Name: ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למדו לדמות דינמיקה של אנדוזומים במסופי עצב חיים באמצעות דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת אנדוזומים ואינטראקציות בחלל פרה-סינפטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות גרנט NS-024,572 (לRSW).

1. כתם ההכנה עם Supravital צבעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוטוקול נתיחת נחש הבירית לראות סטיוארט et al. 5 וטנג et al. 6 רקמות זוחלות נשארה פיסיולוגיות לזמנים ארוכים יותר, ועם פחות זיהום חיידקים, כאשר כל הזמן בטמפרטורות נמוכות (ראה להלן). רקמות יונקים בדרך כלל נשמרו בטמפרטורת חדר ומעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים צבע חיוני lysosomal, לפזר את הצבע ב1:5,000 הקר הזוחל אצבעות פתרון (0.2 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף מספר פעמים עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי KCl, לדלל את הצבע ב-high-KCl האצבעות 1:500 (7 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 מרבי שניות. שטוף במהירות שלוש פעמים עם אצבעות קרות, ~ דקות 1 / שטיפה. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי hypertonic (סוכרוז), לדלל את הצבע ב0.5 M אצבעות סוכרוז כאמור לעיל. דגירה על 4 &amp; #176; C למשך 2-5 דקות. שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים FM1-43 באמצעות גירוי חשמלי, ראה טנג et al. 6 בקצרה, ההכנה ממוקמת מנה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית וצבע. עצב מגורה עם רכבת מתוכנת מראש של 200 μsec פולסים מלבניים (~ 7 V, 30 הרץ, 18 μsec). שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li></ol> 2. הגדר את ההכנה להדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את ההכנה כך שמבנים של עניין הם קרובים ככל האפשר למטרת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוכה, לנצל את תא תחתון שמכיל להחליק את מכסה עגול דק. בדרך כלל, חדר ההדמיה צריך תחתית נירוסטה דקה עם תלוש 25 מ&quot;מ קוטר # 1 זכוכית עובי כיסוי במרכז. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף, coverslip תחתון הוא לא חובה אבל שימושיכדי לאפשר הדמיה עם אור מועבר (למשל התערבות ההפרש לעומת זאת, DIC) כדי לכוון את הדגימה ולאתר אובייקטים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אובייקטיבי מתאים לקבל את ההחלטה ב3D הגבוהה ביותר האפשרית. ישנן פשרות בין צמצם מספרי (na), מרחק עבודה, הגדלה, וסוג של עדשה (יבש, מים ונפט טבילה). להכנות דקות כמו תרביות רקמה, מטרות נפט הן הטובות ביותר. השימוש במיקרוסקופ זקוף, לצוף להחליק את מכסה על האמבט המימית, ולהשתמש בשמן טבילה בין החלק העליון של להחליק את המכסה והאובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוכנת deconvolution משמשת, הספק עשוי לספק פונקציות שנקבעו מראש נקודת התפשטות (PSFs) למטרות מסוימות. אם אין מידע כזה מסופק, או אם מטרה שאינה נתמכת נבחרה, לקבוע את כוחות הביטחון הפלסטיניים על ידי הדמיה ממוזערת ניאון או אובייקטים עקיפה מוגבל דומים 7,8. </li></ol> 3. להקים את עומק הרצוי של שדה ומספר ImaGES הרצוי לכל מסגרת זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בעומק הכולל של שדה, כך שהעברה או אינטראקציה מבנים של עניין לא נעלמים או ללכת מחוץ לפוקוס, כאשר הם עוברים בכיוון-z. Z-השדה צריך מעט