בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את האינטראקציות בין תאי סרטן פרוסטטה נדירים לבין תאים אנדותליאליים המבטאים E-selectin באמצעות מערך זרימה על שקופית מיקרוסקופית. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי של השקופית המיקרוסקופית בפיברונקטין. השלב השני הוא גידול של תאי אנדותל מווריד טהוריים אנושיים (HUVECs) במערכת זרימה דינמית על שקופית מיקרוסקופית בעלת רוחב תעלה קטן.

בשלב הבא, תאי סרטן הערמונית מסומנים עם נוגדן מונוקלונלי אנושי למסנן אנטיגן ממברנלי ספציפי לערמונית (anti prostate specific membrane antigen) או PSMA, אשר נספג לתוך התא. השלב הסופי הוא ביצוע פרפוזיה של תאי סרטן הערמונית המסומנים ב-anti PSMA על גבי ה-ve המבטא e selectin. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה וידאו כדי להראות את האינטראקציות בין תאי סרטן הערמונית לבין התאים האנדותליאליים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תא זרימה בעל לוחות מקבילים ומערכים דינמיים אחרים, הוא שבמסגרתה ניתן לבחון את האינטראקציות בין תאי סרטן פרוסטטה נדירים, כגון תאי גידול סירקולטיביים, לבין תאי אנדותל מתורגדים במערכת זרימה דינמית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגריורה, כגון כיצד תאי גידול של הפרוסטטה מגרורים דרך מערכת כלי הדם? האם הם משתמשים באותם מנגנונים שבהם משתמשים לוקוציטים במהלך תהליך הגירתם?

באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהיא כוללת גידול של שכבה אחת של תאי אנדותל בתוך תעלה צרה תחת פרפוזיה תחת מנדף לתרביות רקמה. ראשית, שטפו את המיקרו-סלייד בבס פוספט (phosphate buffered saline) או PBS. לאחר מכן, צפו בעדינות את המיקרו-סלייד ב-200 µL של fibronectin בריכוז 50 µg/mL באמצעות מזרק lure lock של 1 mL.

כסו את התו שלית עם המכסה והשאירו אותו בתוך מנדף לתרביות רקמה למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של 200 µL של מצע גידול qve חמים על גבי התו שלית והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. חלוקה איטית של הנוזל אל תוך התו שלית מונעת היווצרות בועות בתעלה.

במהלך הפרופוזיה, הכין את תגלי ה-vex על ידי שטיפת ה-vex ב-PBS והוספת 0.1%collagenase פלוס 0.05%EDTA ב-PBS למשך דקה עד שתי דקות בטמפרטורת החדר. סבב במרכזפוגה את ה-hve בשני מיליליטר של מצע גידול ב-180 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, מדוד את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר והכן 10 מיליון תאים ל-100 µL של מצע גידול.

בשלב הבא, הסר בזהירות את המצע מפתח הכניסה של המיקרו-סלייד. באמצעות טיפ של פיפט של 200 µl, הרם את המיקרו-סלייד לגובה העיניים והזרק בעדינות 200 µl מהריכוז המוכן של vex לתוך התעלה באמצעות מזרק לור-לוק (lure lock) של 1 mL. יש לנקוט זהירות בשלב זה כדי למנוע היווצרות בועות; אם מופיעות בועות, המשך בביצוע הפרפוזיה למשך זמן מעט ארוך יותר עד שהבועות יעברו לתעלת המוצא.

בשלב הבא, העבירו בפיפטה נפח שווה של כ-80 µL של מצע VE הן לכניסה והן ליציאה של המיקרו-סלייד. פעולה זו מונעת את זרימת התאים בכל אחד מהכיוונים. כסו את הסלייד והשאירו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 1.5 שעות.

כדי להתחיל בהרכבת תא הזרימה, הניחו מזרק סטרילי של 20 milliliter, מחברי לור (lure) זכר ונקבה, משאבת מזרקים וצינורית באינקובטור למשך 15 דקות כדי להבטיח נפח מת (dead volume) מינימלי. השתמשו בצינורית בעלת קוטר פנימי של 0.04 inches. קוטר צינורית קטן יותר מונע היווצרות בועות.

בשלב הבא, מלאו מזרק של 20 milliliter עם 12 milliliters של מצע VE חמים. הוציאו את בועת האוויר מהמזרק לחלוטין. מלאו את פתח הכניסה של המיקרו-סלייד במצע VE.

חבר מכלול זה לסלייד המיקרוסקופי. חבר בעדינות את מחבר היציאה לסלייד המיקרוסקופי. העבר את המערך אל האינקובטור וחבר אותו למשאבת המזרקים.

לאחר מכן, הגדירו את המשאבה לקצב גזירה של 10 µL לדקה לפני השארת התאים למשך לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, פרקו את המערך על ידי הסרת המחבר המחובר לכניסה של המיקרו-סלייד. לאחר מכן, הסירו את מחבר היציאה כדי להעלות את ביטוי ה-E-selectin בתאים אנדותליאליים.

הכינו מצע גידול טרי המכיל interleukin one beta. שאבו את המצע למזרק של 10 milliliter. הסירו את שאריות המצע מכניסה של השקופית, ולאחר מכן הוסיפו מצע טרי עד למילוי מלא של הכניסה.

חבר את המזרק לلامיסלייד. הגדר את משאבת המזרקים לקצב גזירה של 10 µL לדקה למשך ארבע שעות באינקובטור במהלך אינקובציית interleukin one beta של vex, והכן תאי סרטן של ערמונית המסומנים בנוגדן anti PSMA Alexa 4 88. ראשית, הוסף 0.05% trypsin EDTA לתאי סרטן הערמונית MDA למשך דקה אחת.

