Name: ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למדו ניטור juxtacellular של נוירונים בודדים במבנים תת-קליפתיים במוח ער של חולדות מרוסן ראש. שיטה זו מאפשרת בידוד חד-משמעי של פעילות ספייקים ולוקליזציה אנטומית מדויקת באמצעות צבע Chicago Sky blue.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה למכונים הקנדיים לחקר הבריאות (מענק MT-5877), למכונים הלאומיים לבריאות (מענקים NS058668 ו-NS066664) ולקרן הדו-לאומית ארה"ב-ישראל (מענק 2003222) על מימון מחקרים אלה.

<ol><li>Fee, M. S., Leonardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+motorized+microdrive+and+commutator+system+for+chronic+neural+recording+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).</li>
<li>Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-miniature+headstage+with+6-channel+drive+and+vacuum-assisted+micro-wire+implantation+for+chronic+recording+from+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).</li>
<li>Szuts, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+multi-channel+neural+amplifier+for+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals.</a> Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).</li>
<li>Roy, S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multi-channel+single+unit+recording+in+freely+moving+and+vocalizing+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates.</a> Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+metrics+to+accompany+spike+sorting+of+extracellular+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).</li>
<li>Person, A. L., Perkel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pallidal+neuron+activity+increases+during+sensory+relay+through+thalamus+in+a+songbird+circuit+essential+for+learning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning.</a> The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).</li>
<li>Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 10481061(2010).</li>
<li>Hellon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marking+of+electrode+tip+positions+in+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The marking of electrode tip positions in nervous tissue.</a> The Journal of physiology. 214, 12P(1971).</li>
<li>Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+distribution+of+thalamocortical+boutons+in+barrels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (1986).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+vibrissa+motion+and+touch+are+differentially+represented+throughout+ventral+posterior+medial+thalamus+in+awake%2C+head-fixed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Annual+Meeting.+41+496.08%2FTT424+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats.</a> Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).</li>
<li>Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisking+in+air%3A+Encoding+of+kinematics+by+VPM+neurons+in+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+and+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats.</a> Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).</li>
<li>Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+reports+efferent+control+of+vibrissa+position+on+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales.</a> Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).</li>
<li>Moore, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+orofacial+rhythms+revealed+through+whisking+and+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing.</a> Nature. 497, 205-210 (2013).</li>
<li>Duque, A., Zaborszky, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuque%2C+A+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+3%22">Neuroanatomical Tract-Tracing 3</a>. , Springer. 197-236 (2006).</li>
<li>Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fsubstances.html">http://kationscientific.com/fsubstances.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fdyes.html">http://kationscientific.com/fdyes.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Urbain, N., Deschênes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroactive+substances%3A+Neuropharmacology+by+microiontophoresis.+%28Kation+Scientific%29%2C+Dyes+and+Tracers%3A+Sitemarking+and+tracktracing+by+microiontophoresis.+%28Kation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation).</a> Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בנייה לנענע הניסיוני התיאור של החלקים מכאניים המשמשים לבנייה לנענע הניסוי (איור 4) מושמט מן הפרוטוקול, כפי שהוא יכול להיות בנוי במגוון דרכים. בהפגנה זו סטנדרטית אופטו-מכאני חלקים ומהדק תמיכה משמש להר בר משענת הראש וצינור איפוק גוף (ראה סעיף חומרים). חלקי אופטו-מכאני דומים יכולים לשמש לעלות בעל אלקטרודה לmicromanipulator הממונע. חשוב שבר משענת הראש ב...

