הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית
16 ביוני 2014
מידת חוסר תפקוד כלי דם ותורמים מנגנונים פיסיולוגיים ניתן להעריך בחולים עם מחלת כליות כרונית על ידי מדידת התרחבות עורק זרוע בתיווך זרימה, מהירות גל הדופק של אב העורקים, וביטוי חלבון תא האנדותל בכלי דם.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את תפקוד כלי הדם בחולים עם מחלת כליות כרונית, זה מושג על ידי איסוף תאי אנדותל כלי דם מהחולים. לאחר מכן מוערכת מהירות גל הדופק של אבי העורקים כדי למדוד את נוקשות העורקים האלסטיים הגדולים. לאחר מכן, נמדדת התרחבות מתווכת של זרימת עורק ברכיאלי על מנת להעריך את תפקוד האנדותל של כלי הדם.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המאפיינות את תפקוד האנדותל של כלי הדם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום כלי הדם, כמו מה קורה ברמה התאית לביטוי של חלבונים שונים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש תרגול והכשרה נרחבים כדי לשלוט בהדמיית אולטרסאונד.
מי שידגים את ההליך יהיה לוני פרינו, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל להכין את האתר עם חומר חיטוי מקומי. המקום הבא וילונות סטריליים מעל האתר.
אחות או רופא מיומן צריכים להניח עירוי ולחבר מתאם נעילת hep. הנח שני חוטי J על הווילונות כדי לפתוח את צורת J. משוך את קשת ה-J בשני החוטים.
לאחר שחרורו, פתח את מכסה מנעול ההפ והזין את ה-JWI לווריד כשמונה סנטימטרים. דחוף את החוט קדימה ואחורה מספר פעמים לפני ההסרה כדי למנוע הצטברות של יותר מדי דם על החוט. לאחר מכן, השתמש בחותכי תיל כדי לחתוך את החוטים כך שיתאימו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל כ -30 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה.
חזור על שלבים אלה עבור החוט השני לאחר השלמת איסוף הדגימה. חזור למעבדה הרטובה. אוחזים את החוטים בזוג מלקחיים ומחזיקים אותם בתוך הצינור אך מעל התמיסה למשך 10 דקות.
השתמש בצינור ממונע כדי לשטוף את החוטים עם מאגר דיסוציאציה מהצינור. שחרר את המאגר כך שיזרום לאורך החוטים ונער עודפי נוזלים לתוך הצינור. הסר את החוטים וצנטריפוגה את הדגימה לגלולה.
אחזר את הדגימות והשהה מחדש את הגלולה ב-PBS לפני הצנטריפוגה. במשך חמש דקות נוספות לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה בקצה צינור יניקה כדי להשאיר כשני מיליליטר בצינור. שואב את השאר מבלי להפריע לגלולה.
השעו מחדש את הגלולה והשליכו את הדגימה באופן שווה לאזורים הסגלגלים של שמונה שקופיות שסומנו בעבר. הניחו את השקופיות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות לפני האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לתחילת הניתוח. הנבדק צריך להחליף למכנסיים חד פעמיים ולשכב על הבטן בחדר שקט, אפלולי, עם בקרת אקלים.
כאשר מוכנים להתחיל, מקמו את האלקטרודות עבור האולטרסאונד ואת מכשיר נוקשות העורקים שלנו. לאחר מכן, הנח את שרוול לחץ הדם על הנושא. התחל את קריאות לחץ הדם לאחר 20 דקות, חזור על הקריאות עד שהמדידות יהיו בטווח של חמישה מילימטרים מהכספית.
מנוחה של שתי דקות בין כל קריאה לביצוע שלוש לפחות. לאחר מכן, משש את דופק העורק הברכיאלי והנח את הסונומטר כדי לתעד צורות גל ברכיאלי. חזור על הפעולה עבור העורקים הרדיאליים, הירך והצוואר.
מדוד את המרחק לכל אחד מהאתרים הללו מהחריץ הסופר סטרנלי באמצעות סרט מדידה לעורקי הזרוע, הרדיאלי והצוואר וסרגל מותאם אישית לעצם הירך. לאחר מכן, חשב את מהירות גל הדופק הרדיאלי של הצוואר הצוואר ושל הצוואר באמצעות תוכנה מיוחדת. הנח את שרוול לחץ הדם של האמה רק רחוק לתהליך הריאון.
