ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות במדויק אנדוזומים במרחב תלת מימדי לאורך זמן או בארבעה מימדים. זה מושג על ידי ניתוח שרירי הנחש וסידור הרקמה בצלחת ההדמיה. השלב השני הוא צביעת הרקמה בצבעים חיוניים כדי לעורר היווצרות אנדוזום.

לאחר מכן, התכשיר מצולם בארבעה מימדים עבור צומת עצבי-שרירי אחד או יותר. השלב האחרון הוא ניתוח נתונים קפדני כדי לאפיין את התנהגות האנדוזומים המאקרו. בסופו של דבר, ניתן להדגים את נוכחותם ותנועתם של אנדוזומים לאורך זמן בתוך המרחב הפרה-סינפטי על ידי הדמיה פלואורסצנטית ארבע-ממדית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששריר הבטן של הנחש הוא בעובי סיב בודד בלבד, מה שמאפשר ליצור תמונות באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי סטנדרטי תכשירי רקמות מנחש הבירית ישמשו בפרוטוקול זה. יש לשמור על רקמת זוחלים בטמפרטורות נמוכות, כך שהיא תישאר פיזיולוגית לזמן ארוך יותר ועם פחות זיהום חיידקי. עבור צביעת צבע חיוני ליזוזומלי, הצבע מומס בין 1 ל-5,000 בתמיסת צלצולי זוחלים קרים.

כדי לקבל ריכוז סופי של 0.2 מיקרומולר, מוסיפים את הצבע לרקמה ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות יש לשטוף את הרקמה מספר פעמים עם צלצולים קרים לכל מכתמי FM 1 43. הרכיבו מראש את הדגימה בצלחת הדמיה עם פינים מגנטיים לפני הצביעה.

לצורך סרטון זה, יודגם רק צביעת FM 1 43 באמצעות גירוי אשלגן כלורי. הצבע מדולל בין 1 ל-500 בצלצולי אשלגן כלורי גבוהים כדי לקבל ריכוז סופי של שבעה מיקרומולר מתווסף לרקמה, ואז הרקמה מודגרת בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 שניות לכל היותר. לאחר מכן, שטפו במהירות שלוש פעמים עם צלצולים קרים למשך כדקה לשטיפה.

יש לדמות את כל הרקמות בהקדם האפשרי לאחר שהוכתמו ונשטפו בתמיסת צלצול קרה. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך, השתמש בתא הדמיה שתחתיתו מכילה כיסוי עגול דק. בדרך כלל, תא ההדמיה צריך להיות בעל תחתית דקה מפלדת אל-חלד בקוטר 25 מילימטר.

כיסוי זכוכית בעובי מספר אחד מחליק במרכז כדי להגדיר את ההכנה להדמיה. כוון אותו באמצעות סיכות מגנטיות כך שהשריר יהיה מרוכז בצורה הטובה ביותר האפשרית בתוך צלחת ההדמיה ומונח שטוח ככל האפשר. מכסים את התכשיר בנפח קטן של תמיסת צלצול.

הרכיבו את המנה, הניחו אותה קרוב ככל האפשר למרכז הבמה. בחר מטרה מתאימה כדי להשיג את הרזולוציה התלת-ממדית הגבוהה ביותר האפשרית. יעד מים של 63 x ישמש לכל הניסויים בהדגמה זו.

כדי להתחיל בהליך זה, פתח את חלון ההדמיה בחוברת השקופיות 5.0. מספר תפריטים כלולים כאן בכרטיסיות. בחר את מטרת 63 x מים באמצעות הכרטיסייה השנייה Z.הגדר את מרווח המחסנית Z.

בדוגמה זו, שלב Z של 1.5 מיקרון משמש להדמיה חיה. בחר את קצב הפריימים של קיטועי זמן. קצב אופטימלי הוא כזה שמתאים בדיוק כדי לפתור בצורה חלקה שינויים עם הזמן, כגון אינטראקציות תנועה או אירועי היתוך.

לדוגמה, 10 נקודות זמן במרווחים של 32 עבור מרווח זמן כולל של חמש דקות. לאחר מכן, בחר את עומק השדה הכולל תוך הצגת הטרמינל בשידור חי ממוקד ידנית לחלק העליון של מוקד העניין, ולאחר מכן עבור מעט מעליו. בחר ממיר.

התמקד לאט דרך הדגימה עד שהכל יוצא מהמיקוד. שוב, מספר המטוסים וערכי הנסיעה הכוללים המוצגים יציינו את עומק השדה שנבחר בחלון הלכידה. בחר את לחצן הבחירה במיקום העליון והתחתון הנמצא בשימוש כדי להעביר את הפרמטרים שנבחרו זה עתה עבור לכידת תמונה, התחל ברכישת תמונה.

השלם את כל ההדמיה החיה עבור תכשיר מסוים. שמור את כל קבצי הנתונים הגולמיים בזמן שאחסון דיגיטלי בדרך כלל אינו מהווה בעיה. זמן העיבוד משמעותי גם עם מחשבים אישיים מהירים או תחנת עבודה.

מסיבה זו, חיתוך תמונות לאזור עניין מבטיח שכל אזור העניין יהיה בחלון שנחתך במשך כל הזמן. קורס D יכול לכלול ערימות תמונות באמצעות תוכנה מתאימה ופונקציית התפשטות הנקודה הנכונה, לאשר שהרזולוציה משופרת וששום חפץ לא נוצר על ידי אלגוריתם הדה-קונבולוציה. השתמש באלגוריתם אינטרפולציה כדי להרחיב את ציר Z.

