מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו Ex vivo פיברובלסטים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את הביולוגיה הייחודית בממשק בין תאי אפיתל ממאירים בחזית הגידול הפולשני לבין תאי סטרומה הקשורים לסרטן. זה מושג על ידי הקמת תרביות פיברובלסטים ראשוניות משתלים במעי הגס. השלב השני הוא בניית מודלים של תרבית משותפת אורגנוטיפית באמצעות פיברובלסטים ראשוניים של המעי הגס ותאי סרטן המעי הגס המתורבתים.

הדגמים האורגנוטיפיים הבאים קבועים בפורמין, מחולקים על שקופיות המותקנות על הממברנה ומוכתמים בסגול קרסטל. השלב האחרון הוא מיקרו-דיסקציה בלייזר על מנת להפריד בין תאי גידול פולשים לתאי גידול שאינם פולשים ותאי סטרומה הקשורים לסרטן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכניקות פרופיל מולקולרי כדי לאפיין את הביולוגיה של תאי גידול פולשים ולא פולשים ותאי סטרומה במיקרו-סביבת הגידול שמסביב.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו עד כמה ניתן להבחין בבירור בין תאים פולשים לתאים שאינם פולשים במודלים תלת מימדיים של תרבית משותפת אורגנוטיפית של סרטן המעי הגס. כדי להתחיל, השג דגימות של רקמת רירית המעי הגס האנושית הרגילה ישירות מחדר הניתוח הכירורגי במעבדה. הניחו דגימה במרכז צלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטרים, ולאחר מכן שטפו את התרבית שלוש פעמים עם מי מלח חוצצים פוספט או PBS בתוספת פניצילין, סטרפטומיצין ואזור פטריות.

אין לשאוף לאחר הכביסה הסופית בעזרת מלקחיים סטריליים ואזמל, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות. לאחר מכן הניחו כל חתיכה במרכז צלב שצויר עם להב האזמל. בצלחת של 12 בארות נדנד את האזמל בעדינות מעל הרקמה כדי לאפשר לו להיצמד לתרבית.

הדגימות ב-750 מיקרוליטר של אמצעי גידול פיברובלסטים ראשוניים, שאמורים להטביע את הרקמה מבלי לאפשר לה לצוף. לאחר מכן הכניסו את הדגימות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5 עד 10% CO2 במהלך חמשת הימים הבאים. פיברובלסטים יתחילו לצמוח לאט מקצה הרקמה לאחר כשבעה ימים.

זה יהיה גלוי יותר לאחר כשלושה עד ארבעה שבועות. ואם צומחים מספיק פיברובלסטים, הוסף 750 מיקרוליטר טריפסין לכל באר לאחר שהתאים ניתקו את המאגר והעביר אותם לבקבוק תרבית רקמה T 25 לג'ל אורגנוטיפי ספוג פיברובלסטים. ראשית, הכינו תרחיף תאי פיברובלסטים המכיל 500,000 תאים לג'ל בתוספת dmm.

הרכיבו את הג'לים האורגנוטיפיים על קרח ביחסים המצויים בפרוטוקול הטקסט עבור תשעה ג'לים במיליליטר אחד לג'ל. מכינים 10 מיליליטר ומערבבים בעדינות כדי למנוע בועות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד לכל באר של צלחת 24 באר ודוגרים במשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה.

כדי לאפשר לג'לים להתייצב לאחר שעה, הוסיפו מיליליטר אחד של תוסף DM EM על גבי הג'לים והחזירו לחממה למשך הלילה. למחרת. שאפו מדיום מהחלק העליון של הג'לים וצלחו מיליליטר אחד של מדיום המכיל 500,000 תאי אפיתל של סרטן המעי הגס עבור יריעות הניילון המצופות בג'ל.

הכן מראש יריעות ניילון אוטוקלאבים סטריליות בגודל 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ באמצעות מלקחיים סטריליים. מניחים את המספר הנדרש של יריעות ניילון בכלי תרבות של 10 סנטימטרים. מכינים את תערובת הג'ל על קרח כמתואר בפרוטוקול הטקסט ומוסיפים לתערובת הג'ל 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי עד שהיא הופכת לוורודה, מה שמעיד על כך שהתמיסה נוטרלה.

