שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב דרוזופילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שינויים בהתנהגויות תנועה או התקפים בדרוזופילה. זה מושג על ידי הפרדת הזבובים לבקבוקונים בודדים באמצעות הרדמה. לאחר מכן, מצלמת אינטרנט פשוטה משמשת להקלטת תנועת הזבובים.

לאחר מכן הנתונים מיובאים לתמונה J כדי להתחיל בניתוח. לבסוף, תוכנת ניתוח זבובים בהתאמה אישית משמשת לקביעת המרחק, המהירות ומשך התנועה במהלך תקופת ההקלטה. בסופו של דבר, בדיקה זו יכולה להראות שינויים בהתנהגות תנועה או התקפים הקשורים למניפולציות גנטיות ותרופתיות.

כעת, טכניקת ההקלטה הזולה הזו שאנו הולכים לתאר יכולה לשמש הן לניתוח התנהגות התקפים והן לתנועה בזבובי פירות. בפרט, השתמשנו בו כדי לזהות מניפולציות גנטיות ותרופתיות שמשנות את התנהגות ההתקפים אצל אותם זבובים. אבל היום, כריס ברנר, עוזר מחקר לתואר ראשון במעבדה שלי, ידגים את הטכניקה הזו כדי להתחיל להגדיר את מצלמת האינטרנט שתתעד את הזבובים במהלך מבחני התנועה וההתקפים.

לאחר שהמצלמה נמצאת במקומה, פתח את תוכנת VI השימושית. כדי להתאים את הגדרות ההקלטה, בחר באפשרות תמונות זמן-lapse תחת לשונית הלכידה, וכאשר החלון החדש נפתח, בחר את מצלמת האינטרנט כמכשיר הלכידה. עבור רוב הניסויים, גודל מסגרת וידאו של שש 40 על ארבע 80 מתאים תחת אפשרות הדחיסה, בחר את ה-codec של Intel IUV והגדר את השניות למסגרת בהתאם לבדיקה.

תחת הכרטיסייה מתקדם, צור קובץ תמונת מפת סיביות עבור כל לכידה ובחר תיקיה עבור התוכנית לאחסון ערימת התמונות לאחר ההקלטה. לאחר מכן, הניחו זבוב מת על דף נייר. לחץ על תיבת הגדרות הווידאו, ותחת לשונית הגדרות המכשיר, התאם את ההגדרות עד שהרקע הלבן הבהיר יהיה בניגוד ברור לזבוב הכהה יותר.

לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל בהקלטה. לאחר סיום תקופת ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה. ערימת התמונות אמורה להיות כעת בתיקייה שנבחרה כדי להתחיל את בדיקת הפעילות התנועה.

העבירו את הזבובים לבקבוקונים בודדים המכוסים בפקק כותנה. אפשר לזבובים לשבת ללא הפרעה במשך 20 עד 30 דקות לפני שתמשיך. לאחר זמן זה, הקש בעדינות על הזבוב כדי להיבדק מתוך הבקבוקון ומתחת לכיסוי צלחת פטרי.

הכיסוי צריך להכיל חריצים קטנים כדי לאפשר זרימת אוויר למקם את הזבוב מתחת למצלמת האינטרנט שהוגדרה קודם לכן. כשתהיה מוכן, לחץ על התחל כדי להתחיל להקליט פעילות תנועתית. השלב הראשון של בדיקת ההתקפים הוא להאכיל זבובים רגישים להתקפים בני יומיים, או מדיה סטנדרטית או מדיה מעורבת עם התרופה לבדיקה.

לאחר יומיים של האכלה, העבירו את הזבובים על ידי הקשה עדינה לבקבוקונים ריקים בודדים וכסו את הבקבוקונים בפקק צמר גפן. אפשר לזבובים לשבת ללא הפרעה במשך 20 דקות לפני התצפית. כשהוא מוכן, מערבל בקבוקון על מערבולת מעבדה או השתמש בהגדרות הגבוהות ביותר למשך 10 שניות.

הניחו מיד את הזבוב המשותק על דף נייר לבן ישירות מתחת למצלמת הרשת. לאחר ההתקנה, התחל להקליט. זה מעיף פעילות.

הזבוב יעבור תנועות מהירות ולא מתואמות ביניהן תקופות של שיתוק. ההקלטה מסתיימת ברגע שהזבוב תיקן את עצמו. כדי להתחיל לנתח את הנתונים, פתח את תוכנת עיבוד התמונה החינמית תמונה J לאחר פתיחתה.

ייבא את אוסף התמונות הרצוי על-ידי לחיצה תחילה על כרטיסיית הקובץ ולאחר מכן בחירה באפשרות ייבוא. ולבסוף, רצף תמונות. בחרו בתיקייה הכוללת את אוסף התמונות ופתחו תמונה.

