Name: שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למדו שיטה בעלות נמוכה לניתוח התנהגות תנועה ופעילות פרכוסים בדרוזופילה melanogaster באמצעות מצלמת רשת ותוכנות ניתוח. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות שינויים בהתנהגות הנגרמים על ידי שינויים גנטיים וטיפולים פרמקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים גם מבקשים להביע תודה לקריס מבער, סטיבן מקיני, לורה טובין, ג&#39;ני Gilbreath, אשלי Olley, מייגן הופר, ומייגן הייד עבור עבודתם בכוונון עדין assay זה.

1. הכנת פרט זבובים עבור assay נידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים בעדינות על ידי הקשה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת דקות 20-30 באין מפריע לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הזבוב מתוך הבקבוקון ולמקם את הזבובים בודדים תחת כיסוי צלחת בקוטר 5 סנטימטר פטרי (5 מ&quot;מ גבוה) עם חריצים קטנים כדי לאפשר מעבר אוויר. להאיר מלמטה ולבחון את הזבובים באמצעות מצלמת רשת מותקנת מעל צלחת פטרי. </li></ol> 2. הכנת פרט זבובים עבור assay תפיסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זבובי תפיסה ישנים יומיים רגישים או מדיה שמרים / קמח תירס / אגר סטנדרטית או מדיה סטנדרטית מעורבת ישירות עם תרופה. הנתונים שהוצגו כאן, זבובים הואכלו גם ללכת 1ו תקשורת סטנדרטית או 1 גרם של תקשורת סטנדרטית מעורבבת עם 25 מ&quot;ג של מטפורמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הזבובים האכילו במשך יומיים בתקשורת או מדיה בתוספת תרופה, להעביר אותם על ידי הקשה עדינה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת באין מפריע במשך 20 דקות לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקונים בודדים ורטקס המכילים זבוב אחד על vortexer מעבדה שימוש בהגדרה הגבוהה ביותר עבור 10 שניות. הנח את הזבוב משותק על לבן גיליון נייר ריק ישירות מתחת מצלמות מותקנים מעל הנייר. </li></ol> 3. הקלטת וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התנועה או צד&quot;ל באמצעות תוכנת HandyAvi <a href="http://www.azcendant.com/download.htm">http://www.azcendant.com/download.htm.</a> תכנית זו משתמשת במצלמת האינטרנט כדיללכוד תמונות המבוססות על הגדרות המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות הזמן לשגות תמונות תחת הלשונית לכידת, כאשר החלון נפתח, בחר את מצלמת האינטרנט כהתקן הלכידה. עבור רוב ניסויי גודל מסגרת וידאו של 640 480 הוא נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אינטל IYUV codec לדחיסה ולבחור 0.1 שניות / מסגרת עבור assay התפיסה או לבחור 0.1-0.5 שניות / מסגרת עבור assay התנועה. בכרטיסייה המתקדמת, בחר ליצור. קובץ תמונת bmp עבור כל לכידה ובחר תיקייה לתכנית כדי לאחסן את התמונות שזה לוקח (ערימת התמונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זבוב מת על דף נייר. לחץ על תיבת הגדרות וידאו ולהתאים את ההגדרות תחת לשונית הגדרות התקן, כך שיש רקע לבן בוהק וניגוד ברור עם הזבוב הכהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור התחל כדי להתחיל את ההקלטה. לאחר תקופת ההקלטה סיימה, לחץ על כפתור העצירה. ערימת התמונה צריכה להיות עכשיו בתיקייה שנבחרה. הערה: לפני ההקלטה, להבטיח כי תחשיב היחסיםדר נבחר לערימת התמונה ריק. </li></ol> 4. ניתוח נתונים באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ של NIH הפתוח תמונה בחינם תוכנה לעיבוד, שניתן להוריד <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.</a> שים לב: בנוסף להורדת התכנית, Multitracker plug-in יש להוריד ולהתקין כפי שצוין <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html">בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את ערימת התמונה לתוך ImageJ על ידי לחיצה על הכרטיסייה הקובצת ולאחר מכן בחירת רצף תמונות היבוא →. