Name: טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: למדו טיהור חלבון CFTR טרנסממברני מ-Saccharomyces cerevisiae לחקירת ציסטיק פיברוזיס. שיטה זו מאפשרת בידוד כמויות מיליגרם של חלבון פעיל לפיתוח תרופות ומחקר מבני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן האמריקנית סיסטיק פיברוזיס (CFF) באמצעות קונסורציום מבנה CFTR 3D שלה. TR מומן על ידי מלגת לימודים בבריטניה CF אמון, וצפון קרוליינה על ידי מלגת לימודים בבריטניה BBSRC. אנו מכירים עמיתינו בקונסורציום מבנה CFF CFTR 3D לעזרת והעצה ועל העיצוב של תגי רצף CFTR עוף וטיהור מותאמים קודון.

1. הכנת חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מניית 100x של מעכבי פרוטאז קוקטייל (PI) לפזר 96 AEBSF מ&quot;ג, chymostatin 3.5 מ&quot;ג, 10 מ&quot;ג E64, 16.5 leupeptin מ&quot;ג, 16.5 pepstatin מ&quot;ג, 348 PMSF מ&quot;ג, ו -4 מ&quot;ג bestatin ב20 מיליליטר DMSO. הפוך aliquots 1 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. כדי להפוך את המניה 100x של benzamidine, לפזר 720 מ&quot;ג ב20 מיליליטר מים ultrapure (DDH 2 O) ולאחסן ב 1 מיליליטר aliquots ב -20 ° C. כמות זו תספיק לטיהור אחד. בכל המאגרים, מניות PI וbenzamidine משמשות בדילול 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;mPIB&#39; (0.3 pH M טריס 8, 0.3 M סוכרוז, 2 מ&quot;מ DTT) ו&#39;CFTR &#39;(50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / גליצרול v), 1 מ&quot;מ DTT) חוצצים וצינה עד 4 ° C . לפני השימוש, מוסיף 1:100 של מעכבי פרוטאז הקוקטייל ו1:100 benzamidine בהתאם להיקף של mPIB משמש לresuspend התא גלולה (לדוגמא, השתמש 3.5 PI מיליליטר ו3.5 מיליליטר benzamidine בנפח כולל של 350 מיליליטר mPIB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את יםolubilization מאגרים. (, 10% (v / v) גליצרול, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, מעכבי פרוטאז (PIS) ו -4% גפ&quot;מ 50 מ&quot;מ טריס pH 8 (w / v)) חיץ solubilization גליצרול-14 (גפ&quot;מ) Lyso-phosphatidyl וחיץ solubilization maltoside dodecyl (DDM) (50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / גליצרול v), 1 M NaCl, 1 mM DTT, מעכבי פרוטאז, 4% (w DDM / V)). ניתן sonicated הצפת באמבטית sonicator (35 W, 40 קילוהרץ) כדי לסייע בפיזור של חומרי הניקוי, אך להימנע vortexing התערובת, כמו זה יוצר בועות. צ&#39;יל עד 4 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ טיהור CFTR לטיהור גפ&quot;מ הוא 50 מ&quot;מ טריס, 10% (v / v) גליצרול, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) גפ&quot;מ-14 ומעכבים פרוטאז. הכן 350 מיליליטר של חיץ זה, ו150 מיליליטר של אותו החיץ בתוספת imidazole ז 1. להתאים את pH של שני המאגרים ל8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאגר לטיהור בDDM מורכב מ50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / v) גליצרול, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. הכן 350 מיליליטר של חיץ זה, ו150 מיליליטר של אותו החיץ בתוספת imidazo 1 Mle. להתאים את pH של שני המאגרים ל8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ כרומטוגרפיה חלחול ג (GPC) המכיל גפ&quot;מ, להכין 50 מ&quot;מ טריס pH 8, 10% גליצרול (V / V), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05% (w / v) גפ&quot;מ-14. לGPC באמצעות DDM להכין מאגר של 50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / v) גליצרול, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. כל המאגרים וDDH 2 O בשימוש בעמודת GPC צריכים להיות מסוננים (0.2 מיקרומטר מסנן) וdegassed לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מדגם SDS-PAGE (2x ריכוז העבודה): 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.6, 5% (v / v) גליצרול, 5 מ&quot;מ EDTA, 0.02% (w / v) bromophenol כחול. הפוך 700 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לפני השימוש, מוסיף 200 μl של 20% (w / v) נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ושל טרי 0.5 M DTT 100 μl. דגירה של לפחות 10 דקות עם דגימה בטמפרטורת חדר לפני הטעינה על ג&#39;ל. אין לחמם; זה לפגל-GFP, ועלול לגרום CFTR לצבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מניות שומנים לכינון מחדש, לפזר תערובת 04:01 (w / w) של א &#39; coli שומניםכולסטרול ד בכלורופורם ומתנול (2:1 V / V), ויבש בבקבוקון זכוכית תחת 2 גז N עבור שעה 2 כדי ליצור סרט שומנים בדם. הוסף חוצץ GPC (ללא NaCl) לריכוז שומנים של 40 מ&quot;ג / מיליליטר ולהשתמש vortexing חוזר ונשנה וsonication (W 35, 40 קילוהרץ) כדי להבהיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ATPase, להכין 100x מניות של מעכבי ATPase ידי המסת SCH28080 ל1 מ&quot;מ DMSO, NaSCN לז 1 ב DDH 2 O וoligomycin ל2.5 מ&quot;מ ב100% (v / v) אתנול. חנות בaliquots ב -20 ° C. הפוך של חיץ ATPase 100 מיליליטר עם 50 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 5 מ&quot;מ MgSO 4 ו0.02% (w / v) NaN 3. זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר ומשמש לכמה מבחני. הכן מלאי 5 מ&quot;מ ATP מייד לפני השימוש ולשמור על קרח. (נ.ב. השתמש Na 2 ATP כדי למנוע אות רקע מוגזמת מפוספט בassay). הכן את פתרון SDS העצירה (12% (w / v) SDS ב DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי Chifflet להכין חיץ (3% (w/ V ascorbate), 0.5% (w / v) molybdate אמוניום, 0.5 M HCl) מייד לפני השימוש וחיץ B (2% (w / v) ציטרט הנתרן, 2% (w / v) meta-arsenite נתרן, 2% (V / V) חומצה אצטית). </li></ol> 2. בידוד של Microsomes שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ס cerevisiae להביע CFTR עוף גדלים כפי שמתואר באררייאן et al. (2012) 14. אחסן את החומר מתסיסת L 20 בשני aliquots ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot אחד מתאים במהירות וresuspend ב 3 מיליליטר mPIB המצונן לגרם של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים בטחנת חרוז באמצעות חרוזי זכוכית של 425-600 קוטר מיקרומטר. השתמש בחמש דקות 1 תקופות של שיבוש תא מופרדות על ידי תקופות מנוחת 1 דקות. (תקופות המנוחה הן חיוניות כדי להבטיח כי התאים אינם מחוממים במהלך הפרעה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הפרעה תא על