לחרוג מהממד האנכי של התא בתהליך או תא להיות הדמיה. למסופים מנוע חוליות, 15-20 מיקרומטר הוא טיפוסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את צעד Z-ציר צורך שלכל תוספת של מוקד. החלטה לאורך ציר Z-משתנה בהתאם מאפיינים של המטרה; זה בערך רבע מרזולוצית מישור XY. אם אחד confocal הדמיה או תוכנת deconvolution משמשת, ברזולוציה Z-ציר משופרת. שפר את ההחלטה סופית על ידי דגימת יתר מכוונת בכיוון-z 5, אבל ראית גם צעד 3.3 להלן. מרווח צעד אופייני הוא בטווח של 400-1,500 ננומטר למטרות 40-100X. אור צריך להיות מוגף מבין כל תמונת Z-צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר התמונות לZ-מחסנית, כלומר העומק הרצוי של שדה מחולקעל ידי מרווח הצעד. זמן כדי להשלים את Z-מחסנית טיפוסית הוא 1-10 שניות. אובייקטים הנעים במהירות (100 ננומטר / sec) יכולים להופיע מטושטשים בערימת תמונת 3D משום שכל מטוס תמונה מתאים לנקודת זמן שונה במקצת. כמו כן, כל תמונה נוספת תורמת לphotobleaching וphototoxicity האפשרי (ראה דיון). אם אחד המצב נוגע, לבחור Z-צעד גדול יותר כדי לאסוף פחות תמונות לכל מחסנית. לפצות מאוחר יותר באמצעות תוכנת אינטרפולציה תמונה (שלב 6.3 בהמשך). </li></ol> 4. בחר מסגרת שיעור הזמן לשגות בחירה לפי ניסויי שיעור, כי הוא פשוט מספיק כדי לפתור בצורה חלקה משתנה עם זמן, כגון תנועה, אינטראקציות או אירועי היתוך 9. על פי דגימה יכולה לייצר חפצי תנועה (טעויות דגימה), ואילו דגימת יתר שלא לצורך מגדילה את החשיפה לאור. לאסוף או רצף ארוך אחד או כמה רצפים חוזרים ונשנים של אותה הכנה, כל אחד עם סך מרווח קטן יחסית בזמן ( <e10 נקודות זמן x מרווח = 5 דקות 30 שניות&gt; מ &#39;לדוגמא). במידת האפשר, להציג את ההכנה עם תאורת epifluorescence מתמשכת בערך מהירויות תנועת הערכה, כולל סחיפה של כל ההכנה אם הוא קיים. 5. להשלים את כל הדמית החיה להכנה מסוימת הכנות זוחלים בדרך כלל להישאר חזקות עבור ~ שעה 1-2, יותר אם מקוררות. 6. לנתח את הנתונים על פי שימוש רצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את כל קבצי הנתונים הגולמיים. בעוד אחסון דיגיטלי הוא בדרך כלל לא בעיה, זמן עיבוד הוא משמעותי גם עם מחשבים אישיים מהירים או תחנות עבודה. מסיבה זו, יבול תמונות לתוך אזור של [ROI] ריבית. להבטיח כי האזור כולו של עניין הוא בחלון שנחתכו במהלך הזמן כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve תמונת ערימות באמצעות תוכנה מתאימה ופונקצית נקודת ההתפשטות הנכונה. לאשר החלטה שהוא השתפר וששום חפץ כבר נוצר על ידיאלגוריתם deconvolution. איור 3 מציג תמונות ירושלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלגוריתם אינטרפולציה להרחיב רזולוציה לכאורה Z-ציר. התרחבות 6X מהפרדת מטוס בפועל תמונת 1.5 מיקרומטר להפרדת מיקרומטר לכאורה 0.25 הוא הציע. לחלופין, להשתמש בחלק שילוב של דגימת יתר (שלב 3.2) ואינטרפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניגודיות, בהירות, סינון רעש, photobleaching והתאמות עיבוד תמונה טיפוסיות אחרות אם תרצה בכך. סטנדרטים תמונת מניפולציה להכתיב כי עבור רוב העבודה מדעית, מן ראוי שאותם התיקונים שיחולו על כל התמונות, גם בתוך ערימה ובנקודות זמן שונות. התוצאה של התאמה מסוימת יש לבחון בין כל התמונות 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מצב תצוגה מיוחד ליצוא של נתונים. התצוגה הברורה ביותר היא וידאו סטריאו או באמצעות