שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לצפות באינטראקציה הדינמית בין חלבון בודד נקשר ל-DNA לבין מולקולת DNA. דבר זה מושג על ידי שילוב של שתי טכניקות של מולקולה בודדת במיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית: פינצטות אופטיות כפולות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מערכת זו מצוידת גם בתאורת שדה בהיר לצורך ויזואליזציה ובייצוב ננומטרי של הדגימה.

כשלב שני, נבנית תא זרימה רב-ערוצי המשולב במערכת זרימה מיקרוסקופית כדי לאפשר לעד ארבע זרימות למינריות לגייס ולהרכיב ביעילות את כל הרכיבים הדרושים לניסוי. לאחר מכן, מורכב מבנה המולקולה הבודדת על מנת לבצע את הניסויים. ראשית, שתי מיקרו-ספירות מצופות ב-strip titin נלכדות באמצעות פינצטה אופטית כפולה בערוץ הראשון.

שתי החרוזים הלכודים מועברים לאחר מכן לערוץ השני כדי לאפשר הצמדה של תבנית DNA המסומנת בביוטין בשני קצותיה. נוכחות של מולקולת DNA בודדת נבדקת בערוץ השלישי באמצעות ניתוח מתיחת כוח של DNA. לבסוף, המבנה של חרוז-DNA-חרוז, המכונה DNA dumbbell, מועבר לערוץ החלבונים שבו נמצא חלבון מדכא לקטוז המסומן פלואורסצנטית.

התוצאות שהתקבלו מראות דיפוזיה וקישור ספציפי של מולקולות LAC eye בודדות על מולקולת DNA בודדת מתוחה, וכימות של הפרמטרים הקינטיים של תנועת ה-LAC eye. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות למולקולה בודדת הם האפשרות לשלוט במתיחות המופעלת על המולקולה החדשה, האפשרות לעקוב במדויק אחר תנועות של חלבוני קישור מעל נקודה יציבה ברמה ננומטרית, וכן היכולת לפעול הרחק מפני השטח של זכוכית הכיסוי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאינטראקציות בין חלבונים ל-DNA, במיוחד בנוגע למכניקה של ויסות ביטוי גנים, וכן לדינמיקה של דיפוזיית חלבונים לאורך ה-DNA במנגנונים של חיפוש מטרה.

הדגמה זו של השיטה שימושית מאוד להצגת ההיבטים המעשיים של בניית תא הזרימה, טיפול בדגימות והרכבת מבנה חבב DNA על חרוז. סרטון זה ידגים תחילה כיצד לבדוק את יציבות המיקוד של שני לייזרי הלכידה באמצעות חרוזי מיקרו הדבוקים לפני השטח של כיסוי זכוכית (cover slip) כנקודת ייחוס. פרטים על התכנון והבנייה של מערכת המלקחיים האופטיים ניתן למצוא בטקסט הפרוטוקול הנלווה.

השתמשו בלוחית כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר כדי לפרוס 2 µL של חרוזי סיליקה על פניו של לוחית כיסוי בגודל 24 על 32 מילימטר. בעזרת שתי חתיכות של סרט דביק דו-צדדי, הצמידו את לוחית הכיסוי בגודל 24 על 32 מילימטר לזכוכית מיקרוסקופ כדי ליצור תא זרימה.

מלאו את תא הזרימה ב-50 millimolar של בופר פוספט ואטמו אותו באמצעות גריס סיליקון. חרוש סיליקה במיקרוסקופיית שדה בהיר בהגדלה של כ-2000 פעמים. שדה הראייה צריך להיות בערך שבעה על חמישה מיקרומטרים, שנרכש ברזולוציה של 68 על 576 פיקסלים, כך שקוטר תמונת החרוש יהיה כ-190 פיקסלים. פַסו את הסטיות התרמיות באמצעות תוכנת משוב המחשבת את מיקום ה-XY ממרכז התמונה ואת ה-Z מטבעי העקיפה ומתקנת את הסטיות.

הזז את במת הפיזו (pizo stage) בדיוק ננומטרי או טוב יותר כדי להחליף את מרכז המלכודת השמאלית במרכז החלקיק, ומדוד את רעש המיקום ואת סטיית התקן שלו באמצעות הפוטודיודה של גלאי הרביעים (QDP). חזור על המדידה עבור המלכודת הימנית. סטיית התקן של רעש המיקום צריכה להיות בטווח של מספר ננומטרים כדי לאפשר מיקום מדויק של חלבוני קישור ל-DNA לצורך בניית תא הזרימה.

ראש יהלום משמש ראשית לקדיחה של חורים בקוטר של 1 mm בזכוכית של שקופית מיקרוסקופ במידות של 76 על 76 על 1 mm, כדי ליצור ארבעה פיתחי כניסה ופתח יציאה אחד. דבר זה יאפשר עד ארבעה זרימות מקבילות של בופר.