ידי צנטריפוגה של מדגם 1 מיליליטר של lysate התא מן טחנת חרוז. צנטריפוגה (12,000 XG, 4 ° C, 5 דקות) בcentr גבי ספסלifuge. לדלל את supernatant ל01:50 עם mPIB בקובט ולמדוד את 380. אם 380&gt; 0.1, או הפסיק הגדלת למרות כמה מחזורי חרוז-מכות חוזרות ונשנות, להמשיך לשלב הבא. אם לא, תחזרו על 2.3-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא הכולל (12,000 x גרם, 4 ° C, 20 דקות). שמור את supernatant. זורק את הכדור (המכיל תאים ומיטוכונדריה רצופים), אבל אם יש לו ספקות לגבי היעילות של שבירת תא (ראה 2.4), ואז לשמור גם גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant מהשלב הקודם (200,000 XG, 4 ° C, 1.5 שעות). בטל supernatant ו resuspend קרומי microsomal pelleted במאגר CFTR. אם microsomes מיועד לטיהור באמצעות DDM, להשלים את חיץ CFTR עם 1 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צנטריפוגה של שבריר קרום resuspended (100,000 x גרם, 4 ° C, 1 שעות) וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend microsomes pelleted בהיקף מינימאלי של חיץ CFTR (נפח סופי 5-15 מיליליטר, חלבון microsomal סך 70-200 מ&quot;ג). Assay ברדפורד ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז הכולל של חלבוני microsomal 25. בנוסף ספקטרום פליטת הקרינה של הקרומים יש למדוד (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 500-600 ננומטר) וצריך להיות שיא מובחן GFP פלואורסצנטי (מקסימום ב512 ננומטר). CFTR יכול להיות מזוהה באופן ספציפי על ג&#39;ל SDS-PAGE, נסרק בתנאי הקרינה ה-GFP (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flash-להקפיא microsomes resuspended ידי צולל לתוך חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב 3. </li></ol> 3. Solubilization של Microsomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קפוא, להפשיר microsomes מייד לפני השימוש באמבט מים מוגדר 10 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לsolubilization של ממברנות, לדלל את microsomes עם נפח שווה של החיץ הרלוונטי solubilization (שלב 1.3) לתת ריכוז חומר ניקוי סופי של2% (w / v) וריכוז 5 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון microsomal. דגירה את התערובת לשעה 1 ב4 ° C עם תסיסה (מסובב צינור). שמור 200 μl לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת (XG 100,000, 4 ° C, 45 דקות). הסר את supernatant המכיל החלבונים בממברנה solubilized, להעביר אותו דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ולאחסן על קרח. למדוד את הקרינה של supernatant (כמו בשלב 2.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שבריר מסיס ב1% (w / v) פתרון SDS לנפח שווה לחלק מסיס. למדוד את הקרינה בחלק זה ולשמור aliquot של 50 μl לניתוח SDS-PAGE. </li></ol> 4. טיהור ניקל זיקה של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות שני sepharose ניקל 5 מיליליטר הקישור בסדרה. לשטוף עם 2 כרכי עמודה (CV) 20% אתנול (V / V), ואחרי 2 קורות חיים DDH 2 O, ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם 2 קורות חיים של חיץ solubilization (שלב 1.4-1.5), המכיל imidazole ז 1. חזור על פעולה עם 2 קורות חיים של solubilizatיון החיץ חסר imidazole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת imidazole לריכוז סופי של 5 מ&quot;מ לחומר solubilized (שלב 2.8) ולטעון את החומר באופן ידני על הטור או לתוך לולאת מדגם אם באמצעות מכשיר כרומטוגרפיה נוזלי אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את חומרי solubilized על הטור בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה, ולשטוף עם 2 קורות חיים של חיץ חסר-imidazole באותו קצב הזרימה להסרת חומר מאוגד. איסוף שברים ב50 צינורות מיליליטר פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכביסה הראשונה, השתמש 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 40 מ&quot;מ בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להשתמש 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 100 מ&quot;מ. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute CFTR מעמודת HisTrap עם 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 400 מ&quot;מ. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הקרינה שבברי eluted (שלב 2.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור aliquots של שברים שיא לניתוח SDS-PAGE. ו שיא שנותר הקפאת פלאשדגימות raction ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב הטיהור הבא. </li></ol> 5. ג&#39;ל חלחול כרומטוגרפיה טיהור (GPC) של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה (Superose 6 10/300 GL) עם 1.2 קורות חיים DDH 2 O ואחריו 1.2 חיץ קורות החיים GPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב 5.1, לרכז את השברים המטוהרים Ni-הזיקה לקרינת ה-GFP הגבוהה ביותר באמצעות מסנן צנטריפוגלי 100,000 MWCO ב 4 ° C. אם טיהור בDDM, להימנע מריכוז המדגם מעל ריכוז חלבון של 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון כמו זה יגרום לאובדן מדגם משמעותי. הסר את retentate מהרכז ו צנטריפוגות ב 100,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C עד גלולה חלקיקים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מדגם זה על הטור וelute עם שיפוע isocratic של 1.2 חיץ קורות החיים GPC. לאסוף 0.5 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה ה-GFP כאמור בסעיף 2.8 לזהות את אותם שברים המכילים CFTR. לשמור על נפח קטן (לדוגמא: &lt;/ Em&gt; 50 μl) של כל אחד לניתוח על ידי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את השברים בחנקן נוזלים חנות ב -80 ° C. </li></ol> 6. כינונה מחדש של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שומנים (שלב 1.8) לCFTR המטוהרים ב100:1 שומנים בדם לחלבון יחס (w / w) ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כמו כן הקים שליטת שומנים בדם בלבד, החלפת החלבון מטוהר עם אותו הנפח של חיץ GPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חומרי ניקוי מתערובת חלבונים / שומנים בדם באמצעות חרוזים כושר ספיגה הידרופובי. לשטוף חרוזים בעלי כושר ספיגה ב5 קורות חיים DDH 2 O, 5 קורות חיים 70% (v / v) אתנול, 5 קורות החיים DDH 2 O, ו -5 חיץ קורות החיים GPC חסר חומרי