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התיקייה המכילה את ערימת התמונה, סמן את אחת מהתמונות ובחר פתוח. תיבת דיאלוג רצף אפשרויות תיפתח. לחץ על שמות מיון מבחינה מספרית ולאחר מכן בחר אישור וערימת התמונה תהיה טעונה לImageJ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סף את כל התמונות, כך שכל מורכב מרקע לבן עם להיות הזבוביומר לנקודה שחורה. כדי להתחיל בתהליך זה, להמיר את התמונה לפורמט 8 ביט על ידי בחירת סוג → 8 סיביות תחת לשונית התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית התמונה שוב ובחר התאם → סף. הפעולה זו תפתח את תיבת דיאלוג הסף שבו הסף מנותק נקודה יכולה להיות מותאמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקה באמצעות התמונות כדי לראות אם יש נקודות שחורות נוספות או אם פרוסה חסרת נקודה שחורה. אם זה המקרה, להתאים את הסף כדי להקל על הבעיה. בדרך כלל הסף לא צריך להיות מותאם כברירת מחדל התכנית לערך נאות. שים לב: בכל שקופית בערימה צריכה להיות רק אחד נקודה שחורה המייצגת את עמדתו של הזבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר להחיל בתיבת דיאלוג הסף והמר למסכת תיבת דיאלוג יפתח. אל תלחץ על כל אחת מהאפשרויות, אלא פשוט לחץ על אישור לסף ערימת התמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר thresholding ערימת התמונה, בחר Multitracker לחבר-תחת לשונית תוספים כדילמדוד את התנועה של הזבוב בפיקסלים. תיבת דיאלוג Tracker האובייקט תופיע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כל אחת מארבע האפשרויות שניתנו בתיבת הדיאלוג ולאחר מכן בחר אישור. לאחר מכן התוספת Multitracker יצרף קואורדינטות לנקודה השחורה בכל פרוסה וצייני אותם בחלון התוצאות, כמו גם את אורך הדרך הכולל בפיקסלים. חלון הנתיבים נותן תצוגה גרפית של נתיב הזבוב לקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעתיק את רשימת ה-X וה-Y לתאם מחלון התוצאות ולהדביק את הנתונים לגיליון אלקטרוני Excel. אם שקופיות כל בערימה אין נקודה שחורה בזה, תכנית Multitracker תבלום שבשקופית. במקרה כזה, יש צורך לחזור לשלב 4.2 מחדש סף הערימה כדי לוודא שאוגרים לטוס כנקודה שחורה בשקופית בשאלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמיר את נתיב אורכים מפיקסלים לסנטימטר, לקחת תמונה נפרדת של שתי נקודות שהם מרווחים מאחד סנטימטר על פיסה לבנה נייר ריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב מעלצעדים (3.1-4.4.2), כדי לקבוע את x, y פיקסל קואורדינטות עבור שתי הנקודות ולהשתמש במידע זה כדי לקבוע את מספר הפיקסלים המקביל לסנטימטר. מקדם המרה זה משמש בשלב חמישה כדי להפיק נתונים תנועה בס&quot;מ. הערה: ברגע שזה נעשה, זה חשוב כדי לשמור על המצלמה קבועה עבור כל ההקלטות העתידיות. בכל פעם שהמצלמה עברה או מותאמת, צריכה לחזור על שלב זה להמיר את הפיקסלים לסנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורך הנתיב שנוצר על ידי התוספת Multitracker מגזים בהערכת תנועה בגלל תנודות קלות בתנוחת גוף ועוצמה / השתקפות אור תשפיע על הגודל והמרכז של הנקודה השחורה שנוצרת כאשר thresholding התמונות. רעש זה יש להסיר על מנת לקבל הערכה מדויקת של תנועת זבוב. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח נתונים באמצעות Excel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרעש מהנתונים שנרשמו על ידי יבוא הסדרה של x, y קואורדינטות שנוצר על ידי יחסי ציבור Multitrackerogram לטוסו ניתוח, תכנית של Visual Basic Excel שנוצרה על ידי המחברים. (התכנית זמינה על ידי יצירת קשר עם החברים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן לחץ אותי ובחר ניתוק ערך סף. בחר ערך סף של 0.5 סנטימטר / שנייה לניתוח צד&quot;ל או לבחור ערך בין .1-.3 סנטימטר / שנייה לניתוח תנועה. לחץ על אישור והתכנית לחשב את המהירות, הזמן ומרחק של תנועה. הערה: התכנית משתמשת בחלון הזזה ניתוח כדי להעריך את הנתונים בפחי שניות רציפים 0.5-1.0 ומחשבת את המהירות בחלון זה. כל דבר מעל הפסקת מוגדרת על ידי המשתמש הוא כאל תנועת זבוב. </li></ol>