כאשר תיבת הדו-שיח אפשרויות רצף נפתחת, בחר מיין שמות מספרית ולאחר מכן בחר. בסדר. ערימת התמונות תיטען כעת לתמונה J.לאחר מכן, בחר את כרטיסיית התמונה והגדר את סוג הערך לשמונה סיביות. לחץ שוב על לשונית התמונה ובחר סף תחת אפשרות ההתאמה.

זה קובע את הסף בכל התמונות כך שכל אחת מהן מורכבת מרקע לבן כאשר הזבוב מומר לנקודה שחורה. זה גם פותח את תיבת הדו-שיח של הסף שבה ניתן לכוונן נקודות חיתוך. סרוק את התמונות כדי לראות אם הן מכילות נקודות שחורות נוספות או אם הכתם חסר.

במידת הצורך, התאם את הסף כדי להקל על בעיות. לאחר ביצוע ההתאמות, בחר החל בתיבת הדו-שיח סף. כשתיבת הדו-שיח 'המרה למסיכה' נפתחת, לחצו על 'אשר' כדי לסף את אוסף התמונות.

כדי למדוד את תנועת הזבוב בפיקסלים, בחר את תוסף המעקב המרובה תחת הכרטיסייה תוספים. כשתיבת הדו-שיח של מעקב אחר אובייקטים מופיעה, לחץ על כל ארבע האפשרויות המוצגות ובחר. בסדר. לאחר מכן, התוסף multi tracker יצמיד קואורדינטות לשחור.

בכל פרוסה, ורשום אותם בחלון התוצאות, כמו גם את האורך הכולל בפיקסלים. חלון הנתיבים מציג את התצוגה הגרפית של הנתיב שהזבוב עבר. העתק את רשימת הקואורדינטות X ו-Y מחלון התוצאות והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני של Excel.

אם לשקופית כלשהי בערימה אין שחור. בו, תוכנית המעקב הרב-תכליתי תעצור בשקופית זו. אם זה קורה, סף מחדש את הערימה כדי להבטיח שהזבוב נרשם כשחור.

בשקופית המדוברת. כדי להמיר את אורכי הנתיב מפיקסלים לסנטימטרים, צלם תמונה של שתי נקודות המרוחקות מרחק ידוע זו מזו על פיסת נייר לבנה ריקה. קבעו את קואורדינטות פיקסל XY לשתי הנקודות, והשתמשו במידע זה לקביעת מספר הפיקסלים המתאימים לסנטימטר אחד לקבלת תוצאות מדויקות יותר.

הסר רעש מהתמונות על ידי ייבוא קואורדינטות ה-XY לתוכנית ניתוח זבובים בהתאמה אישית. לאחר הפתיחה, ייבא נתונים מכל גנוטיפ או טיפול לגיליונות אלקטרוניים נפרדים. לאחר מכן, בחר את לשונית גיליון הסיכום ולחץ על כפתור לחץ עליי.

בחר ערך סף בהתאם לסוג הניתוח, לחץ על אישור, והתוכנית תחשב את המהירות, הזמן ומרחק התנועה. מסלולים מייצגים אלה מראים פעילות דמוית התקף בזבובים מוטנטיים עם ובלי טיפול במטפורמין. פעילות ההתקפים פחתה עם הטיפול בשתי המוטציות שנבדקו.

מטפורמין הפחית משמעותית הן את המרחק שעבר במהלך בדיקת ההתקף והן את משך הפעילות הכוללת דמוית ההתקף. לעומת זאת, לא היה שינוי במהירות הממוצעת במסלולי התנועה הבודדים הללו. הנתיב של זבוב CS מסוג פרא מראה ריכוז סביב הפריפריה של הזירה המעגלית.

בעוד שהנתיב של זבוב BSS מוטנטי מראה את אותו ריכוז, אך עם פחות תנועה בסך הכל. כאשר נבדקו לתנועה בסביבה חדשה, מוטציות ה-BSS הראו ירידה משמעותית באורך הנתיב בהשוואה לזבובי CS. הבדיקה זיהתה גם שינויים במהירות התנועה בזמן שזבוב ה-CS נחקר במהלך בדיקת התנועה.

זבוב ה-BSS נותר יחסית לא פעיל לאורך כל הניסוי למעט כמה פרצי פעילות. אחד הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע אחת מהבדיקות ההתנהגותיות הללו בטכניקה זו הוא לוודא שלא תרדימו את הזבובים לפני ביצוע ההקלטות. מתברר שהרדמה תשפיע הן על התנהגות ההתקפים והן על התנהגות הקטר ויכולה לשנות באופן משמעותי את התוצאות שלך.