הניקוי. הוסף 200 מ&quot;ג של חרוזים כושר ספיגה שטפו לכל מיליליטר של חלבון מטוהר ודגירה על 4 מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את דגימת הכינון מחדש מחרוזי כושר ספיגה לתוך צינור טרי באמצעות פיפטה קצה דק הסתיים. </li></ol> 7. מדידה של פעילות ATPase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את שיעור CFTפעילות ATPase R הספציפי באמצעות assay Chifflet הותאם 26,27 בפורמט צלחת 96 היטב. עם פתרון מניות פוספט נתרן (0.65 מ&quot;מ) להכין 0-20 פוספט nmol בנפח סופי של μl 50 כסטנדרטים. השתמש בתערובת 1:1 של חיץ CFTR וחיץ ATPase כדי לדלל את מניות פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני CFTR מחדש ויפוזומים ריקים עם 1:100 (V / V) מעכבי ATPase (שלב 1.9) על קרח דק 10. השתמש בלפחות 5 מיקרוגרם של CFTR מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ATP (שלב 1.9) לריכוז סופי של 2 מ&quot;מ ולדגור על 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עצור את התגובה על ידי הוספת 40 μl של 10% (w / v) SDS (שלב 1.9) זה טוב (בכלל זה, הסטנדרטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ 100 μl (שלב 1.10) ו דגירה עבור 10 דקות. הוספת 100 חיץ μl B (1.10) זה טוב ומדוד את הספיגה באורך גל של 800 ננומטר בUV / VIS ספקטרופוטומטר צלחת תואמת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת הספיגה ב 800 ננומטר לכמות של פוספט המשוחרר באמצעותסטנדרטים פוספט. חישוב שיעור הידרוליזה ATP לאחר הפחתת אות רקע (ליפוזום בלבד בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCFTR הלא מחדש בצע את אותו הפרוטוקול באמצעות חיץ CFTR לקריאה הרקע. </li></ol>

<ol><li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+%28ABCC7%29+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li>
<li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK%3A+1947-2003%5BTitle%5D)+AND+%22EUR+RESPIR+J%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li>
<li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li>
<li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li>
<li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology%3A+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li>
<li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li>
<li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+of+MRP1+%28ABCC1%29+and+related+ATP-dependent+drug+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li>
<li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li>
<li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li>
<li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li>
<li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li>
<li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li>
<li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA%3A+Alternating+access+with+a+twist%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li>
<li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter%3A+structure+and+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li>
<li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li>
<li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+functional+characterization%2C+and+NMR+studies+of+human+KCNE1%2C+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים ולא אינטרסים נוגדים אחרים ביחס לעבודה זו.

שתארנו בעבר שיטה לביטוי היתר של CFTR העכברי 14. מאז פרסום כי הפרוטוקול, שהבענו וטהר כמה orthologs שונה של CFTR באמצעות אותה המערכת. כל orthologs נבדק עד כה מטוהר היטב בחומר ניקוי גפ&quot;מ, תוך טיהור DDM הראתה יותר וריאציה על פני orthologs שונה (מידע לא מוצג). גמישות זו ממחישה את עוצמתו של שמרי הגישה: זה אפשרי למסך מבנים רבים במהירות היחסית כדי לבחור באחת למטרה מסוימת. שטיפת השמרים microsomes עם מאגר המכיל 1 M NaCl לפני solubilization עם תוצאות DDM בהכנת גופיפון נקיה יותר ומפחית את המזהמים בשלבים מאוחר יותר. שלב זה הוא מיותר בפרוטוקול גפ&quot;מ כמדגם CFTR הסופי הוא&gt; 90% טהור בלי לשטוף גופיפון. יתר על כן, טיהור בDDM דורשת מספר שינויים במאגרים לsolubilizationטיהור nd, כלומר התוספת של גליצרול ומלח נוספים. יחד, תוספות אלה הגדילו באופן משמעותי מחייבות של חלבון DDM-solubilized לעמודה. יש מתודולוגיה טיהור DDM היקף לשיפור, בפרט הסרת מזהמים עיקריים 40 kDa ש, נשפטו על ידי ספקטרומטריית מסה, בשל מקטע השמרים ריבוזומלי L3, אשר נראה כי יש זיקה מהותית לשרף ניקל. אין רצף polyHis ברור בחלבון L3, אך בחינה של מבנה 3D שלה כאשר חייב הריבוזום (PDB = 1FFK) מראה כי יש לו את מקטע L3 המקופל אשכול polyHis פוטנציאלי. שהלהקה הזו היא פחות בעייתית בחומר מטוהר גפ&quot;מ יכול להיות בגלל חומרי ניקוי גפ&quot;מ יותר קשה. למרות הטיהור בDDM נראית עני יותר מזה בגפ&quot;מ, חומרי ניקוי מתונים יותר כגון DDM עשוי להיות תואמים יותר עם ניתוחים תפקודיים ומבניים וכבר השתמשו בכמה crystall רנטגןמחקרי ographic של חלבונים בממברנה 15-21. יתר על כן, התוצאות שלנו מצביעות על כך שהשימוש בגפ&quot;מ מוביל לאובדן של תפקוד ATPase בביחס CFTR לטיהור בDDM. מכאן אנו ממליצים על פרוטוקול הטיהור מבוסס גפ&quot;מ עבור הדור של CFTR בי טוהר הוא קריטי, למשל ביישומים כגון אפיון לאחר translational שינויים, או בדור של נוגדנים, הפרוטוקול מבוסס גפ&quot;מ ייבחר . מצד השני ביישומים שבם הפעילות והמצב טבעי לחלוטין של החלבון חיוני, היינו מציע מבוסס פרוטוקול DDM כאפשרות טובה יותר. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור לבידוד של CFTR בDDM גפ&quot;מ-14 או חומר הניקוי שאינו היוני חומר ניקוי zwitterionic. ככזו, היא מצביעה על טווח רחב יותר של תנאים לטיהור CFTR מאשר דווחו בעבר 10-13. במיליגרם בנוסף כמויות של CFTR מטוהר יכולות להיותשהושג באמצעות נהלים אלה בשילוב עם מערכת שמרי צמיחה בנפח גבוה, כגון מערכת קצירת תא קיבולת גבוהה כמו הרוטור צנטריפוגה במהירות נמוכה 6 L פרמנטור ו20 L. יש CFTR השיג תג ה-GFP cleavable המאפשר ניטור קל של החלבון במבחני ביוכימיים וbiophysical שונים. ניתן להשיג מגיב שתואר בכתב היד הזה (פלסמיד המכיל CFTR עוף או תאי שמרים קפוא) באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס (ארה&quot;ב).