<ol><li>Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+manipulations+that+alter+metabolism+suppress+seizure-like+activity+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in.</a> 1496, 94-103 (2013).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Video+Tracking+of+Locomotion+in+Adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li>
<li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EthoVision+video+tracking+systema+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).</li>
<li>Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iFly+tracking+system+for+an+automated+locomotor+and+behavioural+analysis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster.</a> Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, (2002).</li>
<li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portrait+of+locomotor+behaviour+in+Drosophila+determined+by+a+video-tracking+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Processes%22%5BJournal%5D)">A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm.</a> Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).</li>
<li>Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+behaviour+and+locomotor+activity+by+takeout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).</li>
<li>Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+variability+of+sleep+and+activity+as+biomarkers+of+ageing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila.</a> Biogerontology. 13, 489-499 (2012).</li>
<li>Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+modulation+of+Drosophila+sleep-wake+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+%27%27Tracker%27%27+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program.</a> PLos ONE. 7, (2012).</li>
<li>Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+a+long-term+movement+abnormality+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+classic+galactosemia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia.</a> Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).</li>
<li>Seiger, M. B., Kink, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+anesthesia+on+the+photoresponses+of+four+sympatric+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Genet%22%5BJournal%5D)">The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila.</a> Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).</li>
<li>Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+easily+shocked+gene%3A+a+mutation+in+a+phospholipid+synthetic+pathway+causes+seizure%2C+neuronal+failure%2C+and+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis.</a> Cell. 79, 2333 (1994).</li>
<li>Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tko+locus%2C+site+of+a+behavioral+mutation+in+D.+melanogaster%2C+codes+for+a+protein+homologous+to+prokaryotic+ribosomal+protein+S12%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12.</a> Cell. 51, 165-173 (1987).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. , 187-534 (2011).</li>
<li>Hardie, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMP-activated+protein+kinase+in+the+metabolic+syndrome+and+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease.</a> FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharma%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאשר בוחנים של תנועה או דפוסי תנועה בדרוזופילה, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לחלץ מידע לגבי המרחק שעבר, מהירות תנועה והדפוס של תנועה. על מנת לחלץ את המידע הזה, ציוד יקר באופן מסורתי מועסק שהוא לעתים קרובות מונע למעבדות קטנות יותר או מעבדות שרוצים להשתמש במבחנים כאלה במשורה 4,8,9. Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי לקבוע את המרחק שעבר (איורים 2 ו 6), מהירות התנועה <s...