כל אחד מהם מכיל את אחד מהמרכיבים השונים הדרושים לניסוי: חרו지를, DNA, חלבון מסומן פלואורסצנטית ותמיסת דימוי. נקו את תבנית הזכוכית של המיקרוסקופ עם אתנול ומרכזו את הפתח כאשר אטם ה-O-ring מוכנס וטבעת הדבק נמצאת על התבנית מסביב לחורי הגישה. חובה להרכיב כפפות במהלך שלב זה כדי למנוע טביעות אצבע, אשר יפריעו לתהליך ההדבקה.

בעזרת תפסית זכוכית שנייה, הצמידו את הננו-פורטים (nano ports) לתבנית והניחו אותה בתנור שחומם מראש ל-180 °C למשך שעה אחת כדי לאפשר הידבקות מלאה. בינתיים, שרטטו על פיסת נייר את תבנית המתאר של תא הזרימה (flow cell). רוחב התעלה צריך להיות כ-3 mm ולהתאים למיקומי החורים על תבנית הזכוכית של המיקרוסקופ.

הנח את הרישום על גבי שתי פיסות של perfil ובאמצעות סקלפל, בצע חתכים חדים ורציפים לאורך קו המתאר המצויר. הסר בליטות שנוצרו, והשלך את שכבת ה-parfum התחתונה, המשמשת רק כדי להבטיח תמיכה נקייה. לאחר מכן, הנח את זכוכית המיקרוסקופ המכילה את ה-nano ports המחוברים, כשהם הפוכות, בתוך התמיכה המתכתית.

יישרו בזהירות את קווי המתאר של תא הפרפילם עם החורים, תוך וידוא שהפרפילם אינו חוסם את פתחי הכניסה והיציאה של מכסה התא עם זכוכית כיסוי נקייה של מיקרוסקופ, והסירו בזהירות שאריות פרפילם מסביב לתא. הניחו שני בלוקים של חימום שחוממו מראש ל-120 °C על גבי תא הזרימה כדי להפעיל עליו לחץ הומוגני. הניחו לפרפילם להמיס למשך כ-25 דקות.

השלב הבא הוא הכנת מאגר הלחץ ומכלי התמיכה. מאגר הלחץ עשוי מפרספקס ומאפשר הכנסה של עד שישה מכלי תמיכה. ראשית, חברו את שסתומי הסגירה ביציאה של מכלי התמיכה, כדי להפעיל את זרימת התמיכה כאשר ידית השסתום במצב אנכי, או לכבות אותה כאשר היא מסובבת עם כיוון השעון.

במהלך הניסויים, התקינו את תא הזרימה על במיקרוסקופ. לאחר מכן, חברו את שסתומי הסגירה באמצעות צינורות poly ether ether ketone או PEEK, ואת המחברים ללא אגף (flangeless spinnings) לכניסות של תא הזרימה. לצינורות ה-PEEK קוטר פנימי של כ-150 µm; כ-3 cm של צינור fluorinated ethylene propylene בעל קוטר פנימי של כ-500 µm משמשים כקישור בין צינורות ה-PEEK למכלולי הננו-פורט (nano port) של תא הזרימה.

פעולה זו חיונית להפחתת זרימת הבאפר בכניסה לתא, כדי למנוע שבירה של תא הזרימה או ניתוק של הננו-פורט (nano port) מהזכוכית. מנגד, שימוש בצינורות בעלי קוטר פנימי גדול בלבד ידרוש נפחים גדולים של דגימות ביולוגיות. חבר את יציאת תא הזרימה לשפופרת פאלקון (Falcon) פתוחה בלחץ אטמוספרי.

מבחנה זו משמשת לפינוי הבאפר הזורם אל מחוץ לתא הזרימה. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 1 mL של באפר A לכל אחד ממכלי הבאפר והפעל לחץ של 200 mbar כדי לשטוף את צינורות החיבור ואת תא הזרימה. ניתן להשתמש במערכת לבקרת לחץ.

לבסוף, יש לכוון את לחץ האוויר בתוך מאגר הלחץ. בדקו אם קיימות בועות אוויר, שעלולות להפריע לרציפות הזרימה. נקישה קלה על צינור היציאה תסייע בהסרת בועות שנותרו; הפחיתו את הלחץ ל-20 millibars, ואששו כי כל הערוצים והצינורות נקיים מבועיות אוויר וכי הבאפר זורם במהירויות דומות בכל הערוצים.

הכינו את הדגימות לנפח סופי של 300 microliters. ניסוי זה משתמש בחרוזי פוליסטירן מצופים ב-strept, ב-DNA ליניארי שביוטיניל בשני קצותיו ומכיל רצפי מטרה ספציפיים להיקשרות חלבון מדכא לקטוז, ובחלבון מדכא לקטוז מסומן פלואורסצנטית. הוסיפו כל דגימה לאחד ממיכלי המזרק לפי הסדר הבא: חרוזים בערוץ הראשון, DNA בשני, תמיצת דימוג בשלישי והחלבון המסומן בערוץ הרביעי.