לאחר מכן הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסה זו לכל יריעת ניילון. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להתייצב. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת 1% גלוטרלדהיד ב- PBS לכל צלחת תרבית של 10 סנטימטר.

לאחר שהג'ל התייצב לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה, יש לשטוף את יריעות הניילון שלוש פעמים ב-PBS ופעם אחת בתוספת dme. דגרו את היריעות למשך הלילה באותו מאגר בארבע מעלות צלזיוס כדי להעלות את הג'לים האורגניים על רשתות פלדה לרשתות פיגומים מעוקרות שהוכנו על ידי קיפול יריעות נירוסטה לתצורת חצובה. לאחר מכן השתמש במלקחיים, מעוקרים ואתנול כדי להניח רשת פלדה בכל באר של צלחת שש בארות.

הניחו יריעת ניילון מצופה ג'ל כשצד הקולגן כלפי מעלה על כל רשת. העבירו בזהירות את הג'לים האורגנוטיפיים מצלחת 24 הבאר ליריעת הניילון המוגבהת בעזרת מרית, מעוקרת ואתנול. ממלאים את הבאר בתוספת D mem עד שיריעת הניילון במגע עם המדיום אך לא שקועה.

ודא שהמדיום אינו נוגע בג'ל האורגנוטיפי. דגירה במשך 14 יום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO2. החלפת המדיום כל יומיים.

מוציאים את כל האורגנוטיפ כולל יריעת ניילון מהבאר ומניחים אותו על ניילון נצמד. חותכים את יריעת האורגנוטיפ והניילון בעזרת אזמל חד פעמי נקי ומקבעים את שני החצאים בפורמלדהיד למשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר, החלף פורמלדהיד ב-70% אתנול לאחר 24 שעות והשאיר למשך הלילה לפני ההטמעה בפרפין, חתך וצביעה לביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר.

החלק הראשון, העובי האורגנוטיפי עד 10 מיקרון על שקופיות המותקנות על הממברנה. לאחר טיפול בקטעים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, התכוננו לבצע מיקרו-דיסקט לייזר באמצעות טופס הפלטפורמה שנבחר. הנח את שקופית הזכוכית עם קטע הכתם לניתוח מיקרוס.

עם הפנים כלפי מטה על שלב המיקרוסקופ, הרכיבו צינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר לתוך קלטת האיסוף והוסיפו 50 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים למכסה שלתוכו תיאסף רקמה מיקרו מנותחת בראייה ישירה. השתמש בג'ויסטיק כדי לזהות את הרקמה המעניינת ובאמצעות ממשק התוכנה, הוסף הערות לחלק האורגני המוכתם, תוך הדגשת תאים להיות מיקרו-דיסקט בחזית פלישת הגידול. הורה ללייזר לירות, שאמור גם לחתוך את החלק המודגש וגם להניע את רקמת המיקרו-דיסקט לתוך המכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה.

המשך לעבד דגימות בשיטה מתאימה כדי לחלץ את האנליט המעניין. תמונות מיקרו-דיסקציה בלייזר של תאי סרטן המעי הגס SW 480 הפולשים לסטרומה האורגנוטיפית מוצגות כאן. סגול קרסטלי משמש להדגשת תאי האפיתל של סרטן המעי הגס.

לאחר מכן מוגדרים איי הגידול הפולשניים לפני שמתרחשת דיסקציה בלייזר והחתיכה החתוכה מועברת למכשיר איסוף. תאים שאינם פולשים ותאי סטרומה מזוהים ומבודדים באותה מתודולוגיה. התרביות התלת-ממדיות נותחו על ידי פרופיל מיקרו RNA להשוואה של מיקרו-RNA המתבטא באופן דיפרנציאלי בין תאים בחזית הגידול הפולשני לאלה באזורי הגידול המרובד.

הנתונים מוינו לפי שינוי מלא וערכי נתונים פלוס או מינוס כפול. מוצגים שינויים מניסוי מייצג המראים ביטוי גן מיקרו RNA דיפרנציאלי בין תאי השוליים הפולשניים לתאי השוליים הלא פולשניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבנות מודלים אורגנוטיפיים מתאימים מבחינה אנטומית וכיצד להשתמש במיקרו-דיסקציה בלייזר כדי לבודד אוכלוסיות בודדות של תאים למחקר נוסף. וואו.