anaglyphs אדום ירוק או אדום הכחול (דוגמאות באיור 3), זוגות סטריאו, או לסירוגין שמאל / righהעין לא מסגרות עם משקפיים תריס. Anaglyphs מוגבל לצבע יחיד. שפר את עומק תמונה נראית לעין אם תרצה בכך כדי לשפר את הרזולוציה חזותית Z-ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנסות בשיפור טכניקות סינון ותמונה שונות. לדוגמא, סינון Laplacian שימושי כדי להגדיל את הניגודיות של מבנים קטנים מעל רקע. הבהירות של פיקסלים במרכזו של חלון הפעלה משופרת תוך בהירות של הסביבה היא מופחתת. שים לב שכמה שיטות סינון אינן פועלות היטב בשילוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תיקון להיסחף אם יש תנועה משמעותית של התכשיר לאורך זמן. תנועה כזו היא נפוצה בחיים שריר, אפילו עם סמים הוסיפו לדכא את פוטנציאל פעולה ופוטנציאל הסינפטי. אלגוריתם רישום פיקסל (למשל. Imaris, תוצאות הלוואי של Adobe, תוסף TurboReg לImageJ) מיישר זמן לשגות תמונות ויכול להפחית, אבל בדרך כלל לא לבטל לחלוטין, תנועה כזו. </li></ol>

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li>
<li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li>
<li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late%22+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li>
<li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li>
<li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+images+are+data%3A+and+should+be+treated+as+such%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).</li>
<li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li>
<li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+active+zones%3A+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li>
<li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+TTT+%22Microscopy%3A+Science%2C+Technology%2C+Applications+and+Education%22">Microscopy: Science, Technology, Applications and Education</a>. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).</li>
<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההיבט הקריטי ביותר של ההדמיה 4D הוא ניהול של המשך ועוצמת חשיפה לאור. Photobleaching יורד יחס אות לרעש בתמונה ויכול להיות בעייתי או לא תלוי בגורמים שונים, לרבות בחירה של fluorophores. נזק ספציפי לרקמת חיה (phototoxicity) קשור לphotobleaching, ולעתים ניתן לזהות באמצעות בדיקות ניאון נועדו למטרה 2,12 או על ידי בדיקה של מורפולוגיה עם אופטיקה brightfield המתאימה, כגון התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC). זה אפשרי,...

זמן לשגות הדמיה של רקמת חיה מספקת גישה חזותית ליחסי תפקוד והמבנה דינמיים, שלא ניתן להערכה בהכנות קבועות או חיים צילמו בנקודה אחת בזמן. לעתים קרובות, עם זאת, שהתגמול עבור גישה למידע זמני הוא ירידה ברזולוציה אופטית. מטרות נפט טבילה צמצם מספרי גבוהה הן מעשיות ברקמת חיה בגלל הטווח הצר שלהם בפוקוס, והשאירו את הטבילה במים או מטרות יבשות כחלופות בלבד. יתר על כן, ברזולוציה המוגברת המוענקת על ידי אופטיקה confocal לא יכולה להיות מנוצל בכמה הכנות חיים בשל phototoxicity מהרמות גבוהות היחסי של תאורה הנדרשת 1,2. לבסוף, בעוד כמה שיטות אופטיות בזמן אמת או זמן לשגות זמינות שרזולוציה משופרת ההצעה, תחולתם מוגבלת להכנות שבו מבנים של עניין יכולים להיות ממוקמות בתוך כמה מאה ננומטרים