הפעילו את הזרימה בלחץ של 20 millibars ופתחו את שסתומי הסגירה כדי לאפשר לדגימות להגיע אל תוך תעלת הזרימה. ניתן לזהות זאת בקלות בתעלת החרוזימים. בזמן הדמיה של התעלה הראשונה תחת תאורת שדה בהיר (brightfield), הפעילו את שני המלקחים האופטיים ולכדו חרוזי פוליסטירן בכל אחת מהמלכודות.

עברו במהירות לערוץ השני כדי למנוע מחרוזי חרוזים אחרים ליפול למלכודות. שימו לב שההגעה לערוץ ה-DNA ניתנת להבחנה בקלות על ידי סיום זרימת החרוזים. באמצעות מסיט אופטי AO אחד או תנועת OD, הזיזו חרוז מלכוד קדימה ואחורה בסמיכות לחרוז השני כדי לאפשר את היצמדות ה-DNA המוארך מהזרימה בין שני החרוזים הלכודים אופטית.

בעת היווצרות משקולת DNA, החרוז הסטטי מתחיל לעקוב אחר תנועתו של החרוז שמונע באופן פעיל קדימה ואחורה על ידי המלכודת. עברו במהירות לערוץ הבאפר וכבו את זרימת הבאפר. בצעו ניתוח של עקומת כוח-מתיחה (force extension curve) כדי לוודא נוכחות של מולקולת DNA בודדת.

פעולה זו מבוצעת על ידי הפרדת שתי החרו지를 תוך כדי מדידת המתיחות של ה-DNA. לאחר קבלת משקולת DNA (dumbbell) בודדת, הפעל שוב את הזרימה והעבר את המשקולת לערוץ החלבון. עבור למיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה רחב (wide field fluorescence microscopy) כדי לנטר את האינטראקציה של חלבון מדכא הלקטוז המסומן עם ה-DNA, כבה את הזרימה והתחל ברכישת הנתונים.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של מולקולות בודדות של מדכא לקטוז (lactose repressor) או lac eye המקימות אינטראקציה עם מולקולת DNA מתוחה. בדיאגרמה מייצגת זו, מולקולת lac eye בודדת מפעפעת לאורך רצפי DNA לא ספציפיים, בעוד שמולקולת lac eye אחרת קשורה באופן ספציפי לאופרטור אחד הממוקם במרכז מולקולת ה-DNA. גרף זה מציג את מיקומן של שתי מולקולות ה-lac eye לאורך הכיוון המחבר בין מרכזיהן של שתי המלכודות.

מיקומי המולקולות נקבעו כפונקציה של הזמן באמצעות אלגוריתם מרכז הסימטריה הרדיאלית; מוצג כאן גרף של ההעתק הריבועי הממוצע (MSD) אל מול הזמן עבור מולקולת lacI בודדת המפעפפת לאורך מולקולת DNA מתוחה. ניתן להפיק בקלות את מקדם הדיפוזיה של החלבון באמצעות רגרסיה ליניארית של הנתונים. השילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה הוא שיטה עוצמתית, המאפשרת בקרה מכנית על פולימר ביולוגי בודד כגון DNA, RNA או סיב של השלד התאי, ובמקביל למיקום של מולקולות חלבון בודדות המקיימות אינטראקציה עם הפולימר עצמו.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי שילוב של טכניקות של מניפולציה והדמיה של מולקולה בודדת מחייב תכנון קפדני של מערך הניסוי כדי להבטיח יציבות ברמה ננומטרית של הפולימר התלוי. מאידך, נדרש תכנון נכון של הגשוש הביולוגי כדי להבטיח הפרדה מרחבית בין לייזר ה-G הלוכד לבין הגשוש הפלואורסצנטי. אנא עיינו בטקסט של הפרוטוקול המצורף לקבלת פרטים נוספים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מרכיבים את מולקולת ה-DNA בין שתי פעימות האופטיקה המהירות. הרכבת מבנה זה תתבצע בצורה טובה יותר באמצעות תא זרימה רב-ערוצי, עבורו סיפקנו תיאור מפורט. כמו כן, הדרכנו כיצד למטב את זרימת התמימות (buffer) ולהסיר בועות אוויר, שעלולות אחרת לפגוע בניסויים שלכם.

בפרוטוקול הטקסט המאוחד, תוכלו למצוא את הפרוטוקולים לסימון ה-DNA באמצעות bioTE, פעולה הנחוצה לצורך ההרכבה עם חרו지를 מצופי streptavidin, וכן את הפרוטוקולים לסימון החלבון. לבסוף, הצגנו את שלבי הפעולה להערכה כמותית של הקישור והדיפוזיה של חלבון lactose repressor בודד על מולקולת DNA מתוחה.