Name: השתנה במבחנה פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: למדו שיטת מבחנה מותאמת לבחינת השפעת הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה על פלישת תאי סרטן. השיטה מאפשרת לזהות הבדלים במדד הפלישה בין וריאנטים שונים של תאים ולהעריך את תפקידם של גורמים חיצוניים בהתנהגות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במקורות מימון מבית הספר לרוקחות של מכללת ד'יוביל, באפלו, ניו יורק.

1. מכין את אמצעי התקשורת שונה ורכיבים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, להכין תקשורת בהיקף של DMEM או מדיה אחרת שצוינה בתוספת או FBS הנורמלי, הפחם הפשיט FBS, או FBS פחם הופשט בתוספת הרכיב להיבדק. שימו לב שניתן לבדוק רכיבים מרובים בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ולדלל את ההורמונים, גורמי גדילה, או ציטוקינים כראוי להיות מומסים בסרום הפחם הופשט בריכוז הפיזיולוגי. </li></ol> 2. מכין את מטריקס קולגן על קרח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר קולגן אני מטריקס ב -2.2 מ&quot;ג / מיליליטר על ידי הוספת הרכיבים המסוננים סטרילי הבאים על קרח: 200 10x μl PBS (pH 7.4), 5.4 μl 1 N NaOH, 600 μl של H 2 O מזוקק פעמיים, ואני 1.2 מיליליטר קולגן (ב3.63 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לי פתרון קולגן על קרח עד מוכן לצלחת. </li></ol> 3. להכין צלחות הגירה / פלישה לAssay &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל קו תא להיבדק, להשתמש צלחת תא 24 גם אחד שבו 12 בארות להכיל מוסיף. השתמש 12 בארות נוספות שאינו מכילות מוסיף להוספת תקשורת chemoattractant והעברת ההכנסות לקבוצת הניסיון. הערה: מטריצת קולגן על צלחות עם קרום teraphthalate פוליאתילן (PET) וגודל נקבובית 8 מיקרומטר היא אופטימלית לשורות התאים להשתמש כאן. עם זאת, מטריצת matrigel בצלחות Precoated יכולה גם להחליף עם הגודל הנקבובית ירד בהתאם לשורת התאים נחקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברור לתייג את הצלחת, באמצעות 3 בארות לכל מצב להיות מנותחות (הגירת FBS, הגירת CS-FBS, פלישת FBS, ופלישת CS-FBS כמו גם FBS הגירה לשליטה, שורת תאים לא פולשנית). הגירת assay על ידי תנועה דרך נקבוביות בקרום PET, ופלישת assay על ידי תנועה באמצעות מטריצת קולגן או matrigel ולאחר מכן דרך נקבוביות בקרום. השתמש בסמני צבע שונים לכל מצב תא לid בתהליך הציפוי. </li></ol> 4. לוותר מטריקס הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה 75 μl של פתרון מטריצת קולגן למוסיף לשמש למבחני פלישה. השתמש בזהירות כדי למנוע בועות. לפזר בועות על ידי יישום קצה פיפטה הפוך אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת עם מוסיף מצופה קולגן ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות כדי לאפשר ג&#39;ל כדי לחזק. </li></ol> 5. פלייט התאים על גבי ממברנה או הפלישה מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, trypsinize תאים ולהוסיף מדיה עם 10% FBS. תאי ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על צנטריפוגה בראש הטבלה ולשטוף 3x בתקשורת חופשית בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלול בתקשורת חופשית בסרום. ספירת תאים עם hemocytometer או נגד שקופיות אוטומטיות. הוסף מדיה סרום ללא לריכוז סופי של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מטריצת קולגן יש הקרושה (לאחר 30 דקות), להוסיף 700 μl של תקשורת עם או2% FBS מוגדר או פחם-הפשיט FBS היטב כל אחד. של 12 מוסיף לכל צלחת: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בצלחות נוספות בהתאם למספר גורמים הנבדקים ועם שליטה לא קולגן המתאים לכל מצב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה תא למוסיף בשעה 5 x 10 4 תאים / מיליליטר, ציפוי 500 תאי μl לכל כנס בכל מוסיף ההגירה ופלישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 22 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. לכמת את מספר הנודד ותאים פולשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת הגדר של בארות באמצעות מקבע מתנול, eosin, וhemotoxylin, בבארות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצמר גפן כדי להסיר תאים ומטריצה ​​מכל טוב.Rrepeat עם יישום ספוגית שני לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, לטבול להכניס כל אחד 5 פעמים 1 שניות לכל אחד מהפתרונים 3 ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מוסיף לייבוש O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או i) להסיר את המסננים עם אזמל, החיתוך בזהירות מסביב לקצוות ולעלות בשקופית עם שמן coverslip וטבילה, או ii) תאפשר מוסיף לייבוש O / N ההפוך ולהשתמש במוסיף ישירות למיקרוסקופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להציג שקופיות או מוסיף תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X ולקחת 5 תמונות מאזורים שונים של המסנן. כדי לשפר את העקביות, לקחת 4 שדות חיצוניים ומרכז אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים לכל תנאי שימוש בתוכנת ImageJ ואחול על נוסחות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את פלישת אחוזים כדלקמן: אומר # תאים הפולשים באמצעות קולגן אני מכניס = אומר # של תאים הנודדים דרך להכניס שליטה = b פלישת% = (a / b) * 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מדד הפלישה ב 2% FBS כדלקמן: פלישת% מתאים שassayed (ב 2% FBS) = ג % פלישה של תאים לא פולשנית שליטה ב( 2% FBS) = d הפלישה Index (FBS) = (ג / ד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מדד הפלישה ב 2% CS-FBS כדלקמן: פלישת% מתאים שassayed (ב 2% CS-FBS) = e פלישת% מתאים לא פולשנית שליטה ב( 2% CS-FBS) = f הפלישה Index (CS-FBS) = (ה / ו) </li></ol> 7. חזור על הפרוטוקול ניסויי השוואה-הפשיט פחם FBS לFBS הפשיט פחם + X n עם גורמים מרובים משולבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך מספר פעמים לפי הצורך תוך שימוש ברכיבים שונים עבור &quot;X&quot; או שילוב של רכיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל החישובים כדי לקבוע את תרומתו של כל &quot;X&quot; גורם לתופעות הגירה ופלישה. </li></ol>