של המטרה 1. השיטה המתוארתעושה שימוש בציוד בעלות נמוכה יחסית, הוא תכליתי, ובכל זאת מציעה רזולוציה משופרת בהשוואה לטכניקות זמן לשגות יותר נפוץ בשימוש. הוא מיועד לשימוש במעבדות בודדות, כמו גם מתקני הדמיה. השיטה משתמשת במיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונלי, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית רגישה ועם חומרה שנועדה לרכוש במהירות סטים של תמונות במישורים שונים מעט מוקד (Z-ערימות). כל Z-מחסנית היא deconvolved דיגיטלי כדי להגדיל את הרזולוציה. תכונה אחת של 3D הדמיה זמן לשגות (4D) היא מעקב מדויק של העברת אברונים או מבנים אחרים. כאשר להגדיר כראוי, מבנים צילמו לא לצאת מפוקוס, ותנועה בכל שלושת הכיוונים ניתן להבחין ולכמת. לכן זה בלתי אפשרי עבור מבנה מוכתם להיעלם מעל מסגרות זמן לשגות אחד או יותר רק על ידי היסחפות מעל או מתחת למישור מוקד צר. השיטה משמשת גם ככלי רגיש להערכת האינטראקציות ופו האפשרישיאון של מבנים קטנים. epifluorescence הקונבנציונלי או תמונות confocal של מבנים סמוכים לגבול ההשתברות (כמה מאה ננומטר) לא לאשר מיזוג גם אם תמונות התמזגו להראות חפיפה של התוויות שלהם 3. היתוך הוא הציע, אבל זה עדיין אפשרי שהאובייקטים מופרדים אופקי או אנכי על ידי מרחק שהוא מתחת לגבול ההשתברות. שלוש או הדמיה ארבעת ממדים, לעומת זאת, מאפשרת צפייה באובייקטים בכל אחד משלושה כיוונים מאונך. המראה של היתוך בכל שלוש התצוגות מגדיל את רמת הוודאות. וגם, בכמה הכנות חיים, בבימוי או תנועה הבראונית של אובייקטים התמזגו putatively מספקת הוכחה נוספת, כאשר שני התוויות לנוע יחד בזמן. כמובן, כאשר סמוך לגבול השתברות רמת הוודאות במבני הבחנה מהרקע, או שמראה שהם מכילים שני צבעים (היתוך), אינה מוחלטת. אם טכניקות ישימות, מיוחדות, כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג)4, הם מתאימים יותר.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>ביוטיום, הייוורד, קליפורניה</td><td>70057</td><td>קונקציה סופית: 10 מ"מ</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>F35335</td><td>קונקציה סופית: 7 מ"מ</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, קרלסבד, CA</td><td>L7528</td><td>קונקציה סופית: 0.2 מ"מ</td></tr><tr><td>צלצולי זוחלים pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 מ"מ</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5 מ"מ</td></tr><tr><td>CaCl<תת>2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>זוחל KCl גבוה רינגרים pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 מ"מ</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 מ"מ</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 מ"מ</td></tr><tr><td>צלצולי סוכרוז גבוהים pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 מ"מ</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5 מ"מ</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 מ"מ</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td></td><td></td><td>0.5 מ' (17.1 גרם/50 מ"ל)</td></tr><tr><td>Axioplan 200 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a</td></tr><tr><td>>N-Achroplan 63X מטרת מים; n.a.