סיסטיק פיברוזיס (CF) הוא המחלה הגנטית הנפוצה ביותר באירופה ובצפון אמריקה עם שכיחות של 1 ל 2,500 לידה חי. CF מתרחש כאשר מוטציות ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) הפסד סיבת חלבון של תפקודו בקרום הפלזמה של תאי האפיתל 1. התוצאה החמורה ביותר של פגם זה היא נזק בלתי הפיך ריאות, מה שמקצר את תוחלת החיים של חולים ל&lt; 40 גיל 2,3. CFTR הוא קלטת ATP מחייב טרנספורטר (ABC) שהתפתחה להיות 1,4 ערוץ יון. למרות הפונקציה די שינתה בקרום הפלזמה של תאים, היא עדיין שומרת הומולוגיה ברצף משמעותית עם מובילי ABC אחרים. מעניין לגלות שהחלקים מיוחדים של CFTR (כלומר אזור הרגולציה שלה ו-N-ו-C-Termini) חולקים שום דמיון רצף משמעותי עם מובילי ABC מטזואניים אחרים, ומכאן שאין רמזים לגבי המקורות דואר של רצפים אלה בCFTR. על בסיס המבנה הראשוני שלה, CFTR מסווג חבר של משפחת טרנספורטר ABC C-משפחה, אבל אין ראיות חזקות להצמדה פונקציונלית שיורית למשנה המשפחה הזאת. היו כמה דיווחים על פעילות תחבורת גלוטתיון לCFTR 5-7, וזה יהיה בקנה אחד עם התפקידים של חברי C-משפחה אחרות 8,9, אם כי דיווחים אחרים עולה כי גלוטתיון מופחת עשוי לעכב את פעילות CFTR ATPase, ולא מראה את גירוי-Induced מצע המאפיינים את מובילי ABC 10. מדידת מוליכות יון היא רגישה מספיק כדי לאפשר את פעילות הערוץ של מולקולות CFTR אחת כדי להיחקר 1 ומאפייני ערוץ CFTR כבר במעקב כפונקציה של זמן, טמפרטורה, ריכוז ה-ATP, פוטנציאל הממברנה, ומדינת זירחון, כמו גם ב נוכחותו של מארח של מעכבי מולקולה קטנים, potentiators, ומכפילים. אלהגם מחקרים שהוספנו באופן משמעותי לידע של איך מובילי ABC לתפקד שלנו. עם זאת, ביטוי של CFTR בסכומים משמעותיים והטיהור הבאה שלה הוכיח להיות מאתגר במיוחד וההצלחה הייתה מוגבלת לכמה מעבדות 10-13. הצורך לפתח תרופות יעילות יותר דוחק, אך תהליך זה התעכב בשל חוסר CFTR מטוהר לסינון מולקולות קטנות. פתרון בעיית ביטוי CFTR והטיהור יאפשר הקרנת סמים תפוקה גבוהה שמטרתה לתקן את הפגם העיקרי בCF וגם לפתוח את מסלול ללימודים מבניים ברזולוציה גבוהה כדי ליידע את עיצוב סמים רציונלית. יתר על כן, אפילו מאפיינים ביוכימיים בסיסיים יחסית של חלבון, כגון מדינת oligomeric הפונקציונלית שלה, חלבוני אינטראקציה ופעילות ATPase יישארו מאופיינים בצורה גרועה. יש לנו דיווח פרוטוקול לביטוי בקנה מידה גדולה של ה-GFP-CFTR והעכברי מתויג-בעברבס 14 cerevisiae ועכשיו יתאר נוסף פרוטוקולים לטיהור של CFTR. יש לנו להשתמש בשיטות אלה כדי לטהר את חמש orthologues של CFTR, ומציג נתונים לטיהור של CFTR עוף לדוגמא ירושלים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני חומרי ניקוי מנוגדים לשימוש בטיהור. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) הוא חומר ניקוי nonionic שכבר נעשה שימוש נרחב לשני מחקרים מבניים ותפקודיים של חלבונים בממברנה 15-21. חומר הניקוי היוני 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) (גפ&quot;מ-14) הוא יעיל ביותר בsolubilization של CFTR ועבר כבר נעשה שימוש בטיהור של חלבונים בממברנה פונקציונליים 10, 22,23, כולל טיהור של CFTR מס 24 cerevisiae. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; מסנן מזרק M&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO רכז צנטריפוגלי (ממברנת PES)</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה 2 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>40Ti רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פלקון סטריליים</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>מלח אדנוזין טריפוספט דיסודיום (Na2ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה נוזלית</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>משבש תאים מכים חרוזי זכוכית</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית&nbsp;</td>צנטריפוגה ספסלית <td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה שולחנית&nbsp;</td><td>פישר</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>בנזמידין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים הידרופוביים SM-2 סופח</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>כימוסטטין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' C7268</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>43815</td><td></td></tr><tr><td>E. coli תמצית שומנים כוללת</td><td>Avanti lipids</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, חומצה שטוף</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap עמודות HP (5 מ"ל)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Coomassie Stain</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה JA-17 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td><td>Avanti lipids</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מיכל ג'ל מערכת SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>תקני חלבון צבוע מראש</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>עמודות התפלה (Sephadex G-25)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>פפסטין A</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SCH28080 סיגמא-אולדריץ'</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוציאנט (NaSCN)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>סינון ג'ל 10/300 עמודת GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים אולטרסאונד</td><td>Ultrawave</td><td>F0002202</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות מולטימוד</td><td>ביוטק</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

פגמים ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) חלבון גורמים סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה אוטוזומלית רצסיבית שכרגע מגבילה את תוחלת החיים הממוצעת של חולים ל&lt; 40 שנים של גיל. הפיתוח של מולקולות תרופה חדשניות כדי לשחזר את הפעילות של CFTR הוא מטרה חשובה בטיפול CF, והבידוד של CFTR תפקודי הפעיל הוא צעד שימושי להשגת מטרה זו. אנו מתארים שתי שיטות לטיהור של CFTR ממערכת אוקריוטים Heterologous ביטוי, ש &#39; cerevisiae. כמו מערכות פרוקריוטים, ש &#39; cerevisiae ניתן לגדל במהירות במעבדה בעלות נמוכה, אלא גם תנועה וposttranslationally יכול לשנות את החלבונים בממברנה גדולים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני שיתוףntrasting חומרי ניקוי לשימוש בטיהור שתאפשר הכנת CFTR הסופית להיות מותאמת לניסויים המתוכננים בהמשך. בשיטה זו, אנו מספקים השוואה של הטיהור של CFTR בdodecyl-β-D-maltoside (DDM) ו1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) (גפ&quot;מ-14). החלבון מטוהר בDDM בשיטה זו מעיד על פעילות ATPase במבחנים תפקודיים. החלבון מטוהר בגפ&quot;מ-14 תערוכות טוהר גבוה ותשואה, יכולים להיות מועסק על מנת ללמוד שלאחר translational שינויים, ויכול לשמש לשיטות מבניות כגון פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ומיקרוסקופים אלקטרונים. עם זאת הוא מציג פעילות ATPase נמוכה באופן משמעותי.

הפרוטוקול שתואר לעיל הוא אמצעי יעיל לבודד microsomes מועשר CFTR, עם התאוששות של CFTR כמעט מוחלטת במהלך שבירת התא והכנת microsomes הגולמי (איור 1). שיטות שבירת תא אחרות גם יכולות להיות מועסקות בצורה יעילה. יש לנו מנוצלים תא לחץ צרפתי, והתקני high-pressure/cavitation אחרים (גם בשילוב עם להשפיע נגד יעד אודם) עם יעילות שווה. לנוחות ועלות הראשונית נמוכה של הציוד, אנו מוצאים את שיטת חרוז ההכאה את הטוב ביותר. שימוש בגפ&quot;מ לsolubilize ולטהר CFTR הניב 80 תרבות חלבון מיקרוגרם / ליטר ב&gt; טוהר 90% (איור 2). התשואה הגבוהה נובעת solubilization יעיל של CFTR על ידי גפ&quot;מ (השווה איור 2b, מסלולים 2 ו -4). בנוסף, יעיל והדוק מחייב לעמודה הביאו להפסד המינימלי של CFTR בשבריר מאוגד וההיעדרות של CFTR בשברים לשטוף (איור 2, נתיבי 3, 5, ו6). היה חלבון eluted טוהר&gt; 90%, שהוערך על ידי ג&#39;לים SDS-PAGE צבעוני Coomassie ובאמצעות צפיפות של CFTR ולהקות מזהמים. כרומטוגרפיה חלחול ג&#39;ל (GPC) מופרדת CFTR-מטוהר גפ&quot;מ ממזהמים במשקל מולקולרי נמוכים (איור 4, פנל תחתון). הפרוטוקול לטיהור CFTR באמצעות DDM נותן טוהר% והתשואה של בערך 50 מיקרוגרם / ליטר (איור 3) על 60. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של שברים צבעוניים שלילי מGPC משחררי בכ -10 מיליליטר (איור 4) הראה כי CFTR מטוהר-DDM מכיל אגרגטים של 20-30 ננומטר בקוטר, כמו גם חלקיקים קטנים בקוטר של 10 ננומטר (מידע לא מוצג). יתכן כי אגרגטים הקטנים הפיך יכולים לקשר ולנתק כאולטרה סינון עם מסנן חתוכים 1 מד&quot;א לא הצליחו להסיר את אגרגטים EM-לזיהוי. חומר מטוהר גפ&quot;מ לא לספוג לרשת-שוחרר זוהר, ומכאן נחקר על ידי cryo-EM של שברים ללא רבב. זה הראהאוכלוסיית חלקיקים מאוד הומוגנית בגודל קטן יחסית (6-8 ננומטר קוטר, מידע לא מוצג). לבסוף, פעילות ATPase של החלבונים המטוהרים נמדדה (איור 5). כבן למשפחת חלבוני ABC, יש CFTR שני התחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs) מסוגל מחייב ו / או hydrolyzing ה-ATP. הנתונים מצביעים על כך שהחלבון מטוהר לא היה מסוגל hydrolyze ה-ATP במדינת גפ&quot;מ-solubilized והראה פעילות ATPase חלשה בנוכחות DDM (איור 5, בארים ללא מילוי). לאחר התוספת של שומנים, והסרת חומרי ניקוי, פעילות ATPase הייתה פי 4 גבוהה