<ol><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinberg%2C+RA+%22The+Biology+of+Cancer%22">The Biology of Cancer</a>. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li>
<li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li>
<li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li>
<li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation%3A+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li>
<li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells%3A+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201(2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li>
<li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li>
<li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition%3A+concepts+and+molecular+links%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li>
<li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li>
<li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li>
<li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+stem+cells%2C+cytokine+networks%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li>
<li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li>
<li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li>
<li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li>
<li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.J.%2C+V.%2C+M.E.%2C+M.D.%2C+J.M%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+estrogen-independent+breast+cancer+growth+driven+by+low+estrogen+concentrations+are+unique+versus+complete+estrogen+deprivation.Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

גרורות סרטנית היא תהליך רב שלבי. התאים חייבים לפרוץ את הקרום במרתף, intravasate לmicrovessels או מערכת הלימפה או הדם, שבו הם מועברים לאתרים מרוחקים. תאי הגידול אז extravasate וליישב לmacrometastasis 12. התקדמות דרך אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), פלישת גידול, וגרורות שופרה על ידי הורמוני סטרואידי 13,14, צמיחת גורמי 15-18, וציטוקינים 19-21. מולקולות אלה הן כל כך קריטיות לטיפול במסלול האיתות של התקדמות גידול, כי הפיתוח של assay כדי לטפל בתפק...