=0.9; מרחק עבודה = 2.4 מ"מ &nbsp;</td><td>קארל זייס, ת'ורנווד, ניו יורק</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 שילוב מקור אור/מסנן עירור מחליף גלגלים</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>175W מנורת קשת קסנון</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; מחליף גלגל מסנן פליטה</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Sensicam CCD מצלמה</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD</td><td>מצלמה פוטומטרית, טוסון, AZ</td><td></td><<td>a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>כלי הדמיה- תוצרת בית - קוטר 11 ס"מ; קוטר 25 מ"מ. כיסוי #1 מוטבע; פינים מגנטיים</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>חידושי הדמיה חכמים, דנבר, CO</td><td>Deconvolution; תיקון סחיפה; הצגת נתונים בתלת-ממד ו-4D</td><td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, תיקון CT</td><td>Drift; הצגת נתונים בתלת-ממד ו-4D</td><td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, סן חוזה, קליפורניה</td><td>תיקון</td> <td>דריפט<a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות, בת'סדה, MD</td><td>תוספים מרובים זמינים; בניית זוג סטריאו</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>בניית זוג סטריאו</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של endosome dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

ארבעה ממדים (4D) אור הדמיה נעשתה שימוש כדי ללמוד את ההתנהגות של מבנים קטנים בתוך מסוף עצב המוטורי של transversus abdominis שריר הרזה של נחש הבירית. הנתונים גולמיים כוללים רצפים של Z-ערימות 3D זמן לשגות. כל ערימה מכילה 4-20 תמונות שנרכשו עם אופטיקה epifluorescence במטוסי מוקד מופרדים על ידי 400-1,500 ננומטר. שלבים ברכישת ערימות של תמונות, כגון התאמה של מיקוד, מיתוג של אורכי גל עירור, ותפעול של המצלמה הדיגיטלית, הם אוטומטיים ככל האפשר על מנת למקסם את קצב תמונה ולמזער את הנזק לרקמות כתוצאה מחשיפה לאור. לאחר רכישה, קבוצה של ערימות תמונה deconvolved כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית, שהומר לפורמט 3D הרצוי, ומשמש ליצירה &quot;סרט&quot; 4D כי הוא מתאים למגוון רחב של ניתוחים מבוססי מחשב, בהתאם לנתונים הניסיוניים ביקשו. יישום אחד הוא מחקר של ההתנהגות הדינמית של שתי מעמדות של endosomes מצאו במסופים-macroendosomes עצב (MES)וendosomes חומצי (AES), שגדלים (200-800 ננומטר עבור שני הסוגים) הן ליד או לגבול ההשתברות. גישה למידע 3D בכל נקודת זמן מספקת מספר יתרונות על פני הזמן לשגות הדמיה קונבנציונלית. בפרט, גודל ומהירות תנועה של מבנים ניתן לכמת לאורך זמן ללא אובדן המיקוד חד. דוגמאות לנתונים מהדמית 4D עולים כי MES ניגש קרום הפלזמה ונעלמים, מה שמרמז שהם exocytosed ולא רק נעים אנכי ממישור אחד של מוקד. חשף גם הוא היתוך משוער של MES ו-AES, על ידי הדמיה של חפיפה בין שני המבנים המכיל צבען כפי שנצפו בכל שלוש תחזיות המאונכות.

הנתונים שמוצגים הם ממסופי התוקפת נחש (לראות תצוגות ההגדלה נמוכות וגבוהות באיור 3; צבע endocytic (FM1-43) הספיגה יוצר אובך שממלא כל אחד בוטון), ובפרט, macroendosomes (MES) וendosomes חומצי (AES) בתוך מסופים אלה 5. MES נוצרים על ידי אנדוציטוזה בתפזורת במהלך פעילות עצבית 10 ומספרם יורד באופן אקספוננציאלי עם זמן לאחר הפעילות חדלה 6. שימוש בהדמיה לחיות 4D היה לקבוע אם MES לנוע לעבר קרום הפלזמה ובמהירות נעלמת, טוען כי מספרם יורד כי חלק מ...