הגדר את תוכנת כלי הדם למצב הפעלה והקלט לפחות 10 מחזורי לב של עורק הזרוע הבסיסי, תמונות אולטרסאונד ומדידות מהירות זרימת הדם. ניתן להשתמש בזרוע מכנית כדי לייצב את בדיקת האולטרסאונד אם תרצה. לאחר מכן, נפחו את שרוול לחץ הדם של האמה ל-250 מילימטרים של כספית.
והתחילו טיימר. הנחו את המשתתף להישאר דומם מאוד. התחל להקליט מהירויות כאשר הטיימר קורא טריגר של ארבע דקות ו-45 שניות.
שחרר את השרוול לאחר חמש דקות ושנה את האולטרסאונד כדי להקליט תמונות במצב B. כשהשעון קורא חמש דקות, עשר שניות. המשך להקליט עד שהשעון יקרא שבע דקות.
לאחר מכן, מדדו את לחץ הדם של הנבדק. אם לחץ הדם הסיסטולי גדול או שווה ל-100 מילימטר כספית, הניחו 0.4 מיליגרם של ניטרוגליצרין תת-לשוני מתחת ללשון הנבדק והתחילו את הטיימר. התחל להקליט מצב B כאשר השעון קורא שלוש דקות והפסק להקליט.
כשהשעון קורא שמונה דקות. כדי לנתח את תאי האנדותל המוכתמים, נסיין סמיות יחיד צריך לסרוק את השקופיות באופן שיטתי, תאי אנדותל מזוהים על ידי צביעה חיובית עבור VE cadherin ושלמות הגרעין מאושרת על ידי צביעה חיובית עבור dapi. בנוסף, יש לצבוע את התאים עבור החלבון המעניין.
יש לדמות בסך הכל 30 תאים לכל שקופית לניתוח מאוחר יותר. חזור על תהליך זה עבור כל שקופית באצווה המוכתמת, כולל שקופית בקרת VE. תוכנה איכותנית משמשת לניתוח עוצמת הצביעה עבור הנוגדן העיקרי המעניין.
תמונה זו מציגה את קוטר העורק הברכיאלי הבסיסי שהתקבל במהלך הערכה של חולה עם מחלת כליות כרונית לאחר שחרור השרוול למשך שתי דקות. הקלטה זו מציגה שינוי בקוטר מגודר של גל R. צורות גל אלה התקבלו בכל אחד מעורקי הצוואר והירך.
ההבדל בזמן ובמרחק שימש לחישוב דיווח על מהירות גל הדופק של אבי העורקים. כאן, תאי ביקורת וחולה נותחו לשלמות גרעינית עם ביטוי תאי אנדותל DPI עם VE cadherin ועבור האנזים המחמצן N-A-D-P-H אוקסידאז. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג את תמונות האולטרסאונד, צורות הגל ותמונות תאי האנדותל האיכותיות ביותר האפשריות להערכה מדויקת וכמותית.
אל תשכח שעבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מעריך תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית באמצעות מדידה של פרמטרים פיזיולוגיים שונים. מדדים מרכזיים כוללים התרחבות תלוית זרימה (flow-mediated dilation) בעורק הזרוע ומהירות גל דופק אאורטלי, המספקים תובנות לגבי תפקוד האנדותל של כלי הדם וקשיחותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- בריאות קרדיווסקולרית
- מחלת כליות כרונית
רקע
- דיספונקציה וסקולרית שכיחה במחלה כלית כרונית.
- הבנת התפקוד האנדותליאלי היא קריטית לניהול הטיפול בחולה.
- מדידת נוקשות העורקים מסייעת באפיון הבריאות הווסקולרית.
- טכניקות של דימות באולטרסאונד חיוניות להערכות אלו.
מטרת המחקר
- להערכת התפקוד האנדותליאלי הvסקולרי במטופלים עם מחלת כליות כרונית.
- למדידת מהירות גל הדופס בעורק האורטלי לצורך הערכת קשיחות העורקים.
- להעמקת ההבנה של ביטוי חלבונים ברמה התאית.
שיטות שנמצאו בשימוש
- איסוף תאי אנדותל כלי דם מבית חולים.
- הערכה של מהירות גל הדופק באורטה.
- מדידה של התרחבות תלוית-זרימה בעורקי הזרוע.
- ניתוח התוצאות לאפיון תפקודי כלי הדם.
תוצאות עיקריות
- בוצע אפיון של תפקוד האנדותל vasculaire.