בהתחשב בתוחלת חיים הקצר שלה וכלים הגנטיים חזקים הזמינים, melanogaster דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר האטיולוגיה של מחלות שונות והפיסיולוגיה הבסיסית של תהליכים ביולוגיים שונים. במקרים רבים, זה יתרון כדי למדוד את ההשפעות שיש להם מניפולציות התנהגותיות, גנטיות או תרופתית על תנועה באורגניזמים המודל הבאים 1,2. יש מגוון של שיטות המשמשים בדרך כלל למדידת תנועת זבוב בשני ממדים 3-7. מערכות אלו יכולים לתמוך במעקב של זבובים מרובים בו זמנית ויכולות למדוד מהירות, אורכי נתיב להקליט ולתעד את אחוז זמן זבוב בילה נע. הם כבר השתמשו ללמוד תנועה במגוון רחב של הקשרים כוללים את ההשפעות של תרופות על תנועה והטבע דימורפית המיני של תנועת 6-9 זבוב. החסרון העיקרי של מערכות אלו הוא עלות sys המעקבTEM או תוכנה והמצלמה המקבילה. במקרים מסוימים, זה יכול לרוץ באלפי דולרים. עלות היא דאגה מיוחדת למעבדה שהיית צריך רק שימוש מוגבל של מערכת כזו, למשל, כימות דפוסי קטר של מוטציה מבודדת חדש. שיטה פשוטה אך חזקה פחות היא להשתמש במערכות שתנועת השיא מבוססת על כמה פעמים זבוב חוצה נתיב קרן אור אינפרא אדום שממוקם באמצע צינור סגור 10,11. בעוד שמערכות כאלה יכולות לתת מידע רב ערך על מחזורי תנועה ושינה והערות, שהם מעל או מתחת לאומדן תנועה יכולים כי הם לא מצליחים ללכוד את הנתיב האמיתי של הזבוב. לדוגמא, זבובים שמפגינים תנועה ניכרת בקצוות של הצינור יירשמו תנועה נמוכה זבובים למרות ששיטות ברזולוציה גבוהה נוספות היו בשימוש כדי לנסות ולעקוף את המגבלות האלה 12. פשוט יותר וזול יותר עדיין מטפסים מכשירים המודדים geotaxiים, התנועה כלפי מעלה של זבובים, דרך צינור בודד או סדרה של צינורות 2,13. בעוד מערכות כאלה הן זולות ובקלות יכולות לזהות פגמים geotaxis, הם מצליחים ללכוד היבטים רבים אחרים של תנועה שיהיו עניין לחוקרים. למעבדות רבות, מערכת ניתוח חזק בעלות נמוכה כי הוא פשוט להתקנה ולתפעול תהיה כלי מועיל לאפיון הבדלים ההתנהגותיים בד melanogaster זנים. כאן אנו מתארים assay שיכול להיות ההגדרה בפחות ממאתיים דולרים, והוא מסוגל לתת מידע על הדרך, המהירות ומשך הזמן של תנועתו של הזבוב. כדי להדגים את היעילות של assay, אנו מציגים נתונים המראים כי ניתן להשתמש בו כדי לזהות; 1) פגם של תנועה במוטצית מפץ רגיש (BS), כי הוא רגיש להתקפים ו2) היכולת של מטפורמין התרופה, אשר משמש בדרך כלל לטיפול בסוכרת מסוג II, כדי להפחית את עוצמת פעילות כמו התקף-i (SLA)n שתי מוטציות BS.

<table><tbody><tr><td>מצלמת אינטרנט</td><td>Logitech</td><td>Pro900</td><td>כל מצלמת רשת איכותית תספיק.</td></tr><tr><td>תוכנת Time-lapse HandiAVI</td><td>תוכנת Azcendant ניתן</td><td></td><td>למצוא את הגרסה העדכנית ביותר בכתובת http://www.azcendant.com/</td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>הגרסה העדכנית ביותר ניתן למצוא ב http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Multiracker Plug-In</td><td>NIH</td><td></td><td>הגרסה העדכנית ביותר ניתן למצוא ב http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>Vortex Genie 2</td><td>רוב המערבולות בגודל סטנדרטי כמו ה-Vortex Genie 2 יספיקו.</td></tr><tr><td>כיסוי צלחת פטרי 5 ס"מ</td><td>LabM Limited</td><td>D011</td><td>ניתן להשתמש בכיסויי צלחת פטרי קטנים או גדולים יותר לבדיקת זירה בתנועה.</td></tr><tr><td>קופסת אור</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>בנויה מחומר גרוטאות. תאורה משמשת לבדיקת התנועה. בהתאם לתאורת החדר, ניתן לבצע את הבדיקה ללא תיבת האור.</td></tr></tbody></table>

שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב<em&gt; דרוזופילה</em

A Low-cost Method for Analyzing Seizure-like Activity and Movement in Drosophila

מערכות מעקב וידאו היו בשימוש נרחב לניתוח תנועת melanogaster דרוזופילה ולזהות חריגויות שונות בהתנהגות של קטר. בעוד שמערכות אלה יכולות לספק שפע של מידע התנהגותי, את העלות והמורכבות של מערכות אלו יכולים להיות מונעים למעבדות רבות. פיתחנו assay עלות נמוכה למדידת התנהגות של קטר ותנועת תפיסה בד melanogaster. המערכת עושה שימוש במצלמת אינטרנט כדי ללכוד תמונות שיכולים להיות מעובד באמצעות שילוב של תוכנה זולה וחופשית כדי לעקוב אחר את המרחק שעבר, מהירות תנועה ואת משך הזמן של תנועה הממוצעת במהלך פרק זמן שצוין. כדי להדגים את התועלת של מערכת זו, בדקנו קבוצה של ד melanogaster מוטציות, paralytics מפץ רגיש (BS), שהם 3-10 פעמים רגישים יותר כמו פעילות תפיסה (SLA) מאשר זבובי סוג בר. באמצעות מערכת הרומן הזה, שהיינו מסוגל לזהות שmutan BSחסר טעם לא מפץ (BSS) מציג רמות נמוכות יותר של תנועת גישוש בסביבת רומן מאשר זבובי סוג בר. בנוסף, המערכת משמשת לזיהוי שמטפורמין התרופה, אשר בדרך כלל משמש לטיפול בסוכרת מסוג II, מפחית את עוצמת צד&quot;ל במוטנטים BS.