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדמיה מדויקת של אנדוזומים במרחב תלת-ממדי לאורך זמן, או בארבעה ממדים. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה של שרירי נחש וסידור הרקמה בצלחת ההדמיה. השלב השני הוא צביעת הרקמה בצבעים חיים כדי לעורר היווצרות של אנדוזומים.בשלב הבא, התכשיר נדגם באמצעות דימוי בארבעה ממדים עבור צומת נוירו-שרירי אחד או יותר. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים קפדני לאפיון התנהגותם של מקרו-אנדוזומים. בסופו של דבר, ניתן להדגים את נוכחותם ותנועתם של אנדוזומים לאורך זמן בתוך המרחב הפרה-סינפטי באמצעות דימוי פלואורסצנציה בארבעה ממדים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששריר הבטן של הנחש בעל עובי של סיב בודד בלבד, מה שמאפשר הפקת תמונות באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיסטנדרטית. בפרוטוקול זה יעשה שימוש בהכנות רקמה מנחש גטר. יש לשמור רקמה של זוחלים בטמפרטורות נמוכות, כדי שתישאר פיזיולוגית למשך זמן רב יותר ועם פחות זיהום חיידקי. לצביעה חיונית של ליזוזומים, ממיסים את הצבע ביחס של 1 ל-5,000 בתמיסת רינגר לזוחלים קרה.כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 µM, יש להוסיף את הצבע לרקמה ולהדגיר בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, יש לשטוף את הרקמה מספר פעמים ב-Ringer קר עבור כל צביעת FM 1 43. יש לקבע מראש את הדגימה בצלחת דימות עם פינים מגנטיים לפני הצביעה.לצורך סרטון זה, יודגם רק צביעת FM 1 43 באמצעות גירוי של אשלגן כלוריד. הצבע, המדולל ביחס של 1 ל-500 בתמיסת רינגר עם ריכוז גבוה של אשלגן כלוריד כדי להגיע לריכוז סופי של 7 µM, מתווסף לרקמה, ולאחר מכן הרקמה מדגרה בטמפרטורה של 4 °C למשך מקסימום 30 עד 60 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף במהירות שלוש פעמים בתמיסת רינגר קרה, למשך כדקה לכל שטיפה.יש לדמות את כל הרקמות בהקדם האפשרי לאחר הצביעה והשטיפה בתמיסת ringer קרה. במידה ונעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך, יש להשתמש בתא דימוי שבתחתיתו נמצאת כיסוי זכוכית עגול ודק. בדרך כלל, לתא הדימוי צריכה להיות תחתית דקה מפלדת אל-חלד בקוטר של 25 millimeter.הנח זכוכית כיסוי בעובי מספר 1 במרכז כדי להכין את הדגימה לצילום. כוון אותה באמצעות פינים מגנטיים כך שהשריר יהיה ממורכז ככל האפשר בתוך צלחת הצילום ומונח בצורה השטוחה ביותר. כסה את הדגימה בנפח קטן של תמיסת ringer.הנח את הצלחת על הבמה, כשהיא קרובה ככל האפשר למרכזה. בחר עדשה מתאימה כדי להשיג את רזולוציית התלת-ממד הגבוהה ביותר. בכל הניסויים במדגם זה תהיה בשימוש עדשת 63 x במים.כדי להתחיל בפרוצדורה זו, פתחו את חלון הדימוג ב-slide book 5.0. מספר תפריטים מופיעים כאן בלשוניות. בחרו בעדשה 63 x water באמצעות הלשונית השנייה Z. הגדירו את המרווח עבור ה-Z stack.בדוגמה זו, נעשה שימוש בצעד Z של 1.5 microns עבור דימוי חי. בחרו את קצב הפריימים של ה-time-lapse. קצב אופטימלי הוא קצב המספיק כדי להבחין בצורה חלקה בשינויים לאורך זמן, כגון אינטראקציות של תנועה או אירועי היתוך.לדוגמה, 10 נקודות זמן במרווחים של 32 שניות עבור פרק זמן כולל של חמש דקות. לאחר מכן, בחרו את עומק השדה הכולל תוך הצגת התצוגה החיה הסופית כשהיא ממוקדת ידנית לחלק העליון של מיקוד העניין, ולאחר מכן עלו מעט מעליו. בחרו ב-"set top".