- התוצאות הצביעו על שונות בנוקשות העורקים בקרב המטופלים.
- התקבלו תובנות לגבי שינויים בביטוי חלבונים.
- המתודולוגיה הדגישה את הצורך בהכשרה מעמיקה בדימות אולטרסאונד.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת להערכת בריאות כלי הדם במחלה כרונית של הכליות.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים הפיזיולוגיים של תפקוד לקוי של כלי הדם.
- מחקרים עתידיים יכולים להתרחב מהשיטות הללו כדי לבחון השלכות נוספות על כלי הדם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תפקוד כלי דם לקוי במחלה כלית כרונית מהווה גורם סיכון קרדיווסקולרי לא מסורתי, המשפיע על הערכות הבטיחות והיעילות של תרופות. מדידה של תפקוד האנדותל ונוקשות העורקים מספקת תובנות מכניסטיות להפחתת סיכונים קרדיווסקולריים בפיתוח פרה-קליני וקליני. הערכות אלו תומכות באימות המטרה הטיפולית על ידי קישור נתיבים פתופיזיולוגיים להתערבות טיפולית באוכלוסיות עם CKD.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות על ידי כימות התרחבות תלוית-אנדותל כמדד תפקודי לזמינות ביולוגית של חמצן חנקני (nitric oxide).
- ערך תפעולי: אפשור הבהרה של מסלולים ביולוגיים באמצעות קורלציה בין סממנים של עקה חמצונית לבין תוצאות כלי דם תפקודיות.
- ערך ניבוי: תמיכה במיון תיקי תרופות על ידי זיהוי תרכובות המחמירות או מפחיתות תפקוד לקוי של כלי דם במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות תאים אנדותליאליים שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד וצביעה.
- פלטים כמותיים: הפקת מדידות הניתנות לשחזור של התרחבות תלוית זרימה (flow-mediated dilation) ומהירות גל הדופק לצורך מידול תגובה למינון.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ביסוס זרימות עבודה הניתנות להרחבה להערכת תפקוד כלי דם במספר תחומים טיפוליים הנוגעים לבריאות האנדותל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בתאים המופקים מחולי CKD למידול פתופיזיולוגיה וסקולרית אנושית ולשיפור הדיוק התרגומי.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: קישור שינויים בביטוי חלבונים (למשל, NADPH oxidase) לתוצאות וסקולריות תפקודיות כדי להבהיר את מנגנון הפעולה.
- קידום מותאם סיכונים: קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות שילוב מוקדם של אותי בטיחות וסקולריים ברצף הגילוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משלבת הערכה תפקודית של כלי הדם בתהליך הגילוי, מקשרת בין פנוטיפים תאיים לתוצאות ברמת הרקמה ותומכת בשיפור איטרטיבי של מועמדים טיפוליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור נתיבים של עקה חמצונית לתפקוד אנדותליאלי באמצעות שינויים מדידים בביטוי חלבונים.
- סריקה: מספקת תאים אנדותליאליים מוכנים לבדיקה עם חיוניות מאושרת וביטוי סמנים ליישומים של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות ועצמאיות (FMDBA, aPWV) המאפשרות השוואה בין תנאים וזיהוי אותות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי שימוש בתאים ממקור אנושי למידול של תפקוד לקוי של כלי דם הקשור למחלה של כליות כרונית (CKD).
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת פגיעה בכלי דם בתוכניות טיפוליות קרדיו-וסקולריות, מטבוליות וכליתיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בין מטרות מולקולריות לבין פנוטיפים וסקולריים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת תפקוד כלי דם באמצעות נהלי בידוד תאים, דימוי ואנליזה הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של ליקויים וסקולריים, ובכך מפחית את סיכון הנשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מקל על תעדוף מועמדים מותאם סיכון, בהתבסס על פרופילי בטיחות וסקולריים במודלים רלוונטיים ל-CKD.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בדימוי אולטרסאונד וסקולרי, בידוד תאי אנדותל ובטכניקות של אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בגישה למכשירים למדידת קשיחות עורקים, מערכות אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין הצוותים הקליניים, המעבדתיים וצוותי הדימוי לצורך טיפול בדגימות ועקביות הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על מיטות כלי דם שונות או מודלים של בעלי חיים.
- מוגבל על ידי הצורך בהכשרה נרחבת להשגת רכישת תמונות וצורמות גל אמינות, במיוחד בשלבים התלויים באולטרסאונד.
