אזמל, חתכו חתכים חדים ומתמשכים לאורך קווי המתאר המצוירים. הסר את כל הבליטות שנוצרו, השליך את שכבת הבושם התחתונה, המשמשת רק להבטחת תמיכה נקייה. לאחר מכן, הנח את שקופית המיקרוסקופ המכילה את יציאות הננו המצורפות הפוכות בתמיכה המתכתית.

יישר בזהירות את מתאר תא הפרפורם עם החורים, וודא שהפרם אינו מוציא את הכניסות והיציאה של מכסה החדר עם החלקת כיסוי מיקרוסקופ נקייה והסר בזהירות פרמטרים עודפים המקיפים את החדר. הנח שני גושי חום שחוממו בעבר ב-120 מעלות צלזיוס על גבי תא הזרימה כדי להפעיל עליו לחץ הומוגני. תנו לסרט הפרה להמיס כ-25 דקות.

השלב הבא הוא הכנת מאגר הלחץ ומיכלי החיץ. מאגר הלחץ עשוי פרספקס ומאפשר לינה של עד שישה מיכלי חיץ. ראשית, חבר את שסתומי הכיבוי ביציאה ממיכלי החיץ להפעלת זרימת החיץ עם ידית השסתום במצב אנכי או כבוי במצב מסובב בכיוון השעון.

במהלך הניסויים, הרכיב את תא הזרימה על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן חבר את שסתומי הכיבוי דרך אתר הפולי, אתר קטון או צינורות שיא, ואת הספינינגים חסרי האוגן לכניסות תא הזרימה. צינורות השיא בקוטר פנימי של כ-150 מיקרומטר קילומטרים, כשלושה סנטימטרים של צינורות אתילן פרופילן מופלרים בקוטר פנימי של כ-500 מיקרומטר משמשים כקישור בין צינורות השיא למכלולי הננו של תא הזרימה.

זה חיוני כדי להפחית את זרימת המאגר בכניסה לתא כדי למנוע שבירה של תא הזרימה או ניתוק יציאת הננו מהזכוכית. לעומת זאת, השימוש בצינורות בקוטר פנימי גדול בלבד ידרוש כמויות גדולות של דגימות ביולוגיות. חבר את יציאת תא הזרימה לצינור פלקון פתוח בלחץ אטמוספרי.

צינור זה משמש כסילוק למאגר הזורם מתא הזרימה. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר A לכל אחד ממיכלי החיץ והפעל לחץ של 200 מיליבר כדי לשטוף את צינורות החיבור ותא הזרימה. מערכת בקרת לחץ מסוגלת.

לבסוף, התאמת לחץ האוויר בתוך מאגר הלחץ. בדוק אם יש בועות אוויר, שעלולות לשבש את חלקות הזרימה. תנועה עדינה על צינור היציאה תעזור להסיר את כל הבועות שנותרו, להפחית את הלחץ ל-20 מיליבר ולוודא שכל התעלות והצינורות נקיים מבועות אוויר ושהמאגר זורם במהירויות דומות בכל הערוצים.

הכן את הדגימות לנפח סופי של 300 מיקרוליטר. ניסוי זה משתמש בחרוזי פוליסטירן מצופים סטרפט, DNA ביוטיניל ליניארי בשתי הגפיים המכילים רצפי מטרה ספציפיים לקשירת מדכא לקטוז וחלבון מדכא לקטוז המסומן פלואורסצנטי. הוסף כל דגימה לאחד ממיכלי המזרק בסדר הבא חרוזים ב-DNA של הערוץ הראשון בשני, את מאגר ההדמיה בשלישי ואת החלבון המסומן בערוץ הרביעי.

הפעל את הזרימה ב-20 מיליבר ופתח את שסתומי הכיבוי כדי לאפשר לדגימות להגיע לתוך תעלת הזרימה. ניתן לזהות זאת בקלות בערוץ החרוזים. תוך כדי הדמיית הערוץ הראשון תחת תאורת שדה בהיר, הפעל את שתי הפינצטות האופטיות ותפס חרוז פוליסטירן בכל מלכודת.