הטכניקה המתוארת כאן כבר השתמשה בעבר כדי לנתח הבדלים בצד&quot;ל במוטנטים BS דרוזופילה 1. התוצאות שהוצגו כאן לערב את זני BS בהלם בקלות (EAS), מפץ חסר טעם (BSS), ונוקאאוט טכני (TKO). מוקד EAS מקודד קינאז ethanolamine המעורב בסינתזת ethanolamine phosphatidyl 15 ולוקוס TKO מקודד riboprotein המיטוכונדריה 16. המוטציה BSS היא אלל של ערוץ השיתוק (para) המתח מגודרת נתרן 17. אללים השתמשו במחקר ז...

שימוש במצלמת אינטרנט ושילוב של תוכנות חופשיות וזולות, ניתן לנתח דפוסי קטר בדרוזופילה melanogaster כדי לזהות הבדלים במהירות, מרחק, והזמן של פעילויות מוטוריות שונות.

Video tracking systems have been used widely to analyze Drosophila melanogaster movement and detect various abnormalities in locomotive behavior. While ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות שינויים בהתנהגות מוטורית או בהתקפי סער ב-drosophila. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הפרדת הזבובים למבחנות בודדות תוך שימוש בהרדמה. לאחר מכן, נעשה שימוש במצלמת רשת פשוטה כדי להקליט את תנועת הזבובים.לאחר מכן, הנתונים מיובאים ל-Image J כדי להתחיל בניתוח. לבסוף, נעשה שימוש בתוכנה ייעודית לניתוח זבובים כדי לקבוע את המרחק, המהירות ומשך התנועה במהלך תקופת ההקלטה. בסופו של דבר, בדיקה זו יכולה להראות שינויים בהתנהגות מוטורית או התקפי אפילפסיה הקשורים למניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות.כעת, טכניקת ההקלטה בעלות הנמוכה שנתאר יכולה לשמש הן לניתוח התנהגות אפילפטית (seizure behavior) והן לתנועה (locomotion) בזבובי פירות. בפרט, השתמשנו בה כדי לזהות מניפולציות גנטיות ופארמקולוגיות המשנות את ההתנהגות האפילפטית בזבובים אלו. אך היום, כריס ברנר, עוזר מחקר לתואר ראשון במעבדה שלי, ידגים טכניקה זו. כדי להתחיל, הגדירו את מצלמת האינטרנט שתקליט את הזבובים במהלך בדיקות התנועה והאפילפסיה.לאחר שהמצלמה הותקנה במקומה, פתח את תוכנת handy a VI. כדי לכוון את הגדרות ההקלטה, בחר באפשרות time-lapse images תחת לשונית capture, וכשחלון חדש ייפתח, בחר ב-webcam כהתקן הלכידה. עבור רוב הניסויים, גודל פריים של 640 על 480 הוא מספיק. תחת אפשרות הדחיסה (compression), בחר בקודק Intel IUV והגדר את מספר השניות לכל פריים בהתאם לבדיקה.בלשונית advanced, צור קובץ תמונת bitmap עבור כל לכידה ובחר תיקייה שבה תשמור התוכנה את רצף התמונות לאחר ההקלטה. לאחר מכן, הנח זבוב מת על דף נייר. לחץ על תיבת הגדרות הווידאו, ובלשונית device settings, כוון את ההגדרות עד שהרקע הלבן והבהיר יהיה בניגוד ברור לזבוב הכהה יותר.לחצו על כפתור ההתחלה כדי להתחיל את ההקלטה. עם סיום תקופת ההקלטה, לחצו על כפתור העצירה. ערימת התמונות צריכה להימצא כעת בתיקייה שנבחרה כדי להתחיל את בדיקת הפעילות המוטורית.העבירו את הזבובים למבחנות אישיות עם פקק פלcotton. המתינו שהזבובים יירגעו ללא הפרעה במשך 20 עד 30 דקות לפני ההמשך. לאחר זמן זה, הקישו בעדינות כדי להוציא את הזבוב המיועד לבדיקה מהמבחנה אל מתחת למכסה של פטרי dish.הכיסוי צריך להכיל חריצים קטנים כדי לאפשר זרימת אוויר; מקם את הזבוב תחת מצלמת הרשת שהוצבה קודם לכן. כאשר הדבר מוכן, לחץ על start כדי להתחיל בהקלטת הפעילות הלוקומוטורית. השלב הראשון של בדיקת הפרכוסים הוא האכלת זבובים בני יומיים הרגישים לפרכוסים, במצע סטנדרטי או במצע מעורבב עם התרופה הנבדקת.לאחר יומיים של האכלה, העבירו את הזבובים על ידי טפיחה עדינה לבקבוקונים ריקים ובודדים, ואטמו את הבקבוקונים באמצעות פקק כותנה. אפשרו לזבובים להישאר ללא הפרעה למשך 20 דקות לפני התצפית. כאשר תהיו מוכנים, ערבבו בקבוקון במערבל Vortex במעבדה או באמצעות ההגדרות הגבוהות ביותר למשך 10 שניות.הניחו מיד את הזבוב המקובע על דף נייר לבן ישירות מתחת למצלמת הרשת. לאחר ההנחה, התחילו בהקלטה של פעילות הזבובים זו.