בצעו מיקוד איטי דרך הדגימה עד שכל החלקים יהיו מחוץ למיקוד. שוב, מספר המישורים וערכי המהלך הכולל שיוצגו יצביעו על עומק השדה שנבחר בחלון הלכידה. בחרו בכפתור הבחירה "used top and bottom positions" כדי להעביר את הפרמטרים שנבחרו הרגע. לצורך לכידת תמונה, התחילו ברכישת התמונה.השלימו את כל תהליך הדימוי החי עבור דגימה מסוימת. שמרו את כל קובצי נתוני הגלם, שכן בדרך כלל אין בעיה של אחסון דיגיטלי. זמן העיבוד הוא משמעותי, גם בשימוש במחשבים אישיים מהירים או בתחנות עבודה.מסיבה זו, חתכו את התמונות לאזור העניין (ROI) והבטיחו כי כל אזור העניין נמצא בתוך החלון החתוך לאורך כל הזמן. שלב D עשוי לכלול מחסניות תמונות (image stacks) תוך שימוש בתוכנה מתאימה ובפונקציית פיזור נקודתי (point spread function) נכונה; ודאו כי הרזולוציה השתפרה וכי אלגוריתם הדקונבולוציה לא יצר ארטיפקטים. השתמשו באלגוריתם אינטרפולציה להרחבת ציר Z.מוצעת רזולוציה נראית, המהווה הגדלה פי שש מהפרדה בפועל של 1.5 מיקרון במישור התמונה להפרדה נראית של 0.25 מיקרון. בצע התאמות של ניגודיות ובהירות, סינון רעשים, הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) והתאמות עיבוד תמונה טיפוסיות אחרות, במידת הצורך.תקני העיבוד של תמונות קובעים כי עבור רוב העבודות המדעיות, נכון להחיל את אותם תיקונים על כל התמונות, הן בתוך ערימה (stack) והן בנקודות זמן שונות. יש להעריך את השפעתה של התאמה מסוימת על כל התמונות. התנסו בטכניקות שונות של סינון ושיפור תמונה.לדוגמה, ביצוע לוֹפּים (lelos) וסינון יעילים להגברת הניגודיות של מבנים קטנים מעל הרקע. בהליך זה, בהירות הפיקסלים במרכז חלון נע (running window) מוגברת, בעוד שבהירות האזורים שסביבו מופחתת. יש לשים לב שחלק משיטות הסינון אינן עובדות היטב בשילוב אחת עם השנייה.יש להחיל תיקון סחיפה (drift correction) אם קיימת תנועה משמעותית של הדגימה לאורך זמן. תנועה כזו נפוצה בשריר חי, גם כאשר מתווספות תרופות להדכאת פוטנציאלי פעולה ופוטנציאלים סינפטיים. אלגוריתם לרישום פיקסלים (pixel registration) מיישר את תמונות ה-time lapse ויכול להפחית, אך בדרך כלל לא לבטל לחלוטין, תנועה כזו.במחקר זה, נעשה שימוש בדימות חי בתלת-ממד של סיומות נוירו-שריריות בנחש כדי לקבוע אם מקרו-אנדוזומים או me נעים לעבר ממברנת הפלזמה ונעלמים במהירות, מה שמרמז כי מספרם פוחת כיוון שחלקם מגיעים ל-cyto. הנתונים מוצגים כתצוגות נפח תלת-ממדיות בשישה נקודות זמן עם מרווח פריימים של 60 שניות. כדי להדגים את עומק ה-Z של בוטון בודד, ניתן להבחין ב-me נעה הרחק מציר ה-Y המסומן בקו מקווקו אדום לאורך מספר פריימים לפני היעלמותה בין נקודות הזמן חמש ושש; העובדה שהזמן שנדרש להיעלמות היה קצר ממרווח הפריימים עולה בקנה אחד עם אקסוציטוזה רגע לפני ההיעלמות.נראה כי ה-ME ממוקם בממברנה הפלסמטית של ה-baton. אותו סט נתונים גולמי מוצג לאחר מכן כסרטון בהגדלה נמוכה יותר. הרצף נעצר לזמן קצר בתחילתו של כל סבב של 24 שלבי סיבוב תלת-ממדיים סביב ציר Y, כדי להפנות את תשומת הלב ל-me שעומד להיעלם, כפי שמצוין על ידי החץ האדום.