אין לחשוף את התאים לטריפסין למשך זמן ממושך, שכן הדבר עלול להשפיע על הגליקופפטידים הנמצאים על פני השטח של התא. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את משקע תאי ה-MDA במיליליטר אחד של Hank's Buffer והוסף את הנוגדן anti PSMA; הדגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במקום חשוך, תוך כדי השהה מחדש של התאים במהלך ההדגרה.

לאחר 30 דקות, סובב במרכזית את תמיסת התאים ב-800 ×g למשך חמש דקות. שאב את הנוזל וסבב מחדש את המשקע במיליליטר אחד של Hank's buffer. ספור את תאי ה-MDA המסומנים והבא את הריכוז הסופי ל-1 מיליון תאים למיליליטר.

מלאו מזרק של 5 mL בתאי MDA המסומנים והסִירו את הבועות. הדליקו את המיקרוסקופ ההפוך והגדירו את התאורה בעזרת עדשה של 10x. מקמו את משאבת המזרקים באותו גובה של במת הדגימות של המיקרוסקופ והגדירו אותה למאמץ גזירה של 1 dime per centimeter square.

בשלב הבא, פתחו את תוכנת Zeiss Axio vision. בחרו את העדשה על מסך המחשב. צרו תיקייה חדשה תחת אפשרות הכלים (tools) בתוכנה.

פתחו את אפשרויות הניסויים החכמים (smart experiments) ב-Axio vision והגדירו את ההגדרות להקלטת סרטונים קצרים של 32 שניות למשך 30 דקות. עבור וידאו פלואורסצנטי חי, הגדירו את אפשרויות התמונה. פרמטרים אלו מסייעים בהשגת סרטונים הקרובים לקצב הפריימים של הווידאו עם מצלמת Zeiss MRM כדי להציג את מלוא רוחב תעלת הזרימה באמצעות עדשה של 10x על מסך המחשב; השתמשו במתאם CM mount. הדליקו את מנורת הכספית לפני הנחת המזרק והמחבר המכילים את התאים על משאבת המזרקים. לאחר מכן, חברו את המחבר לתעלת הכניסה המלאה של המיקרו-סלייד המכיל תאי ax שעברו גרייה באמצעות interleukin one beta.

חבר את תעלת היציאה עם המחבר המחובר לפחית. הנח את הפחית בתוך צלחת או במבחנה קונית של 15 milliliter כדי לאסוף את הזרימה. התחל את ההזרקה דרך המיקרו-שקופית בקצב של 10 microliters לדקה.

בחנו את האינטראקציות בין תאים אנדותליאליים לבין תאי MDA מסומנים או CTCs מסומנים שהופקו מחולים תחת אור בעל אורך גל של 488 nanometer. סננו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיגנית. התחילו להקליט את הניסוי כ-32 סרטונים קצרים.

במהלך ניתוח ההקלטה, מדדו את מהירות הגלגול. מהירות הגלגול נמדדת על ידי חלוקת המרחק שעברו התאים בזמן. כאן מוצגת תרבית לילה של שכבה אחת של תאי אנדותל.

על גבי השקופית המיקרוסקופית. קני המידה מראים כי 100% מהשקופית המיקרוסקופית נראים בשימוש בעדשה עם הגדלה של five x, בעוד ש-70% נראים בשימוש בעדשה עם הגדלה של 10 x עבור אינטראקציות מתווכות נבחרות; תאים המתגלגלים בשוליים אינם נלקחים בחשבון, מה שמשאיר יותר מ-70% מהשקופית המיקרוסקופית זמינים להקלטת וידאו ולניתוח השמעה. תרשים הקופסה מציג את התפלגות מהירויות הגלגול של תאי MDA לא מסומנים ותאי MDA המסומנים ב-anti PSMA, על תאי אנדותל שעברו גרייה באמצעות interleukin one beta בתנאי מאמץ גזירה שונים.

לא נצפתה הבדל משמעותי במהירויות הגלגול ב-1 ו-5 dyn/cm² במאמץ גזירה גבוה יותר של 10 dyn/cm². נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בין מהירויות הגלגול של תאי MDA לא מסומנים לבין תאי MDA המסומנים ב-anti-PSMA. סרטון המורכב מרצף של פרקי זמן, שצולם באמצעות דם של חולה עם סרטן ערמונית, מראה שלושה סוגי אינטראקציות בין תאי CTC של ערמונית מסומנים לבין תאים אנדותליאליים המבטאים לקטין: tethering, שבו תאי CTC נצמדים ומתנתקים, adhesive stable, שבו תאי CTC לא התנתקו גם לאחר 30 שניות, וללא אינטראקציה, כאשר תאי CTC שאינם מגיבים נכנסים לשדה הראייה. ניתן לצבוע בקלות בשיטה אימונוהיסטוכימית ולדמיין פלואורסצנטית של שקופיות מיקרוסקופיות את ההצמדה החזקה של תאי MDA המסומנים ב-anti-PSMA.

ניתן לראות כאן תאי אנדותל לאחר גירוי באמצעות interleukin one beta. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבחון אינטראקציות בין תאים נדירים, כגון תאי גידול של ערמונית במחזור הדם, לבין תאי אנדותל המבטאים S selectin באמצעות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון אימונופלואורסצנציה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון נוכחותם של s selectin Ligands.

טכניקות מעין אלו יכולות לסייע לחוקרים להבין שלבים שונים המעורבים בגרורות.