יותר עבור דגימות שטוהרו בDDM (13 nmol ATP / דקות / חלבון מ&quot;ג). התוספת של שומנים וסילוק של פעילות שוחזרה באופן דומה לגפ&quot;מ CFTR שהיה מבודד באמצעות גפ&quot;מ, אך עם שיעור סופי נמוך יותר (1.5 nmol ATP / דקות / חלבון מ&quot;ג) מאשר החומר DDM-מטוהר ומחדש. <img alt="איור 1"עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; src איור 1. רמות ניטור של CFTR העוף בlysate תא (CL), supernatants (S) וכדורים (P) במהלך שלבי צנטריפוגה שונים המשמשים לבידוד גופיפון וכביסה. ג&#39;לי-SDS היו דמיינו באמצעות הקרינה בג&#39;ל של ה-GFP תג. Supernatant לאחר שבירת התא וצנטריפוגה ב14,000 XG מכיל כמעט את כל CFTR (כולל מוצרים פגומים). Ultracentrifugation ב200,000 משקעי XG כל CFTR באורך מלא, והשאירו כמה שברים בsupernatant. Ultracentrifugation ב100,000 XG של כדורי microsomes-שטף מלח כמעט כל CFTR עם ההסרה של כמה שברים נוספים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> איור 2. טיהור של CFTR העוף בגפ&quot;מ על ידי כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת. שברים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו מכתים Coomassie (פנל עליון) וגילוי הקרינה של תג ה-GFP (פנל תחתון). שירים: (1) Microsomes. (2) microsomes-solubilized גפ&quot;מ. (3) חומר לא כרוך. (4) חומר בלתי מסיס. (5) (6) 40 ו100 שוטף imidazole מ&quot;מ. (7) חומר eluted עם 400 imidazole מ&quot;מ. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> איור 3. טיהור של CFTR העוף בDDM ידי כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת. שברים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו מכתים Coomassie. יד הלוח השמאלית מציג שברים לפני elution. כמה שברים elution רצופים מוצגים בלוח היד תקין עם CFTR בdicated על ידי החץ. מאוחר יותר שברים מועשרים במזהם kDa 40, אשר זוהה על ידי ספקטרומטריית מסה כחלבון ריבוזומלי L3. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> איור 4. טיהור של CFTR עוף ידי כרומטוגרפיה חלחול ג. CFTR מטוהר על ידי כרומטוגרפיה Ni-זיקה הייתה מרוכז ויחול על עמודת GPC. פרופיל elution לCFTR (פנל עליון) מטוהר במאגר המכיל גפ&quot;מ-14 (קו מוצק) או DDM (קו מקווקו) הם מעולף. SDS-PAGE (פנל תחתון) גילה כי CFTR eluted בין 8 ל 11 מיליליטר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> איור 5. Activit ATPasey של שברים CFTR העוף מטוהרים. החלבון מטוהר בDDM או גפ&quot;מ היה assayed באמצעות assay Chifflet הותאם 26 בנוכחות קוקטייל של מעכבי ATPase לחסל כל פעילות ATPase רקע מF-, P-וATPases V-הסוג (ברים ללא מילוי ). שיעור הידרוליזה ATP נמדד גם לאחר הסרת חומר ניקוי ובנוסף שומנים בדם (בארים מלאים). העלילה מציגה את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית (n = 3). הבדלים בין ערכים הממוצעים לפעילות ATPase בנוכחות והיעדרות של שומנים בדם, והבדל בין הפעילות בDDM וגפ הם משמעותיים לp &lt;0.05.

ביטוי וטיהור של רגולטור פיברוזיס הטרנסממברני סיסטיק המוליכות (CFTR) Heterologous אתגרים משמעותיים וגורמים מגבילים בפיתוח הטיפולים תרופתיים לסיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לבידוד של כמויות מיליגרם של CFTR מתאימות ללימודים תפקודיים ומבניים.

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד כמויות גדולות של חלבון CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) תפקודי. הדבר מושג תחילה על ידי ביטוי יתר (overexpression) הטרולוגי של חלבון ה-CFTR של תרנגולות ב-Charmy visi. השלב השני הוא פירוק תאי השמרים ובדילת פראקציית מיקרוסומים שנצברה.בשלב הבא, CFTR מומס ומסורנן. השלב הסופי הוא מדידת קצב ההידרוליזה של TP על ידי החלבון המסורנן, כדי להעריך אם הוא נותר תפקודי. בסופו של דבר, ביטוי יתר ב-s visi מאפשר ייצור של CFTR טהור מאוד ותפקודי בכמויות של מיליגרמים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי בתרביות תאים של יונקים, הוא ששמרים קלים, מהירים וכלכליים לגידול במעבדה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום של סיסטיק פיברוזיס, כיוון שניתן להשתמש בחלבון המומצא כדי לחקור אינטראקציות בין תרופות הנמצאות כעת בפיתוח לבין חלבון ה-CFTR, או אף כדי לחפש תרופות חדשות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טיהור של CFTR וניתן להחילה גם על חלבוני ממברנה אחרים שקשה לבטא ולטהר.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקושי כיוון ש-CFTR עובר פירוק מהיר על ידי אנזימים פרוטאוליטיים בשמרים ונוטה להצטבר באגרגטים בתמיסה. בפרוטוקול זה, CFTR מעוף יטוהר מדגימה קפואה של תאי S SEI. ההליכים לגידול ולאסף של תאי S SEI המבטאים CFTR הוצגו במאמר קודם של JoVE.