ניטור פעילות עצבית בבעלי חיים ערניים המעורבים באופן פעיל במשימה התנהגותית הוא קריטי להבנת התפקוד והארגון של מערכת העצבים. הקלטה תאית של הפעילות החשמלית מיחידות עצביות אחת כבר זמן רב כלי עיקרי של מדעי מוח ומערכות עדיין נרחב בשימוש כיום. מגוון רחב של סוגי אלקטרודה ותצורות זמינים בהתאם לדרישות המדעיות וטכניות של ניסוי מסוים. כרוני מושתל microdrives או מערכי אלקטרודה משמשים לעתים קרובות בבעלי חיים לנוע בחופשיות, כוללים ציפורים, מכרסמים, ופרימטים שאינם בני אדם 1-4. לחלופין, חדירות חריפות עם microelectrodes מתכת או זכוכית באמצעות micromanipulator חיצוני משמשות לעתים קרובות כדי להקליט מבעלי חיים מורדמים או-מרוסן ראש. יש לי אלקטרודות micropipette זכוכית היתרון שהם יכולים לשמש בjuxtacellular או &quot;תא מצורף&quot; תצורה לבודד באופן חד משמעיפעילות של נוירונים בודדים ללא סיבוכים של ספייק פוסט הוק-מיון 5. אלקטרודות אלה נוספים מאפשרות הקלטה מהתאים או במקומות אנטומית-מזוהים, כפי שהם יכולים להשתמש בהם כדי להזריק פיקדונות קטנים של קליעים נותבים צבע או neuroanatomical, או אפילו כדי למלא את הפרט נרשם תא. תצורה זו יושמה בהצלחה בחולדות, עכברים וציפורים 6-10. הטכניקה המתוארת כיום מתמקדת בניטור juxtacellular ופיקדונות צבע תאיים בכוננות, חולדות-מרוסן ראש. שים לב שתא בודד בניגוד juxtacellular ממלא, פיקדונות צבע אלה אינם מספקים מידע על מורפולוגיה של תאים או תחזיות axonal 11, אבל הם מאפשרים לוקליזציה אנטומי מדויקת לכ -50 מיקרומטר ו, ביקורתי, בעלי תשואה גבוהה באופן משמעותי בבעלי חיים ערניים. מידע בדבר תא בודד juxtacellular ממלא מסופק בכל זאת כאסטרטגיה חלופית לתיוג אנטומיים. בקיצור,פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. בשלב הראשון, החולדה התאקלמה לריסון גוף בגרב בד (איור 1) על פני תקופה של 6 ימים. בשלב השני, מנגנון משענת ראש (איור 2) ותא הקלטה מושתל בניתוח כזה שהחולדה יכולה להישמר במטוס stereotaxic במהלך פגישות מרובות שלאחר מכן הקלטה (איור 3); הליך זה מאפשר הנסיין למקד אזורים תת-קליפת המוח מסוימים של המוח למחקר אלקטרו מבוסס על התייחסות סטנדרטית קואורדינטות 12. השלב השלישי כולל הצבת העכברוש בלנענע מתאים לביצוע ניסויים התנהגותיים ואלקטרו (איור 4), בניית האלקטרודה מצינור נימי קוורץ (איור 5), מה שהופך את הקלטות עצביות juxtacellular שבאופן חד משמעי לבודד יחידות בודדות 6-9, ו סימון locati אנטומייםבאתר ההקלטה עם צבע שיקגו סקיי בלו (איורים 6 ו -7). ההקלטות מבוצעות עם ניטור התנהגות בו-זמנית; עם זאת, לפרטים הטכניים של ההתנהגות יהיו תלויים במטרות המדעיות של כל ניסוי ולכן הם מעבר להיקף של פרוטוקול יחיד. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, שניתן לחזור על ימים מרובים, החיה מורדמים. המוח מופק ומעובד על פי טכניקות neuroanatomical סטנדרטיים או באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