Assay פלישת רומן פותח במטרה לזהות את מעורבותם של הורמונים מסוימים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה כchemoattractants בפלישת תאי סרטן. היכולת של תאים סרטניים לפלוש דרך המטריצה ​​תאית (ECM) היא סימן היכר של פנוטיפ גרורתי 1-3. תאי פלישה נעשו שימוש נרחב כמו במבחנה כלים ללמוד פלישת תאי סרטן והגירה ועשויים לספק ידע באשר למנגנוני in vivo פלישת גידול וגרור. התאים מורכבים מהתרבות מוסיף תא גלילי קיננו בתוך הבארות של צלחות תרבית תאים. התחתיות מוסיף הן קרומי פוליקרבונט או קלקר חדיר למחצה של גודל נקבובית מוגדר. בassay הפלישה הסטנדרטי, תאים הם זורעים על הממברנה להכניס את עם תקשורת חופשית בסרום והניחו לתוך בארות תרבית תאים שמלאות בchemoattractants סרום או כמו סרום-ליםet עד כוח chemoattractive. תאי כונני הכוח הזה כדי לנוע בקרום חדיר למחצה (ההגירה) או לחלופין, באמצעות ציפוי של מטריצה ​​תאית (פלישה), אז מה שיכול להיות מוכתמת באמצעות צבעים קונבנציונליים כדי לזהות ולכמת את מספר התאים. מספר התא אז מנורמל לפי העומק של הגירה ופלישה בשורת תאים לא פולשנית. שיטה זו מאפשרת לחוקר להעריך את הפוטנציאל פולשני של סוגי תאים שונים תחת מגוון רחב של תנאים, כוללים מניפולציות גנטיות. הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה הם רכיבים קריטיים של סרום ויותר ויותר במוצגים להיות קשורים לנהיגת פנוטיפ פולשני 4. עם זאת, הטבע, התפקיד, וספציפיות של מולקולות סרום chemoattractive אלה בתיווך פלישה עדיין להישאר חמקמקים. האתגר נשאר כדי לקבוע מה ספציפי גורמים בchemoattractants סרום או כמו סרום-הם אחראים לנהיגהפלישת סרטן תאים, כמו גם את מה שמולקולות עלולות לעכב את תהליך הפלישה. בדוח זה, אנו מתארים שיטה להעריך את המעורבות האפשרית של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי צמיחה הנוכחיים בסרום, כמו מולקולות הנהיגה chemoattraction והפלישה של תאים סרטניים. בהציע פרוטוקול שונה זו, הפשטת פחם משמשת כדי להסיר הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה מסרום 2% שור עוברי (FBS) כדי ליצור FBS פחם 2% הפשיט (CS-FBS). שני 2% FBS ו -2% CS-FBS משמשים כסוכנים להקים כוח chemoattractive לנהוג פלישת תאי סרטן. באמצעות 2% CS-FBS כסוכן chemoattractive בהשוואה ל -2% FBS הרגיל מעניק מספר יתרונות הכוללים ראשון, ובולט ביותר, היכולת ללמוד את הפנוטיפ פלישת הסרטן בהעדר המופחת / היחסי של הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה. הוא גם מאפשר לחוקר להעריך אם ההסרה הקולקטיבית של הורמונים, גורמי גדילה, וCYtokines גורם לעלייה או ירידה במדד פולשנית. Assay לאחר מכן נועד לקבוע אם התוספת של רכיב בודד, המיועד כ&quot; X &quot;יכולה לעכב, ירידה, עלייה, או לשחזר את המדד פולשנית לערכו המקורי (ראה איורים 2 ו -3). למרות שמתודולוגיה זו היא ספציפית להשגת הרמות הפיזיולוגיות של הרכיב שהוסר מהסרום במהלך הפשטת פחם, זה צריך להיות גם ציין כי הפשטת פחם יכולה להשפיע גם על מסלולי העברת אותות. לדוגמא, זה כבר דווח כי הפשטת פחם יכולה להפחית את פעילות phosphatase אלקליין של תאי osteoprogenitor ולגרום adipogenesis באמצעות הפחתה של מפעילי MAPK 5. תקשורת הפשיטה פחם היא זמינה באופן מסחרי, ומבוססות על הפרוטוקול שתוארה המשלב פחם עם dextran וטופחו עם O בסרום שור עוברי / N 6. assay זו פותח בrespoNSE לתוצאה שדווחה על ידי צוקר et al. 7 המחברים הוכיחו כי פנוטיפ מוטנטי משפיע תקשורת צומת הפער הפגין עליית מדד הפלישה בעת העברה לתקשורת עם FBS 2% נורמלים. עלייה זו בוטלה עם ההחלפה של סרום-הפשיט פחם. מתוצאה זו, החוקרים הסיקו כי הגירה מושפעת זה מוטציה למולקולת lipophilic (לייתר דיוק, הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים) 7. זה ידוע היטב כי הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לתווך מסלולי איתות מעורבים בקידום גידול ופלישה 4. לפיכך, חשוב לחוקרים מדעיים כדי לקבוע מה גורם (ים) נוהג פלישת הגידול של תאי הסרטן המסוים שלהם או מוטציות תחת מחקר. Assay נועד לעסוק בתפקיד של רכיבים בודדים בריכוז הפיזיולוגי שלהם, כפי שנקבע על פי ההפרש בין הריכוז של הרכיב ו# 8220; X &quot;בFBS הנורמלי וCS-FBS. באמצעות הפיתוח של assay זה, חוקרים יכולים להשיג תובנה רבה יותר על המסלול פולשנית הספציפי המסדירים את המערכת שלהם. הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לעתים קרובות סווגו כמקדמי גידול 8. חלק מגורמים אלה כמו EGF משמש כמקורות ישירים לchemoattractants בתאי פלישה 9. לפיכך, סביר להניח כי אלה מייצגים את המרכיבים העיקריים של הסרום שפלישת גידול ישיר. פרוטוקול זה מציע פשוט, אך משמעותי, שינוי במבחנת assay הפלישה הקונבנציונלי המאפשר חוקר להעריך את מעורבותם של הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. עם זאת, assay נועד לספק החוקר עם תשובה באשר לשאלה האם ההליך יהיה יעיל למחקר שלהם בכל צעד בתחילת הניתוח, כדי שלא לנצל את הזמן וr יקריםesources אם כמיותר. שיטה זו משתמשת CS-FBS והוא מסתמך על שיקול דעתו החוקרים שכמולקולות להמשיך כמועמדים מובילים שפוטנציאל לתווך פלישת תאי הסרטן. התוצאות מניתוחים אלו צריכים להוכיח להיות שימושיים בזיהוי רכיבי שסרום לשמש chemoattractants או מעכבים עבור קו תא המסוים או מוטציה הנלמד. בנוסף, גישה זו עשויה לעזור לחוקר לזהות מסלולי איתות מפתח או קידום או עיכוב פלישת תאים סרטניים; כך מכוון את עיצוב סמים עתיד.