מיקרוזומים מבודדים מתאי שמרים כפי שמתואר בכתב היד הנלווה, ולאחר מכן מושעים מחדש בנפח מינימלי של בין 5 ל-15 מיליליטר של CFTR buffer. ניתן להשתמש במבחן בראדפורד (Bradford assay) כדי לקבוע את הכמות הכוללת של חלבוני המיקרוזומים, אשר צריכה להיות בין 70 ל-200 מיליגרם, וספקטרום פליטת הפלואורסצנציה של הממברנות צריך להראות שיא פלואורסצנציית GFP ברור. שני דטרגנטים מנוגדים ישמשו להמסה ולטיהור של C-F-T-R: דטרגנט לא-יוני DDM ודטרגנט יוני LPG 14.הכינו מראש את התמיסות הרלוונטיות בהתאם לפרוטוקול המופיע במאמר כדי להמיס את הממברנות. דללו את המיקרוסומים בנפח שווה של תמיססת ההמסה המתאימה, כך שריכוז הדטרגנט הסופי יהיה 2% וריכוז החלבון המיקרוסומלי יהיה חמישה מיליגרמים למילליליטר. דגרו תערובת זו למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב.לאחר שעה אחת, סבבו את התערובת בצנטריפוגה ב-100,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 45 דקות. הסירו ושמרו את הנוזל העליון (supernatant) המכיל את חלבוני הממברנה המומסים.שחזר את הפракציה הבל פסולה בתמיסת 1% SDS לנפח השווה לנפח הפракציה המסיסה. מדוד את הפלואורסצנציה בפракציה זו ושמור מניה של 50 µL לצורך אנליזת SDS page. כדי להתחיל את הליך טיהור האפיניות לניקל של CFTR, חבר סביב חמש עמודי nickel Spheros של 5 mL בטור, ושטוף בשני נפחי עמודה או CV של 20% ethanol, ולאחר מכן בשני CV של מים מזוקקים ודה-יוניים. לאחר מכן, שטוף בשני CV של באפר המסה המכיל 1 M MiaSole, ולאחר מכן בשני CV של באפר המסה ללא midsole.הוסיפו MiaSole עד לריכוז סופי של 5 millimolar לחומר המומס, והעבירו את החומר ללולאת דגימה של מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטי לאחר שתי שטיפות עם בופר ללא ole. כדי להסיר חומר שאינו קשור, שטפו את העמודה עם שלושה CV של בופר טיהור עם 40 millimolar ole בקצב זרימה של 1 milliliter לדקה. אספו פראקציה זו לשפופרת של 50 milliliter.עבור השטיפה השנייה, השתמשו בשלושה נפחי עמודה (CV) של בופר טיהור עם 100 millimolar ole. אספו פראקציות של שני מיליליטר לתוך פלטה בעלת 96 בארות. אלוטו את CFTR מעמודת ה-hiss trap באמצעות שלושה נפחי עמודה (CV) של בופר טיהור עם 400 millimolar ole. אספו פראקציות של שני מיליליטר לתוך פלטה בעלת 96 בארות, עקבו אחר הפלואורסצנציה בפראקציות שאלוטו ושמרו מנות (aliquots) מהפראקציות של שיא הריכוז.עבור אנליזת SDS page, יעשה שימוש בדגימות שאר הפרקציות של השיא לשלב הניקוי הבא. התחילו את הפרוצדורה על ידי שיווי עיגול של העמודה עם 1.2 CV של מים מזוקקים ודה-יוניים, ולאחר מכן עם 1.2 CV של בופר לכרומטוגרפיית חדירה של ג'ל או GPC בזמן שיווי העמודה. רכזו את הפרקציות שנוקו בניקוי זיקה לניקל בעלות הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר של GFP באמצעות פילטר צנטריפוגלי עם סף הפרדה של 100,000 kilodalton בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.במידה ומבצעים טיהור ב-DDM, יש להימנע מרכזו של הדגימה מעל ריכוז חלבון של 0.3 milligrams per milliliter, שכן הדבר יגרום לאובדן משמעותי של הדגימה. העבירו את ה-RENATE מהמרכזים למבחנות צנטריפוגה וסובבו ב-100, 000 times G למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius כדי לשקיע חלקיקים גדולים. הזרימו דגימה זו אל העמודה לאחר שיווי משקל ובצעו אלוציה באמצעות גרדיאנט איזוסוקרטי של 1.2 CV של בופר GPC.אספו פרקציות של 0.5 מיליליטר. מדדו פלואורסצנציית GFP כדי לזהות את הפרקציות המכילות CFTR. שמרו נפח קטן מכל פרקציה לצורך ניתוח באמצעות SDS page כדי לאשש את נוכחות ה-CFTR.הוסיפו ליפידים ל-CFTR המpurified. הוסיפו יחס של 100 ליפידים למולקולת חלבון אחת. באופן דומה, הכינו ביקורת של ליפידים בלבד.החלפת החלבון המpurified בנפח זהה של בופר GPC. דגירה של שתי הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, הסרת הדטרגנט מתערובת החלבון והליפידים באמצעות כדוריות סופגות הידרופוביות.השתמשו ב-200 milligrams של חרוזי ספיחה שנשטפו מראש לכל מילילטר של חלבון מומהן, והדגירו בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך לילה עם ערבוב עדין; למחרת, אספו את דגימת השחזור מהחרוזי הסופחים לשפופרת נקייה באמצעות טיפ פיפטה בעל קצה דק. פעילות ה-APAs ספציפית של ה-CFTR המשוחזר נמדדת באמצעות בדיקת Chile משופרת בפורמט של פלטה בעלת 96 בארות; כסטנדרטים השתמשו ב-0 עד 20 nanomoles של סודיום פוספט המדולל בתערובת של יחס אחד-לאחד של בופר CFTR ובופר APAs. הדגירו הן את ה-CFTR המשוחזר והן ליפוזומים ריקים עם מעכבי APAs בריכוז של 1 עד 100 על קרח למשך 10 דקות.