מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפיין את הביולוגיה הייחודית בממשק שבין תאי אפיתל ממאירים בחזית הגידול הפולשנית לבין תאי סטרומה הקשורים לסרטן. דבר זה מושג תחילה על ידי הקמת תרביות ראשוניות של פיברובלסטים משתלים מעיים הגבירה. השלב השני הוא בניית מודלים של תרבית משותפת (co-culture) אורגנוטיפית תוך שימוש בפיברובלסטים ראשוניים מהמעי הגס ובתאי סרטן של המעי הגס והפיקום שגודלו בתרבית.

בשלב הבא, המודלים האורגנוטיפיים מקובעים בפורמלין, נחתכים לשניטות על גבי שקופיות עם ממברנה ונצבעים בצבע קריסטל ויולט. השלב הסופי הוא מיקרודיסקציה בלייזר (laser microdissection) על מנת להפריד תאי גידול פולשים מתאי גידול שאינם פולשים וממתאי סטרומה הקשורים לסרטן. לבסוף, ניתן להשתמש בטכניקות של פרופיילינג מולקולרי כדי לאפיין את הביולוגיה של תאי גידול פולשים ושאינם פולשים ותאי סטרומה במיקרו-סביבה הסביבתית של הגידול.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו עד כמה תאים פולשים ניתנים להבחנה בבירור מתאים שאינם פולשים במודלים תלת-ממדיים של תרבית משותפת אורגנוטיפית של סרטן המעי הגס. ראשית, השג דגימות של רקמת רירית רגילה של מעי אנושי ישירות מחדר הניתוחים במעבדה. הנח דגימה במרכז צלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר, ולאחר מכן שטוף את התרבית שלוש פעמים עם phosphate buffered saline או PBS בתוספת penicillin, streptomycin ו-fungizone.

אין לשאוב לאחר השטיפה האחרונה; בעזרת פינצטה סטרילית וסקלפל, חתכו את הרקמה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, הניחו כל חתיכה במרכז צורת איקס ששורטטה בעזרת להב הסקלפל. בתוך פלטת 12 בארות, נענעו בעדינות את הסקלפל מעל הרקמה כדי לאפשר לה להיצמד למצע התרבית.

הטבילו את הדגימות ב-750 microliters של מצע גידול לפיברובלסטים ראשוניים, באופן שיטביע את הרקמה מבלי לאפשר לה לצוף. לאחר מכן, הניחו את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובריכוז של 5% עד 10% CO2 במהלך חמשת הימים הבאים. פיברובלסטים יתחילו לצמוח לאט מקצות הרקמה לאחר כ-שבעה ימים.

דבר זה יהיה גלוי יותר לאחר כשלושה עד ארבעה שבועות. אם צומחים מספיק פיברובלסטים, יש להוסיף 750 µL של trypsin לכל באר לאחר שהתאים ניתקו, לאסוף אותם ולהעבירם לבקבוק תרבית רקמות T 25 עבור הג'ל האורגנוטיפי הספוג בפיברובלסטים. ראשית, הכין תרחיף תאי פיברובלסט המכיל 500,000 תאים לכל ג'ל ב-dmm מועשר.

הכינו את הג'לים האורגנוטיפיים על קרח ביחסים המופיעים בפרוטוקול הטקסט עבור תשעה ג'לים, בנפח של מיליליטר אחד לכל ג'ל. הכינו 10 milliliters וערבבו בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד לכל באר בלוחית 24 Well והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה.

כדי לאפשר לג'לים להת굳ד לאחר שעה אחת, הוסיפו 1 mL של DMEM מועשר מעל הג'לים והחזירו למדגרה למשך הלילה. למחרת, שאבו את המצע מהחלק העליון של הג'לים וזריעו 1 mL של מצע המכיל 500,000 תאי אפיתל של סרטן מעי גס על גבי גילי הניילון המצופים בג'ל.

הכינו מראש גיליונות ניילון סטריליים שעברו עיקור באוטוקלאב, במידות של 1.5 centimeters על 1.5 centimeters, באמצעות פינצטה סטרילית. הניחו את מספר גיליונות הניילון הדרושים בצלחת תרבית של 10 centimeter. הכינו את תערובת הג'ל על קרח כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, והוסיפו 0.1 molar sodium hydroxide לתערובת הג'ל עד שהיא תהפוך לוורודה, דבר המעיד על כך שהתמיסה נוטרלה.

לאחר מכן, הוסיפו 250 µL מהתמיסה הזו לכל גיליון ניילון. לאחר מכן, הדגירו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה של 5%CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להת굳ד. בשלב הבא, הוסיפו 10 mL של תמיסת glutaraldehyde בריכוז 1% ב-PBS לכל צלחת תרבית של 10 cm.