הזבוב יבצע תנועות מהירות ולא מתואמות, שביניהן יופיעו תקופות של שיתוק. את ההקלטה יסיימו ברגע שהזבוב יזדקף. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, פתחו את תוכנת עיבוד התמונות החינמית image J.ייבאו את ערימת התמונות הרצויה על ידי לחיצה תחילה על לשונית הקבצים (File) ולאחר מכן בחירה בייבוא (Import). לבסוף, בחרו ברצף תמונות (Image Sequence). בחרו את התיקייה המכילה את ערימת התמונות ופתחו תמונה.כאשר תיבת הדיאלוג של אפשרויות הרצף נפתחת, בחרו במיון שמות מספרית ולאחר מכן בחרו ב-Okay. כעת ערימת התמונות תיטען ל-Image J. בשלב הבא, בחרו בלשונית image והגדירו את סוג הערך ל-eight bit. לחצו שוב על לשונית image ובחרו ב-threshold תחת אפשרות ה-adjust.פעולה זו קובעת את הסף בכל התמונות, כך שכל אחת מהן תכיל רקע לבן כאשר הזבוב יומר לנקודה שחורה. פעולה זו פותחת גם את תיבת הדיאלוג של הסף, שבה ניתן להתאים את נקודות החיתוך. סקרו את התמונות כדי לבדוק אם הן מכילות נקודות שחורות מיותרות או אם הנקודה חסרה.במידת הצורך, התאימו את הסף (threshold) כדי לפתור בעיות כלשהן. לאחר ביצוע ההתאמות, בחרו ב-apply בתיבת הדיאלוג של הסף. כאשר תיבת הדיאלוג convert to mask נפתחת, לחצו על okay כדי לבצע סף למערך התמונות (image stack).כדי למדוד את תנועת הזבוב בפיקסלים, בחרו בתוסף multi tracker תחת לשונית plugins. כאשר מופיע תיבת הדו-שיח של object tracker, סמנו את כל ארבע האפשרויות שניתנו ולחצו על Okay. לאחר מכן, תוסף ה-multi tracker ישייך קואורדינטות לצבע השחור.בכל פרוסה, ורשום אותם בחלון התוצאות, כמו גם את האורך הכולל בפיקסלים. חלון הנתיבים מציג תצוגה גרפית של הנתיב שבו עבר הזבוב. העתק את רשימת קואורדינטות X ו-Y מחלון התוצאות והדבק את הנתונים בגיליון Excel.אם באחת השקופיות בערימה אין אזור שחור, תוכנת ה-multi tracker תעצור באותה שקופית. אם הדבר קורה, יש לבצע סף (threshold) מחדש לערימה כדי להבטיח שהזבוב יירשם כשטח שחור.בשקופית המדוברת. כדי להמיר את אורכי המסלול מפיקסלים לסנטימטרים, צלמו תמונה של שתי נקודות המרוחקות זו מזו במרחק ידוע על גבי דף לבן חלק. קבעו את קואורדינטות ה-XY בפיקסלים של שתי הנקודות, והשתמשו במידע זה כדי לקבוע את מספר הפיקסלים התואמים לסנטימטר אחד לצורך קבלת תוצאות מדויקות יותר.הסר רעשים מהתמונות על ידי ייבוא קואורדינאטות XY לתוכנה ייעודית לניתוח זבובים. לאחר הפתיחה, ייבא נתונים מכל גנוטיפ או טיפול לגיליונות אלקטרוניים נפרדים. לאחר מכן, בחר בלשונית גיליון הסיכום ולחץ על כפתור "לחץ עליי".בחרו ערך סף בהתאם לסוג הניתוח, לחצו על אישור, והתוכנה תחשב את המהירות, הזמן ומרחק התנועה. נתיבים מייצגים אלו מראים פעילות דמוית פרכוסים בזבובים מוטנטים עם ובלי טיפול במטפורמין. פעילות הפרכוסים פחתה בעקבות הטיפול בשני המוטנטים שנבדקו.מטפורמין הפחית באופן משמעותי הן את המרחק שעברו הזבובים במהלך בדיקת הפרכוס והן את משך הזמן הכולל של הפעילות דמוית-הפרכוס. בניגוד לכך, לא חל שינוי במהירות הממוצעת במסלולי התנועה האישיים הללו. מסלולו של זבוב ה-CS מסוג הפרא (wild type) מראה ריכוז מסביב להיקף של הזירה המעגלית.בעוד שהנתיב של זבוב BSS מוטנטי מראה את אותו ריכוז, אך עם פחות תנועה באופן כללי. כאשר נבדקו לתנועתיות בסביבה חדשה, הקישו מוטנטי BSS הפגינו הפחתה משמעותית באורך הנתיב בהשוואה לזבובי CS. הבדיקה זיהתה גם שינויים במהירות התנועה בזמן שזבוב ה-CS חקר במהלך בדיקה של התנועתיות.זבוב ה-BSS נשאר בלתי פעיל יחסית לאורך הניסוי, למעט מספר פרצי פעילות. אחד הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע cualquiera מאסייים התנהגותיים אלו בטכניקה זו הוא להבטיח שלא תרדימו את הזבובים לפני ביצוע ההקלטות. התברר כי הרדמה תשפיע הן על התנהגות פרכוסים והן על התנהגות מוטורית, ועשויה לשנות באופן משמעותי את התוצאות שלכם.