<table><tbody><tr><td>קטסט (קטמין HCl)</td> <td>פורט דודג</td>' <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (תמיסת קסילזין)</td> <td>מעבדות לויד</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (פובידון-יוד)</td> <td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp ציאנואקרילט</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>מלט אחיזה אבקה</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>לבסיס תא ההקלטה</td></tr><tr><td>Grip צמנט נוזל</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>לבסיס תא ההקלטה</td></tr><tr><td>ג'ל סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet Denture Repair Acrylic Powder</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>לאבטחת מנגנון משענת הראש לגולגולת</td></tr><tr><td>Ortho-Jet נוזל שרף אקרילי אורתודונטי מהיר ריפוי</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N / A</td><td>לאבטחת מנגנון משענת הראש לגולגולת</td></tr><tr><td>שיקגו כחול שמיים</td><td>סיגמא</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>לזלוף וקיבוע רקמות</td></tr><tr><td>מלח חוצץ פוספט</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>לזלוף וקיבוע רקמות</td></tr><tr><td>ציטוכרום C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>לצביעה ציטוכרום-אוקסידאז, <חזק>איור 7</חזק></td></tr><tr><td>דיאמינובנזידין</td><td>סיגמא</td><td>D5905</td><td>לצביעה ציטוכרום-אוקסידאז, <חזק>איור 7</חזק></td></tr><tr><td>גרב עכברוש</td><td>לתפור אלגנטי (סן דייגו, קליפורניה)</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, <חזק>דמויות 1, 4</חזק></td></tr><tr><td>צינור PVC 2 &frac12; "</td><td>חברת הפלסטיק האמריקאית</td><td>34108</td><td><חזק>איור 4</חזק></td></tr> <tr><td>תת-זעירים D פינים ושקעים</td> TE <td>Connectivity 205089-1</td><td></td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>חוט מוסיקה נירוסטה בקוטר 0.010 אינץ'</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>מסגרת אחיזה סטריאוטקסית</td><td>Kopf</td><td>Instruments דגם 900</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr>מוטות <tr><td>אוזניים סטריאוטקסיים</td><td>Kopf</td><td>Instruments דגם 957</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>מניפולטור סטריאוטקסי</td><td>Kopf Instruments</td><td>דגם 960</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>&frac12; מקדחה מ"מ הנרי</td><td>שיין</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה דנטלית באוויר שקט</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>נירוסטה 0-80 ו-frac18; &rdquo; בורג</td><td>אטב סופרמרקט</td><td>247438</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-407-8A</td><td><חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>מותאם אישית מוט מחזיק ראש</td><td>UCSD SIO חנות מכונות</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, <חזק>דמויות 2 - 4</חזק></td></tr><tr><td>צלחת אחיזת ראש מותאמת אישית</td><td>UCSD SIO חנות מכונות</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, <חזק>איורים 2 - 4</חזק>חזק</td></tr> <tr><td>בזווית ישרה</td><td>ניופורט</td><td>MCA-1</td><td><חזק>איורים 3, 4</חזק>; חלקים אופטו-מכניים סטנדרטיים עבור הג'יג הניסיוני (<חזק>איור 4</חזק>) הם גם מחברת Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 ו-frac34; &rdquo; בורג</td><td>אטב סופרסטור</td><td>240181</td><td>לריסון ראש, <חזק>איור 3</חזק></td></tr><tr><td>4-40 ו-frac14; &rdquo; בורג</td><td>אטב סופרסטור</td><td>239958</td><td>למשענת ראש, <חזק>דמויות 3, 4</חזק></td></tr><tr><td>קוורץ צינורות נימיים</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td><חזק>איור 5</חזק></td></tr><tr><td>פחמן דו חמצני חולץ לייזר פחמן דו חמצני</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ממונע</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מיקרואלקטרודה</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td>חלק חלופי: התקנים מולקולריים Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>מגבר מיקרואלקטרודה שלב ראש</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>CV-7B</td><td>חלק חלופי: HS-9Ax10 עם התקנים מולקולריים Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>ממריץ דופק מבודד</td><td>A-M Systems</td><td>דגם 2100</td><td>חלק חלופי: HS-9Ax10 עם התקנים מולקולריים Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>צג שמע</td><td>רדיו שאק</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פיפטות</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>חלקים חלופיים: ראה <חזק>דיון</חזק>, <חזק>איור 6A</חוט</td></tr> <tr><td>עופרת אלקטרודה</td><td>חזק> NEF34-1646</td> <td>(אופציונלי), <חזק>איור 6D</חזק></td><td></td></tr><tr><td>ממסר למגבר טכנולוגיית</td><td>COTO</td> שלב ראשי<td>#2342-05-000</td><td>(אופציונלי) בשימוש עם לוח מעגלים מודפסים בהתאמה אישית (UCSD Physics Electronics Shop), <חזק>איור 6A-C</חזק</td></tr><tr><td>>מצלמת וידאו דיגיטלית</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(אופציונלי) לניטור התנהגותי, <חזק>איור 7</חזק></td></tr><tr><td>Puralube משחה וטרינרית</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור juxtacellular והלוקליזציה של single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