שימו לב כי ה-ME נראה כשהוא מתקרב לקצה הכפתור, נעלם ואינו חוזר בכל זוויות הצפייה. בשל רזולוציה נמוכה יותר בציר Z בהשוואה לרזולוציית XY, צורת ה-ME נראית כמתארכת ומתקצרת בהתאם לזווית הצפייה. מחקרי מיקרוסקופיה אלקטרונית הראו כי אנדוזומים בטרמינלים מוטוריים הם קטנים בגודלם וקרובים לגבול הדיפרקציה של האור.לפיכך, לא ניתן להבחין באופן מוחלט בין איחוי של אנדוזומים אלו לבין קרבה מרחבית ברמת מיקרוסקופיה של אור. במחקר זה, Mees סומנו ב-FM 1 43 המופיע בירוק, ואנדוזומים חומציים (AEs) סומנו בצבע ליסוזומלי חי המופיע באדום. נתונים מנקודת זמן אחת של סרטון בתלת-ממד מוצגים כתצוגות נפח בתלת-ממד בשלושה כיוונים.הלוחות העליונים אחד עד שלו מציגים את המבט המקובל מלמעלה של מישור XY. הלוחות האמצעיים ארבע עד שש מציגים מבט בניצב למישור XY ובכיוונו של החץ האדום הגדול. הלוחות התחתונים שבע עד תשע מציגים מבט הניצב לשני המבטים לעיל, ובכיוונו של החץ הכחול הגדול.ME מסומן בחץ ירוק ושני AE מסומנים בחצים אדומים. במקרים בודדים נצפו ברשומות של תמונות D ארבעה מבנים שפלורסצנטיים בשני הצבעים, אשר נראים בצבע צהוב. בדוגמה זו, אנדוזום המכיל את שני הצבעים מסומן בחץ צהוב בלוחות שלושה, שישה ותשעה.חפיפת הצבעים האדום והירוק היא מלאה במידה שווה בכל שלוש ההטלות האורתוגונליות, מה שמעיד על putative fused em me ae. סרטון זה מציג את אותו מערך נתונים המוגדר להסתובב סביב ציר Y בקצב של פריים אחד לשנייה. ה-putative fused MEAE נותר בצבע צהוב מכל נקודות המבט.דה-קונבולוציה דיגיטלית (Digital deconvolution) היא כלי שימושי לשיפור הרזולוציה של תמונות בתלת-ממד (3D) וכן בת arba-ממד (4D). כאן מוצגת השוואה בין נתונים גולמיים לנתונים שעברו דה-קונבולוציה. עבור טרמינל עצב טיפוסי של נחש שנצבע בזמן גרייה עם FM 1 43. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך 30 עד 60 דקות אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון קולוקליזציה של מקרו-אנדוזומים עם סמנים פרה-סינפטיים.

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

מקור:  Boyer, N. P. et. al., הדמיה וניתוח של הובלת נוירופילמנטים בעצב השוק של עכבר שנכרת. J. Vis. exp.} (2020)}{{}}}סרטון זה מדגים את שיטת הפוטו-אקטיבציה הפלואורסצנטית לניתוח הובלת נוירופילמנטים באקסונים מיאליניים של עצבים היקפיים. על ידי מעקב אחר נוירופילמנטים ירוקים מתויגים בפלואורופור, הטכניקה מספקת תובנות לגבי הובלה אקסונלית במחלות ניווניות.

הדמיית פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית של הובלת נוירופילמנטים באקסונים של עכברים עם מיאלין 

מקור: Zhilyakov, N. V. et al., רישום מעברי סידן בצומת עצבי-שרירי של עכבר עם רזולוציה זמנית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את טכניקת ההדמיה של הקלטת מעברי סידן מהירים בקצות העצבים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. על ידי גירוי העצב ולכידת שינויים פלואורסצנטיים מצבעים קושרי סידן, הוא מדמיין זרם סידן דינמי ופינוי בקצה העצב, ומציע תובנות מדויקות לגבי פעילות סינפטית ואיתות עצבי-שרירי.

הדמיה של מעברי סידן מהירים בקצות עצבים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

למדו לדמות דינמיקה של אנדוזומים במסופי עצב חיים באמצעות דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת אנדוזומים ואינטראקציות בחלל פרה-סינפטי.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

גלה סרטונים נוספים