a-low-cost-method-for-analyzing-seizure-like-activity-movement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המחקר של התנהגות של תנועה...

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

באמצעות גירוי חשמלי בתדר גבוה, תפיסת כמו פעילות יכול להיגרם...

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

סרטון זה מתאר כיצד לעקוב אחר זבובים ההולכים בחופשיות כדי להעריך את יכולת התנועה הכללית שלהם. הפרוטוקול המוצג מדגים את הגדרת הבדיקה וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

מעקב אחר זבובים מהלכים בחופשיות: שיטה להערכת תנועה בדרוזופילה

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

וזמינותו האי הוא חדש יחסית, חסכונית assay יכול לשמש כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות בסיסי melanogaster דרוזופילה. כתב יד זה מתאר אלגוריתמים עיבוד נתונים אוטומטי, כימות אובייקטיבי של האי assay נתונים, שהופך את assay readout רגיש, תפוקה גבוהה במסכים גדולים גנטית או תרופתי.

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בזחלי דרוזופילה לזיהוי תרכובות נוגדות פרכוסים ייחודיות לטיפול באפילפסיה.

פעילות התקפים הנגרמת על ידי שוק חשמלי בזחלי דרוזופילה

למדו שיטה בעלות נמוכה לניתוח התנהגות תנועה ופעילות פרכוסים בדרוזופילה melanogaster באמצעות מצלמת רשת ותוכנות ניתוח. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות שינויים בהתנהגות הנגרמים על ידי שינויים גנטיים וטיפולים פרמקולוגיים.

שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב

גלה סרטונים נוספים