ישנן מגוון טכניקות לניטור פעילות חוץ-תאית של יחידות עצביות בודדות. עם זאת, ניטור פעילות זו ממבני מוח עמוקים בבעלי חיים מתנהגים נותר אתגר טכני, במיוחד אם יש למקד את המבנים באופן סטריאוטקסי. פרוטוקול זה מתאר טכניקות כירורגיות ואלקטרופיזיולוגיות נוחות השומרות על ראש החיה במישור הסטריאוטקסי ומבודדות באופן חד משמעי את פעילות הזינוק של נוירונים בודדים. הפרוטוקול משלב ריסון ראש של מכרסמים ערניים, ניטור צמוד עם אלקטרודות מיקרופיפטות והזרקת צבע יונטופורטי כדי לזהות את מיקום הנוירונים בהיסטולוגיה פוסט-הוק. בעוד שכל אחת מהטכניקות הללו מבוססת היטב בפני עצמה, הפרוטוקול מתמקד בפרטי השימוש המשולב שלהן בניסוי יחיד. טכניקות נוירופיזיולוגיות ונוירו-אנטומיות אלו משולבות עם ניטור התנהגותי. בדוגמה הנוכחית, הטכניקות המשולבות משמשות כדי לקבוע כיצד תנועות ויבריסה שנוצרות בעצמן מקודדות בפעילות של נוירונים בתוך התלמוס הסומטוסנסורי. באופן כללי יותר, זה פשוט להתאים את הפרוטוקול הזה לניטור פעילות עצבית בשילוב עם מגוון משימות התנהגותיות בחולדות, עכברים ובעלי חיים אחרים. באופן קריטי, השילוב של שיטות אלה מאפשר לנסיין לקשר ישירות בין אותות נוירופיזיולוגיים המזוהים אנטומית להתנהגות.

<html> יחידות עצביות בהמדיאלי אחורי הגחון (VPM) התלמוס לקודד את השלב של תנועת vibrissa במהלך עצמי שנוצר ומעיף 15,16. איור 7 א מציג מדגם פעילות spiking של יחידת התלמוס VPM כחולדה הנעים במהירות באופן פעיל. איור 7 מציגה היסטוגרמה של ספייק פעמים מיושרות לשלב המיידי של תנועת vibrissa 17. יש יותר קוצים בשלב ההכחשה של הנעים במהירות. לאחר ההקלטה, המיקום של היחידה שכותרתו באמצעות iontophoresis של צבע כחול השמיים שיקגו, כפי שמוצג <stron...

פרוטוקול זה מתאר תכנון והשתלה כירורגית של מנגנון ריסון ראש לניטור פעילות עצבית במבני מוח תת-קורטיקליים בחולדות ערניות. הוא מתאר נהלים לבידוד נוירונים בודדים בתצורה הסמוכה ולזיהוי יעיל של מיקומם האנטומי.

ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר ולאתר את פעילותם של נוירונים בודדים בתוך מבנים תת-קורטיקליים במוח של חולדות ערניות המקובעות בראשן. דבר זה מושג תחילה על ידי הסגרה של החולדה למצב של הגבלה פיזית בתוך גרב בד. השלב השני הוא השתלה כירורגית של מכשיר לקיבוע הראש ותא הקלטה, באופן שיאפשר לשמור על החולדה במישור הסטריאוטקסי במהלך מספר מפגשי הקלטה עוקבים.בשלב הבא, החולדה ממוקמת במתקבן מתאים לביצוע הניסויים ההתנהגותיים והאלקטרופיזיולוגיים, ומתבצעות הקלטות נוירונליות סמוכות לתא (juxtacellular). תהליך זה מאפשר בידוד חד-משמעי של יחידות בודדות. השלב האחרון הוא סימון המיקום האנטומי של אתר ההקלטה בצבע Chicago Sky blue, כדי שניתן יהיה להדמיאו בבדיקה היסטולוגית בדיעבד.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות נפוצות, כגון רישום חוץ-תאי באמצעות מיקרו-אלקטרודות מתכת, הוא שניתן לבודד פוטנציאלי פעולה (spikes) מיחידות בודדות באופן חד-משמעי, וכי ניתן לחשוף את אתר הרישום בבדיקה היסטולוגית לאחר הניסוי (post hoc). כדי להתחיל בהליך זה, הרדימו את בעל החיים באמצעות הזרקת ketamine xylazine. בדקו את רפלקס נסיגת בהונות כדי לקבוע את עומק ההרדמה, והמשיכו להחזיק את בעל החיים בהרדמה על ידי מתן נוסף של חומר ההרדמה.במידת הצורך, גלחו את הראש וחטאו את אזור הניתוח באמצעות פובידון יוד. לאחר מכן, מקמו את החולדה במסגרת קיבוע סטריאוטקסית וקבעו את ראשה בעזרת מוטות אוזניים. בצעו חתך בעזרת סכין מנתחים לאורך קו האמצע של הגולגולת, מהנקודה המרכזית שבין העיניים ועד לחלק האחורי של האוזניים.לאחר מכן, הסירו פס עור ברוחב שני עד שלושה מילימטרים משני צדי החתך. גרדו את הפריאוסטום כדי לחשוף את הגולגולת עד לרכסים הלטרליים. לאחר מכן, כסו את הגולגולת החשופה בשכבה דקה של דבק מהיר (super glue).שדרו כעת חור קטן מיד מאחור לנקודה שבה תפר ה-bgma נפגש עם הרכס הלטרלי, בזווית של 30 עד 45 מעלות לתוך הגולגולת. לאחר מכן, הבריגו בורג מכונה בעל בסיס שטוח בגודל 0-80 לחור בזווית של 30 עד 45 מעלות, והקפידו שלא להבריג עמוק מדי כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח שמתחת.חזור על הליך זה עבור שישה ברגים נוספים בתצורה זו. לאחר מכן, מרח דבק מהיר (super glue) בבסיסם של כל הברגים. כעת, מקם את מחט המזרק במניפולטור הסטריאוטקסי.צרו שקע בגולגולת באמצעות המחט כדי לסמן מיקום ייחוס מתאים. לאחר מכן, סמנו את השקע בעזרת טוש קבוע. בהמשך, בצעו קרניוטומיה (פתיחת גולגולת) במרכז הקואורדינטה הרצויה והשאירו את הקרומיים הרכים (dura mater) שלמים.כסו את הקרניוטומיה בנוזל חמצני מלאכותי משופר. לאחר מכן, גזרו מבחורת צנטריפוגה בנפח 0.2 מיליליטר כך שיהיה לה אורך של ארבעה עד חמישה מילימטרים, והסירו את המכסה. הניחו את המבחנה על הגולגולת ומרכזו אותה מעל הקרניוטומיה.לאחר מכן, מרחו מליט דנטלי מסביב לתחתית הפחית כדי לאטום את בסיס הפחית לגולגולת. היזהרו שלא לדליף מליט אל תוך פתח הקרניוטומיה החשוף. כעת, קדחו חור קטן נוסף בלוחית הגולגולת הנגדית.הכנס בזהירות את תיל הייחוס שהולחת למחבר פין. לאחר מכן, מרח דבק מהיר על החור שבו הוכנס התיל כדי לקבע את הפין והתיל במקומם. לאחר מכן, ערבב את שני חלקי ערכת ג'ל הסיליקון בכמויות שוואות.המתינו שתי דקות ומלאו את מבחנת הצנטריפוגה בג'ל. כאשר המבחנה מלאה בערך לשליש, חברו את לוחית הראש לסורג ריסון הראש. במקרה זה, הסורג חובּר למחבט זווית ישרה בזווית נטייה של 45 מעלות.