מוצעת רזולוציה נראית לעין, הרחבה של פי שישה מהפרדת מישור תמונה בפועל של 1.5 מיקרון להפרדה לכאורה של 0.25 מיקרון. בצע בהירות ניגודיות, סינון רעשים, הלבנת תמונות והתאמות אופייניות אחרות לעיבוד תמונה. אם תרצה.

תקני מניפולציה של תמונות מכתיבים שעבור רוב העבודה המדעית, ראוי שאותם תיקונים יוחלו על כל התמונות הן בתוך ערימה והן בנקודות זמן שונות. יש להעריך את התוצאה של התאמה מסוימת בין כל התמונות. התנסה בטכניקות סינון ושיפור תמונה שונות.

לדוגמה, lelos וסינון שימושיים להגברת הניגודיות של מבנים קטנים מעל הרקע. בהירות הפיקסלים במרכז חלון רץ משופרת בעוד שהבהירות של האזורים שמסביב מופחתת. שים לב ששיטות סינון מסוימות אינן פועלות היטב בשילוב.

החל תיקון סחיפה אם יש תנועה משמעותית של התכשיר לאורך זמן. תנועה כזו נפוצה בשרירים חיים, אפילו עם תרופות שנוספו כדי לדכא פוטנציאל פעולה ופוטנציאל סינפטי. אלגוריתם רישום פיקסלים מיישר את תמונות ה-time lapse ויכול להפחית, אך בדרך כלל לא לבטל לחלוטין תנועה כזו.

במחקר זה, נעשה שימוש בהדמיה חיה של ארבעה D של מסופים עצביים-שריריים של נחש כדי לקבוע אם אנדוזומי מאקרו או אני נעים לעבר קרום הפלזמה ונעלמים במהירות, מה שמרמז על כך שמספרם יורד מכיוון שחלקם ניגשים לציטו. הנתונים מוצגים כתצוגות נפח תלת-ממדיות בשש נקודות זמן עם מרווח פריימים של 60 שניות. כדי להמחיש את עומק ה-Z של בוטון בודד, ניתן לראות me מתרחק מציר ה-Y המסומן על ידי הקו המקווקו האדום על פני מספר פריימים לפני היעלמותו בין נקודות הזמן חמש ושש, שהזמן הנדרש להיעלמות היה קצר ממרווח הפריימים עקבי עם אקסוציטוזיס ממש לפני ההיעלמות.

נראה שה-ME ממוקם בקרום הפלזמה של האלות. אותו מערך נתונים גולמי מוצג בהמשך כסרט בהגדלה נמוכה יותר. הרצף מושהה לזמן קצר בתחילת כל 24 צעדי סיבוב תלת-ממדיים סביב ציר ה-Y כדי למשוך את תשומת הלב ל-me העומד להיעלם בקרוב המסומן על ידי החץ האדום.

שימו לב שה-ME נראה מתקרב לקצה הבוטון נעלם ואינו חוזר בכל נקודות המבט של הצפייה. בגלל רזולוציית ציר Z נמוכה יותר בהשוואה לרזולוציית XY, נראה שצורת ה-ME מתארכת ומתקצרת בהתאם לנקודת המבט של הצפייה. מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים הראו כי אנדוזומים במסופי המנוע קטנים בגודלם קרוב לגבול העקיפה של האור.

לפיכך, לא ניתן להבחין באופן מוחלט בין היתוך של אנדוזומים אלה לבין אסוציאציה מרחבית קרובה ברמת האור. במחקר זה, Mees סומנו עם FM 1 43 המצוין באנדוזומים ירוקים וחומציים או AEs סומנו עם ליזוזומלי. צבע חיוני המצוין בנתונים אדומים מנקודת זמן אחת של סרט ארבעה מימד מוצגים כתצוגות נפח תלת מימד בשלושה כיוונים.

הפאנלים העליונים 1 עד 3 מציגים את הנוף הקונבנציונלי מעל מישור ה-XY. הלוחות האמצעיים 4 עד 6 מראים מבט בניצב למישור XY ובכיוון החץ האדום הגדול. הלוחות התחתונים שבע עד תשע מציגים מבט בניצב הדדי לשתי התצוגות שלמעלה בכיוון החץ הכחול הגדול.

אני מסומן על ידי חץ ירוק ושני AEs מסומנים על ידי חיצים אדומים. מבנים שזרחו בשני הצבעים שנראו צהובים צוינו מדי פעם בארבע רשומות תמונה D. בדוגמה הזו, אנדוזום שמכיל את שני הצבעים מסומן על ידי חץ צהוב בלוחות שלוש, שש ותשע.

החפיפה של אדום וירוק שלמה באותה מידה בכל שלושת ההקרנות האורתוגונליות המצביעות על התמזגות משוערת של em me ae. סרטון זה מציג את אותו מערך נתונים המוגדר להסתובב על ציר Y בפריים אחד לשנייה. ה-MEAE המותך לכאורה נשאר צהוב מכל הפרספקטיבות.

דה-קונבולוציה דיגיטלית היא כלי שימושי לשיפור הרזולוציה של תמונות תלת מימד כמו גם ארבע תמונות מימד. השוואה בין נתונים גולמיים לנתונים מואצלים מוצגת כאן. עבור מסוף עצב נחש טיפוסי אחד מוכתם במהלך גירוי עם FM 1 43 לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 עד 60 דקות אם מבוצעת כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון קולוקליזציה של אנדוזומי מאקרו עם סמנים פרה-סינפטיים.