בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את האינטראקציות בין תאי סרטן ערמונית נדירים לבין תאי אנדותל המבטאים e סלקטין באמצעות מכלול זרימת מיקרו שקופיות. זה מושג על ידי ציפוי תחילה של מיקרו שקופית בפיברונקטין. השלב השני הוא תרבית תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי או VE במערכת זרימה דינמית על מגלשת מיקרו עם רוחב תעלה קטן.

לאחר מכן, תאי סרטן הערמונית מסומנים באנטיגן ממברנה ספציפי לערמונית או נוגדן חד שבטי מואנש PSMA, המופנם. השלב האחרון הוא לחלחל את תאי סרטן הערמונית המסומנים נגד PSMA על פני e סלקטין המבטא ve. בסופו של דבר, מיקרוסקופ וידאו משמש להצגת האינטראקציות בין תאי סרטן הערמונית לתאי האנדותל.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תא זרימת צלחת מקביל ומכלולים דינמיים אחרים, הוא שבטכניקה זו ניתן לבחון את האינטראקציות בין תאי סרטן ערמונית נדירים, כגון תאי גידול במחזור ותאי אנדותל מתורבתים במערכת זרימה דינמית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגרורות, כגון כיצד תאי גידול הערמונית הם שולחים גרורות דרך מערכת כלי הדם? האם הם משתמשים באותו מנגנון שבו משתמשים לויקוציטים במהלך האינטגרציה שלהם?

בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהיא כרוכה בתרבית שכבה חד-שכבתית של תאי אנדותל בתעלה צרה תחת זלוף מתחת למכסה המנוע של תרבית הרקמה. ראשית, שטפו את שקופית המיקרו עם מי מלח חוצצים פוספט או PBS. לאחר מכן מצפים בעדינות את שקופית המיקרו ב-200 מיקרוליטר של 50 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין באמצעות מזרק נעילת פיתיון של מיליליטר אחד.

מכסים את שקופית המיקרו במכסה ושומרים אותה בתוך מכסה המנוע למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש להחדיר 200 מיקרוליטר של מדיום גידול qve חם מעל מגלשת המיקרו ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. חלוקה איטית של הנוזל בשקופית המיקרו מונעת היווצרות בועות בתעלה.

במהלך הזילוף, הכינו את תרחיף הווקס על ידי שטיפת וקס עם PBS והוספת 0.1% קולגנאז בתוספת 0.05% EDTA ב-PBS למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה יש בשני מיליליטר של מדיום גידול ב 180 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן מדוד את ריכוז התאים באמצעות ציטומטר המו והכין 10 מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטר של מדיום גידול.

לאחר מכן, הסר בזהירות את המדיום מהכניסה של שקופית המיקרו. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, הביאו את שקופית המיקרו לגובה העיניים ובעזרת מזרק נעילת פיתיון של מיליליטר אחד הכניסו בעדינות 200 מיקרוליטר מריכוז הווקס המוכן לתעלה. נדרשת זהירות בשלב זה כדי למנוע היווצרות בועות אם הבועות מופיעות, המשיכו לחלחל מעט יותר זמן עד שהבועות נכנסות לתעלת היציאה.

לאחר מכן, הזרם נפח שווה של כ-80 מיקרוליטר של מדיום VE הן לכניסה והן ליציאה של מגלשת המיקרו. זה מונע את זרימת התאים לשני הכיוונים. מכסים את השקופית ושומרים אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות.

כדי להתחיל בהרכבת תא הזרימה, הנח מזרק סטרילי של 20 מיליליטר, מחברי פיתוי נקבה וזכר, משאבת מזרק וצינורות בחממה למשך 15 דקות לנפח מת מינימלי. צינורות משומשים בקוטר פנימי של 0.04 אינץ'. קוטר צינורות קטן יותר מונע היווצרות בועות.

לאחר מכן, מלאו את המזרק של 20 מיליליטר ב-12 מיליליטר של מדיום VE חם. הסר את הבועה מהמזרק לחלוטין. מלאו את כניסת המיקרו שקופית במדיום VE.

חבר את המכלול הזה לשקופית המיקרו. חבר בעדינות את מחבר השקע לשקופית המיקרו. הכניסו את ההתקנה לחממה וחברו אותה למשאבת המזרק.

לאחר מכן הגדר את המשאבה לקצב גזירה של 10 מיקרוליטר לדקה לפני שהשארת התאים למשך הלילה בחממה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת פרק את ההתקנה על ידי הסרת המחבר המחובר לכניסה של מגלשת המיקרו. לאחר מכן הסר את מחבר היציאה שניים כדי לווסת את ביטוי הסלקטין בתאי אנדותל.

הכן מצע גידול טרי המכיל אינטרלוקין בטא אחד. שאפו את המדיום במזרק של 10 מיליליטר. הסר את שאריות המדיום מכניסת השקופית, ואז הוסף טרי, בינוני וממלא לחלוטין את הכניסה.

חבר את המזרק לשקופית. הגדר את משאבת המזרק בקצב גזירה של 10 מיקרוליטר לדקה למשך ארבע שעות באינקובטור במהלך אינטרלוקין דגירה אחת של וקס, הכן נוגדן אנטי PSMA Alexa 4 88 המסומן בתאי סרטן הערמונית. ראשית, הוסף 0.05% טריפסין EDTA לתאי סרטן הערמונית של MDA למשך דקה אחת.