לאחר מכן, חברו את מוט התמיכה לזרוע המניפולטור של הסטריאוטקסיס באמצעות תסמיך העמוד, כך שהמוט יהיה מקבילי למוטות האוזניים; הורידו את המוט ואת הפלטה כך שהפלטה תהיה אחורית לתפר הלמבדה (lambda suture) וקדמית לברג ה-coddle mos. לאחר מכן, אחזו בבורג הראש הקדמי בזווית של כ-45 מעלות באמצעות תסמיך, כך שראש הבורג פונה כלפי מטה וכלפי זנב החיה. לאחר מכן, הורידו את הבורג עד למגע עם הגולגולת.בשלב הבא, קבעו את הבורג ואת הפלטה במקומם באמצעות אקריליק דנטלי. מרחו שכבה של צמנט דנטלי מסביב לקצוות האקריליק הדנטלי כדי להדביק את העור למשתב. לאחר שהצמנט התייבש, השקיעו מספר חורים במכסה של מבחנה הצנטריפוגה והניחו את המכסה על המבחנה.כעת הסר את התפסן. הסר בזהירות את מוט קיבוע הראש מהסטריאוטקס. לאחר מכן, הסר את לוח הראש מהמוט.בסיום, הוצא את בעל החיים מהסטריאוטקס (stereo attacks) והענק טיפול ומעקב לאחר הניתוח. בהליך זה, השתמש בפיפטה עם צינור קוורץ קפילרי על מיקרו-פיפטה של לייזר פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, קבע את הפיפטה במקומה תחת מיקרוסקופ בבקרת הפרעה דיפרנציאלית (DIC) המצויד בעדשה בעלת מרחק עבודה ארוך.הזז לאט בלוק זכוכית אל שדה הראייה באמצעות קצה פיפטה. בעזרת המיקרו-מניפולטור של הבמה, שבור את קצה הפיפטה על ידי נגיעה עדינה בזכוכית. חזור על הפעולה עד שקצה הפיפטה.הקוטר החיצוני הוא בין מיקרומטר אחד לשלושה. לאחר מכן, הכין את התמיס המלח החוץ-תאי והוסף 2% Chicago sky blue. באמצעות מזרק עם מחט בדרגה 30, מלא את הקצה האחורי של הפיפטה בתמיסה.לאחר מכן, הכניסו את החולדה לגרב הבד והעבירו את גרב הבד לתוך צינור קשיח על גבי מתקן ניסוי מתאים. חברו את לוחית קיבוע הראש של החולדה לחלק התואם במתקן. לאחר מכן, הצמידו אום 8 32 לבורג קיבוע הראש המושתל בחולדה.לאחר מכן, הברג מוט פלדה אל חורג הברגה של בורג הראש. לאחר מכן, פתח את תא ההקלטה והסר את ג'ל הסיליקון. נקה את פתח הקרניאוטומי באמצעות פינצטה עדינה.אם רקמה צמחה מחדש באזור הקרניאוטומיה, השתמשו בהרדמה ב-iso fluorine במהלך תהליך זה במידת הצורך. לאחר מכן, חברו את הפפיטה למיקרו-מניפולטור המוטורי. הזריזו את הפפיטה למיקום ההקלטה הרצוי בצירים הקדמי, האחורי והמדיאלי-לטרלי.לאחר מכן, הקידו את הפיפטה ונטראלית דרך הקשיחה (dura) עד שתגיע למרחק של כ-500 מיקרומטרים דורסלית למיקום ההקלטה המיועד. הקידו את הפיפטה באיטיות תוך הקשבה לאירועי פריקה (spiking events) במסך שמע של המתח המוגבר שהוקלט. לאחר זיהוי אירועי הפריקה, המשיכו להזיז את הפיפטה בטווח של 0 עד 100 מיקרומטרים עד שהסטיות החיוביות במתח יעלו על כ-500 מיקרו-וולט.כדי לסמן את אתר ההקלטה, הגדירו את מקור הזרם ל-4- µA עם פולסים של שתי שניות במחזור עבודה של 50%, והעבירו את הזרם למשך ארבע דקות לאיונופור, והזריקו צבע Chicago sky blue דרך הפפית. לאחר הניסוי, בצעו פרפוזיה לבעל החיים לפי הפרוטוקול הסטנדרטי. לאחר מכן, בצעו חיתוך של המוח וצביעה נגדית לפי הצורך כדי לזהות את המיקום האנטומי של אתר ההקלטה המוצג.כאן מוצגת פעילות ה-spiking של יחידה תלמית ב-VPM בזמן שחולדה מבצעת תנועות שפם (whisking) פעילות. כאן מוצגת היסטוגרמה של זמני ה-spikes מסונכרנת לשלב המיידי של תנועת ה-Vibra. קיימים יותר spikes במהלך שלב ההסגה (retraction) של תנועת השפם.לאחר ההקלטה, מיקומה של יחידה זו סומן באמצעות אפורזה (aphoresis) של צבע Chicago sky blue. כפי שמוצג כאן, הרקמה נצבעה בצביעת נגד עבור פעילות של cytochrome oxidase כדי לחשוף את הגבולות הנוירו-אנטומיים של ה-VPM thalamus. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבצע טכניקות כירורגיות ואלקטרופיזיולוגיות השומרות על ראש החיה במישור הסטריאוטקסי, ומבודדות באופן חד-משמעי את פעילות הפריקה (spiking activity) של נוירונים בודדים.