השתמשו בלפחות 5 µg של CFTR שחודש. העבירו את הדגימות לפלטת 96 בארות והוסיפו TP לריכוז סופי של 2 mM. דגרו בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת. לאחר שעה, עצרו את התגובה על ידי הוספת 40 µL של 10% SDS לכל בארה.לאחר מכן, הוסף 100 µL של בופר A לכל באר והדגר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 µL של בופר B לכל באר ומדוד את הבליעה באורך גל של 800 nm באמצעות ספקטרופוטומטר UV vis התואם לפלטה בעלת 96 בארות. העבר את נתוני הבליעה לטבלה חדשה.המירו את הבליעה ב-800 nanometers לכמות של פוספט ששוחרר באמצעות תקני הפוספט, וחשבו את קצב הידרוליזת ה-TP לפי השלבים המוצגים. הפרוטוקול המודגם בסרטון זה הוא אמצעי יעיל לבידוד מיקרוסומים עשירים ב-CFTR, עם התאוששות כמעט מלאה של CFTR במהלך שבירת התאים והכנת המיקרוסומים הגולמיים. תמונה זו של ג'ל SDS page מראה רמות של CFTR מעוף שננטרו באמצעות פלואורסצנציית Ingel של תג GFP במהלך שלבי צנטריפוגה שונים ששימשו לבידוד ושטיפה של המיקרוסומים.CL מציין ליזאט של תאים, S מציין עליליים ו-P מציין משקעים. העלילו לאחר פירוק התאים וסנטריפוגציה במהירות של 14,000 ×g מכיל כמעט את כל ה-CFTR, כולל תוצרי פירוק; אולטרסנטריפוגציה במהירות של 200,000 ×g משקיעה את כל ה-CFTR באורכו המלא, ומותירה חלק מהfragment-ים בעלילו; אולטרסנטריפוגציה במהירות של 100,000 ×g של מיקרוסומות שטיפות מלח מייצרת משקעים.כמעט כל ה-CFTR עם הסרה נוספת של חלק מהמקטעים, טיהור של CFTR מעוף ב-LPG 14 באמצעות כרומטוגרפיית ספיחת יוני מתכת מאומתרים הניב 80 מיקרוגרם של חלבון לליטר של תרבית בדרגת טוהר של מעל 90%. הפאנל העליון מציג פראקציות שנותחו ב-SDS page, ולאחריהן צביעת kumasi. הפאנל התחתון מציג את אותן פראקציות שזוהו באמצעות פלואורסצנציה של תג ה-GFP.התנובה הגבוהה נבעה מההמסה יעילה של CFTR על ידי LPG 14, כפי שניתן לראות מההשוואה בין נתיב שתיים שנטען עם מיקרוזומים המומסים ב-LPG, לבין נתיב ארבע שנטען עם חומר בלתי מומס. בנוסף, קישור יעיל והדוק לעמודה הוביל לאובדן מינימלי של CFTR בחלק הבלתי קשור המוצג בנתיב שלוש, ולהיעדרות CFTR במנורות השטיפה המיוצגות בנתיבים חמש ושש. לחלבון שהופק הייתה טוהר של למעלה מ-90%, כפי שהוערך באמצעות ג'לים של SDS page שצבעו kumasi ובאמצעות ציטומטריה של רצועות ה-CFTR והמזהמים.טיהור של CFTR מעוף. ב-DDM באמצעות כרומטוגרפיית ספיחה של יוני מתכת מקובעים הניב כ-50 מיקרוגרם של חלבון לליטר תרבית ברמת טיהור של כ-60%. איור זה מציג את הפראקציות שנותחו ב-SDS page ולאחריו צביעת קומאסי, כאשר הפראקציות לפני האלוציה מופיעות משמאל ומספר פראקציות EEU רצופות מופיעות מימין.ה-CFTR מסומן על ידי החץ בהמשך. הפרקציות מועשרות בזיהום של 40 kilodalton, שזוהה באמצעות ספקטרומטריית מסות כחלבון ריבוסומלי L3. ה-CFTR של תרנגולת שזוהה ב-LPG 14 או ב-DDM באמצעות כרומטוגרפיית ספיחה של יוני מתכת מאולתרים (IMAC), טוהל באופן נוסף באמצעות כרומטוגרפיית חדירה של ג'ל.פרופיל האלוציה עבור CFTR ששוטף בבופר המכיל LPG 14 מוצג על ידי הקו הרצוף. בעוד שפרופיל האלוציה עבור CFTR ששוטף בבופר המכיל DDM מוצג על ידי הקו המקוקו, SDS page גילתה כי CFTR ששוטף ב-LPG, המסומן על ידי החץ בין 8 ל-11 מיליליטר, כרומטוגרפיית הרשמה של ג'ל הפרידה גם היא הפרידה את CFTR ששוטף ב-LPG מזיהומים בעלי משקל מולקולרי נמוך. לבסוף, נמדדה פעילות ה-APAs של החלבונים המשוטפים.התוצאות מעידות כי החלבון המופרש לא היה מסוגל להמיס את A TP במצב מומס ב-LPG, והראה פעילות APAs חלשה בנוכחות DDM לאחר הוספת ליפידים והסרת הדטרגנט. פעילות ה-APAs הייתה גבוהה פי ארבעה עבור דגימות שופרו ב-DDM, 13 MATP לדקה למיליגרם חלבון. הוספת ליפידים והסרת LPG השחזירה באופן דומה את הפעילות של CFTR שבודד באמצעות LPG, אך בקצב סופי נמוך יותר מאשר החומר שופר והורכב מחדש ב-DDM, 1.5 MLEs A TP לדקה למיליגרם חלבון לאחר השליטה בתהליך.ניתן להשלים טכניקה זו ביומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את הדגימות על קרח בכל עת לאחר שלב זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון יציבות תרמית, מיקרוסקופיה אלקטרונית ופיזור קרני X בזווית קטנה, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע למבנה וליציבות של החלבון.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא ולטהר כמויות גדולות של חלבון CFTR.

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR)...

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות...

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

למדו טיהור חלבון CFTR טרנסממברני מ-Saccharomyces cerevisiae לחקירת ציסטיק פיברוזיס. שיטה זו מאפשרת בידוד כמויות מיליגרם של חלבון פעיל לפיתוח תרופות ומחקר מבני.

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב

גלה סרטונים נוספים