עברו במהירות לערוץ השני כדי למנוע מהחרוזים האחרים ליפול למלכודות. שימו לב שההגעה לתעלת הדנ"א מורגשת בקלות בסוף זרימת החרוזים. באמצעות מסיט אופטי אחד של AO או מהלך OD, חרוז מלכודת אחד קדימה ואחורה בסמיכות לחרוז השני כדי לאפשר את הצמדת ה-DNA המורחב של הזרימה בין שני החרוזים הלכודים אופטית.

כאשר נוצרת משקולת DNA, החרוז הסטטי מתחיל לעקוב אחר תנועת החרוז המועבר באופן פעיל קדימה ואחורה על ידי המלכודת. עבור במהירות לערוץ המאגר וכבה את זרימת המאגר. בצע ניתוח עקומת הארכת כוח כדי לאמת את נוכחותה של מולקולת DNA בודדת.

זה מושג על ידי הפרדת שני החרוזים זה מזה תוך מדידת מתח ה-DNA. לאחר קבלת משקולת DNA בודדת, הפעל שוב את הזרימה והעביר את המשקולת לתעלת החלבון. עבור למיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב כדי לנטר את האינטראקציה של חלבון מדכא הלקטוז המסומן עם DNA, כבה את הזרימה והתחל ברכישה.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של מדכא לקטוז בודד או מולקולות עין לאק המקיימות אינטראקציה עם מולקולת DNA מתוחה. באגראם CH מייצג זה, מולקולת עין לאק בודדת מתפזרת לאורך רצפי DNA לא ספציפיים, בעוד שמולקולת עין לאק אחרת קשורה באופן ספציפי למפעיל אחד הממוקם במרכז מולקולת ה-DNA. תרשים זה מראה את המיקום של שתי מולקולות עין הלאק לאורך הכיוון המחבר בין מרכזי שתי המלכודות.

כפונקציה של זמן, מיקומי המולקולות נקבעו על ידי אלגוריתם מרכז הסימטריה הרדיאלית המוצג כאן הוא תרשים של התזוזה הריבועית הממוצעת או MSD לעומת הזמן עבור מולקולת עין לאק בודדת המפוזרת לאורך מולקולת DNA מתוחה. ניתן לקבל את מקדם הדיפוזיה של החלבון בקלות מרגרסיה ליניארית של הנתונים. השילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה הוא שיטה רבת עוצמה, המאפשרת בקרה מכנית על פולימר ביולוגי יחיד כגון D-N-A-R-N-A או חוט שלד ציטו, ולוקליזציה בו זמנית של מולקולות חלבון בודדות המקיימות אינטראקציה עם הפולימר עצמו.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ששילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה של מולקולה בודדת דורש תכנון קפדני של מערך הניסוי כדי להבטיח יציבות ברמת הננומטר של הפולימר המרחף. מצד שני, יש צורך בתכנון נכון של הגשושית הביולוגית כדי להבטיח הפרדה מיוחדת בין לייזר ה-G הלוכד לבין הגשושית הפלואורסצנטית. אנא עיין בטקסט הפרוטוקול המצורף לפרטים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב את מולקולת ה- DNA בין שני המהירים האופטיים מכים את הרכבת המבנה הזה. זה מושג טוב יותר עם תא הזרימה הרב-ערוצי שעבורו סיפקנו את התיאור המפורט. ציינו גם כיצד לייעל את זרימת המאגר ולהסיר את בועות האוויר, שאחרת עלולות לפגוע בניסויים שלך.

בפרוטוקול הטקסט המשלב ניתן למצוא את הפרוטוקולים לתיוג הדנ"א בביו-TE, הדרוש להרכבה עם פעימות מצופות סטרפטווידין, כמו גם את הפרוטוקולים לסימון החלבון. לבסוף, הדגמנו את הפעולות שלב אחר שלב כדי לכמת את הקישור והדיפוזיה של חלבון מדכא לקטוז בודד על מולקולת DNA מתיחה.