אל תחשוף את התאים לטריפסין לזמן ארוך יותר מכיוון שהוא יכול להשפיע על הגליקופפטידים הקיימים על פני התא. צנטריפוגה של התאים ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את חיך תאי ה-MDA במיליליטר אחד של Hank's Buffer והוסיפו את הנוגדן נגד PSMA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במקום חשוך, תוך החייאת התאים במהלך הדגירה.

לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את תמיסת התא ב 800 פעמים G למשך חמש דקות. שאפו והשעו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של המאגר של האנק. ספרו את תאי ה-MDA המסומנים והביאו את הריכוז הסופי למיליון תאים למיליליטר.

מלאו מזרק של חמישה מיליליטר בתאי MDA המסומנים והוציאו את הבועות. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך והגדר את תאורת המסלסל למטרה של פי 10. הביאו את משאבת המזרק באותה רמה כמו שלב הדגימה של המיקרוסקופ והגדירו אותה על מתח גזירה של אגורה אחת לסנטימטר מרובע.

לאחר מכן, פתח את תוכנת הראייה Zeiss Axio. בחר את המטרה על מסך המחשב. צור תיקיה חדשה תחת אפשרות הכלים בתוכנה.

פתח את אפשרות הניסויים החכמים בחזון Axio והתאם את ההגדרות להקלטת סרטונים קצרים של 32 למשך 30 דקות עבור וידאו פלואורסצנטי חי, הגדר את אפשרויות התמונה. פרמטרים אלה עוזרים בהשגת סרטונים קרובים לקצב הפריימים של הווידאו עם מצלמת Zeiss MRM כדי לדמיין רוחב מלא של ערוץ הזרימה במטרה של פי 10 על מסך המחשב, השתמש במתג מתאם תושבת CM על מנורת הכספית לפני הנחת המזרק והמחבר המכיל את התאים על משאבת המזרק. לאחר מכן, חבר את המחבר לתעלת הכניסה המלאה של שקופית המיקרו המכילה אינטרלוקין גרזן מגורה בטא אחד.

חבר את תעלת השקע עם המחבר המחובר לצינור. הכניסו את הצינור לצלחת או לצינור חרוטי של 15 מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה. התחל את העירוי דרך מגלשת המיקרו ב -10 מיקרוליטר לדקה.

התבונן באינטראקציות בין תאי אנדותל לתאי MDA מסומנים או CTCs מסומנים שמקורם בחולים מתחת ל-488 ננומטר. מסנן במיקרוסקופ הפלואורסצנטי של האפי. התחל להקליט את הניסוי כסרטונים קצרים 32.

במהלך ניתוח השמעה, מדוד את מהירות הגלגול. מהירות הגלגול נמדדת על ידי חלוקת המרחק שעברו התאים לאורך זמן. מוצגת כאן תרבית לילה של חד-שכבת תאי אנדותל.

בשקופית המיקרו. קנה המידה מראה כי 100% משקופית המיקרו נראית באמצעות יעד פי חמש בעוד ש-70% גלוי באמצעות מטרה של פי 10 עבור אינטראקציות מתווכות נבחרות, תאים מתגלגלים בקצוות אינם נחשבים, מה שהופך יותר מ-70% מהמיקרו שקופית לזמינה להקלטת וידאו וניתוח השמעה. תרשים הקופסה מראה את התפלגות המהירויות המתגלגלות של תאי MDA לא מסומנים ואנטי PSMA, המסומנים על תאי אנדותל מגורים באינטרלוקין בטא אחד בתנאי עקת גזירה שונים.

לא נצפה הבדל משמעותי במהירויות הגלגול בסנטימטר רבוע אחד וחמישה סעודות במתח מוחלט גבוה יותר של 10 אגורות לסנטימטר מרובע. נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בין מהירויות הגלגול של תאי MDA ללא תווית ואנטי PSMA, המסומנים ב-MDA, סרטון תפור בזמן שצולם באמצעות הדם מחולה סרטן הערמונית מראה שלושה סוגים של אינטראקציות בין CTCs מסומנים של הערמונית לבין קשירת תאי אנדותל המבטאים לקטין כאשר CTCs מתחברים ומחברים מחדש הידבקות יציבה כאשר CTCs לא התנתקו גם לאחר 30 שניות וללא אינטראקציות כאשר CTCs שאינם מתקשרים נכנסים לשדה הראייה. מיקרו שקופיות יכולות להיות בקלות כתם חיסוני ולצלם פלואורסצנטי את ההדבקה האיתנה של תאי אנטי PSMA, המסומנים בתאי MDA.

לאחר שפע על אינטרלוקין ניתן לראות כאן תאי אנדותל מגורים בבטא אחד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחון את האינטראקציות בין תאים נדירים כגון תאי גידול ערמונית במחזור ותאי אנדותל המבטאים S סלקטין לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונופלואורסצנציה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון נוכחות s selectin. ליגנדים.

טכניקות כאלה יכולות לסייע לחוקרים להבין שלבים שונים המעורבים בגרורות.