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ניטור של רמות הנוירוטרנסמיטר תאי מוח באזורים שונים של בעלי חיים באופן חופשי לנוע מציע תובנות על הקשר בין שחרור הנוירוטרנסמיטר והתנהגות. בשנת vivo microdialysis יחד עם זיהוי אלקטרוכימי מספק אנטומי מעולה ברזולוציה כימיים ומידע איך עצבית הבסיס משתנה על ידי מניפולציות תרופתי או פיזיולוגי.

כירורגיה Stereotaxic לשרוד במכרסמים

הקלטות תאיים של הפעילות העצבית באמצעות בדיקות סיליקון החולדה הרדים יתוארו. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע על אזורי מוח מרובים יותר מ 100 נוירונים בו זמנית. הוא מספק מידע עם רזולוציה של תא בודד על הדינמיקה בתוך מעגלים עצביים הרכבים מקומיים רבים.

הקלטה בקנה מידה גדול הרכבים העצבית עם בדיקות הסיליקון ב עכברוש הרדים

סרטון זה מדגים את ההליך המפורט להכנת חולדה מורדמת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מוחית מאתרים מרובים. הקרקפת מנותחת כדי לגשת לגולגולת, וחורים נקדחים במקומות מדויקים כדי להתקין ולאבטח אלקטרודות. אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן מוכנסות לאחר מכן למיקום היעד כדי להקליט את הנתונים.

In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

מקור: Moore, J. D., et al.  ניטור ולוקליזציה של נוירונים בודדים בתוך מבני מוח תת-קורטיקליים של חולדות ערניות ומרוסנות ראש. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השיטה של רישום וצביעה בחולדה מאופקת וערה ההליך כולל הקלטת אותות מנוירונים והזרקת צבע כדי למקם במדויק את אתר ההקלטה. טכניקה זו מאפשרת מיפוי מדויק של הפעילות העצבית למבנה האנטומי של המוח.

רישום וצביעה צמודים למיפוי מדויק של פעילות עצבית בחולדה ערה 

מקור: Lai, J., et al. רישום אלקטרופיזיולוגי בו זמנית ומיקרו-הזרקות של חומרים מעכבים במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת מיקרו-הזרקה להקלטה ועיכוב עצביים בו זמנית בקוליקולוס העליון של החולדה. ההליך כולל מיקוד סטריאוטקסי, קידוח גולגולת והחדרת מזרק, המספק נוירוטרנסמיטר מעכב תוך רישום פעילות עצבית. גירוי אור מעורר פוטנציאל פעולה, בעוד שמיקרו-הזרקת סמים מדכאת את הריגוש העצבי. ככל שרמות המוליכים העצביים יורדות, הפעילות העצבית חוזרת לנקודת ההתחלה, ומאפשרת לחקור הן את העיכוב...

עיכוב פעילות עצבית ואיתור שלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בחולדה

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

שיטה זו יוצרת סביבה מוחשית, מוכרת לעכבר כדי לנווט ולחקור במהלך הקלטות מיקרוסקופיות הדמיה או תא בודד אלקטרו, אשר דורשות קיבוע איתן של ראשו של בעל החיים.

פלטפורמה הרימה-Air-מרוצף שטוחה: שיטה חדשה לשילוב עם התנהגות מיקרוסקופית או אלקטרופיזיולוגיה על Awake לנוע בחופשיות מכרסמים

במחקר זה, מתודולוגיה מוצג על איך לבצע באתר מרובה in vivo הקלטות אלקטרו מכיון hyperdirect תחת הרדמה urethane.

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

אזורים חושיים ראשוניים בניאוקורטקס מפגינים פעילויות ספונטניות ייחודיות במהלך ההתפתחות. מאמר זה מתאר כיצד לדמיין פעילויות נוירונים בודדות ואזורי חישה ראשוניים כדי לנתח פעילויות סינכרוניות ספציפיות לאזור בעכברים ילודים in vivo.

בהדמיה של פעילות ספונטנית בקליפת המוח החושית של עכבר יילודים ברזולוציה של נוירון יחיד

למדו ניטור juxtacellular של נוירונים בודדים במבנים תת-קליפתיים במוח ער של חולדות מרוסן ראש. שיטה זו מאפשרת בידוד חד-משמעי של פעילות ספייקים ולוקליזציה אנטומית מדויקת באמצעות צבע Chicago Sky blue.

ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

גלה סרטונים נוספים