לאחר שהג'ל התקשח, לפני הדגרה בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך שעה אחת, שטפו את גיליונות הניילון שלוש פעמים ב-PBS ופעם אחת ב-dme מועשר. הדגירו את הגיליונות למשך הלילה באותו באפר בטמפרטורה של four degrees Celsius כדי להעביר את הג'לים האורגנוטיפיים על גבי סריגי פלדה עבור פיגומים סטריליים לפלישה, שהוכנו על ידי קיפול גיליונות פלדת אל-חלד למבנה של חצובה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה שעברה סטריליזציה ב-ethanol כדי להניח סריג פלדה בכל באר של פלטת שש בארות.

הניחו גיליון ניילון מצופה ג'ל, כאשר צד הקולגן פונה כלפי מעלה, על כל רשת. העבירו בזהירות את הג'לים האורגנוטיפיים מפלטת 24 הבארים אל גיליון הניילון המוגבה באמצעות שפכטל שעבר סטריליזציה באתנול. מלאו את הבאר ב-D mem מועשר עד שגיליון הניילון יבוא במגע עם המדיום אך לא ישקע בתוכו.

יש לוודא שהמצע אינו נוגע לג'ל האורגנוטיפי. יש לדגור למשך 14 ימים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה של 5%CO2. יש להחליף את המצע מדי יומיים.

הוצא את התרבית האורגנוטיפית כולה, כולל יריעת הניילון, מהבאר והנח אותה על נייר נצמד. חצאי את התרבית האורגנוטיפית ואת יריעת הניילון באמצעות סכין מנתחים חד-פעמית נקייה וקבע את שני החצאים בפורמלידה למשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר, החלף את הפורמלידה ב-70% ethanol לאחר 24 שעות והשאר למשך הלילה לפני הטמעה בפרפין, חיתוך לדקיקות וצביעה לצורך ביצוע מיקרו-דיסקציית לייזר.

ראשית, נתחים אורגנוטיפיים בעובי 10 מיקרון על גבי שקופיות עם ממברנה. לאחר טיפול בנתחים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, התכוננו לביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר באמצעות הפלטפורמה הנבחרת. הניחו את שקופית הזכוכית עם הנתח הצבוע המיועד למיקרו-דיסקציה.

הנח הפוך על במה של המיקרוסקופ מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר בתוך קסטת האיסוף, והוסף 50 µL של בפר לליזת תאים אל המכסה, אליו ייאספו רקמות המיקרו-דיסקציה תחת ראייה ישירה. השתמש בג'ויסטיק כדי לזהות את הרקמה הרצויה, ובאמצעות ממשק התוכנה, סמן את הסכיבה האורגנית הצבועה, תוך הדגשת התאים המיועדים למיקרו-דיסקציה בחזית הפלישה של הגידול. הנחה את הלייזר לירות, פעולה שאמורה הן לגזור את החלק המודגש והן להדף את רקמת המיקרו-דיסקציה אל תוך מכסה של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה.

המשיכו לעבד את הדגימות בשיטה מתאימה כדי למצות את האנליט המבוקש. תמונות של מיקרו-דיסקציה בלייזר של תאי סרטן מעי גס מסוג SW 480 הפולשים לסתומה האורגנוטיפית מוצגות כאן. Crystal violet משמש להדגשת התאים האפיתליאליים של סרטן המעי הגס.

לאחר מכן מוגדרים איים של גידול פולש לפני ביצוע הדיסקציה בלייזר, והחלק שנחתך מועבר למכשיר איסוף. תאים שאינם פולשים ותאי סטרומה מזוהים ומבודלים באמצעות אותה מתודולוגיה. תרביות השיתוף התלת-ממדיות נותחו באמצעות פרופיל micro RNA כדי להשוות בין microRNAs המובעים באופן דיפרנציאלי בין תאים בחזית הגידול הפולשת לבין תאים באזורי הגידול המדורגים.

הנתונים מוינו לפי שינוי מלא וערכי נתונים של פי שניים פלוס או מינוס. מוצגים שינויים מניסוי מייצג המראים ביטוי דיפרנציאלי של גני micro RNA בין תאי השוליים הפולשניים לבין תאי השוליים הבלתי פולשניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו בונים מודלים אורגנוטיפיים מתאימים מבחינה אנטומית וכיצד להשתמש במיקרו-דיסקציה בלייזר כדי לבודד אוכלוסיות תאים בודדות למחקר נוסף. וואו.