<table><tbody><tr><td>תוספות בקרת BioCoat עם 8.0 ומיקרו; m קרום PET</td><td>קורנינג</td><td>354578</td><td>12 בכל אחת משתי צלחות 24 בארות. PET = פוליאתילן טרפתלט</td></tr><tr><td>קולגן I, זנב חולדה</td><td>קורנינג</td><td>354236</td><td>מקור = גיד זנב חולדה, טוהר = 90%</td></tr> <tr><td>מקבע; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>קיבוע מבוסס מתנול, המטוקסילין/אאוזין</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>מוגדר</td></tr><tr><td>כסרום בקר עוברי מופשט</td> פחם <td>FBS Life Technologies</td><td>12676</td><td>מוגדר</td></tr><tr><td>כסרום בקר עוברי</td> CS-FBS <td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>מוגדר כ-FBS</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מופשט פחם</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>מוגדר כ-CS-FBS</td></tr></tbody></table>

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

סרום דם משמש כchemoattractant כיוון שתאי הסרטן להגר ולפלוש, להקל intravasation לmicrovessels. עם זאת, המולקולות בפועל כיוון שבו התאים לנדוד להישאר חמקמקות. assay פלישה שונה זו פותח כדי לזהות מטרות שנוהגות נדידת תאים ופלישה. טכניקה זו משווה את מדד הפלישה תחת שלושה תנאים כדי לקבוע אם הורמון מסוים, גורם גדילה, או ציטוקינים משחק תפקיד בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. תנאים אלה כוללים אני) בסרום שור עוברי נורמלי (FBS), ii)-הפשיט פחם FBS (CS-FBS), אשר מסיר הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים וiii) מולקולת CS-FBS + (מסומן &quot;X&quot;). שינוי משמעותי בפלישת תא עם CS-FBS בהשוואה לFBS, מצביע על מעורבותם של הורמונים, ציטוקינים או גורמי גדילה בתיווך השינוי. אז יכולות להיות הוסיפו בחזרה מולקולות בודדות לCS-FBS לassay יכולתם מחדשפסוק או להציל את הפנוטיפ הפלישה. יתר על כן, ניתן לשלב שתיים או יותר גורמים כדי להעריך את התוסף או תופעות סינרגיסטי של מולקולות רבות בנהיגה או עיכוב פלישה. בסך הכל, בשיטה זו מאפשרת לחוקר כדי לקבוע אם הורמונים, ציטוקינים, ואו גורמי גדילה / לשחק תפקיד בפלישת תא על ידי המשרת כchemoattractants או מעכבים של פלישה לסוג מסוים של תאי סרטן או מוטציה ספציפית. על ידי זיהוי chemoattractants ומעכבים ספציפיים, assay הפלישה שונה זה עשוי לעזור להבהיר מסלולי איתות המכוונים את פלישת תאי הסרטן.

מדד הפלישה מחושב עבור כל תנאי לפי נורמליזציה לשורת תאים לא פולשנית. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו 1205Lu תא מלנומה ושורות תאי יציבות גרסה הוקמה כקווים פולשנית שלנו, כמו גם את הגרסה טרום לא פולשנית, WM793 ממנו התאים 1205Lu נגזרו 10 המשמשים כבקרה לוגית. גם אנו מנצלים אני קולגן כמטריצת הפלישה משום שהוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. זה בהתאם למחקר קודם לפי מטריצת הפלישה האופטימלית משתנית בהתאם לקו התא ועם in vivo מידת ההתאמה תוצאות 11. assay פלישה זו מתואר ב...

מאמר וידאו זה מתאר שיטה שונה במבחנה לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או גורמי גדילה בהנעת פלישת תאים סרטניים.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבסס בדיקת in vitro לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או פקטורי גדילה בהנעת פלישה של תאי סרטן. דבר זה מושג על ידי קביעה האם קיים הבדל במדד הפלישה בין וריאנטים שונים של תאים או מוטנטים כשלב שני. בדיקת הפלישה חוזרת לביצוע באמצעות מצע שעבר ספיחה בפחם (charcoal stripped media), המסיר הורמונים, פקטורי גדילה או ציטוקינים מהסרום.לאחר מכן חוזרים על בדיקת הפלישה (invasion assay) תוך הוספת גורם ידוע וספציפי למצע שנוקה באמצעות פחם, כדי לקבוע האם נדידה לעבר גורם זה מעודדת או מעכבת את הפלישה. התוצאות מראות את השינויים במדד הפלישה עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות המתרחשים במהלך נדידה לעבר גורמים ניסיוניים ידועים, בהתבסס על נורמליזציה של התוצאות אל מול מדד הפלישה של אוכלוסיות תאים שאינן פולשות. קיבלתי לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר ביצעתי בדיקת פלישה מסורתית, ושמתי לב שקיים הבדל משמעותי בין מדדי הפלישה עבור מוטנטים תאיים שונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת פלישה (invasion assay) מסורתית, הוא שבאמצעותה ניתן לחקור באופן ספציפי את תפקידם של הורמונים, פקטורים ספציפיים של גדילה וציטוקינים בקידום או בעיכוב של פלישת תאים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כולל השאלה אילו גורמים מובילים לגרורת סרטן. ההשלכות של טכניקה זו עשויות לספק גישה טיפולית לעיצוב תרופות בעתיד. עבור כל שורת תאים לבדיקה, השתמש בפלטה של 24 בארות עם 12 אינסרטים (inserts).לאחר מכן, סמנו את הפלטות בהתאם לתנאים המיועדים לניתוח. בשלב הבא, העבירו בזהירות 75 µL של תמיסת מטריצת קולגן שהוכנה טרי לכל אינסרט שישמש לבדיקת פלישה, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות. לאחר מכן, דגרו את הפלטות עם האינסרטים המצופים בקולגן בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להתמצק.לאחר ניתוק התאים הניסיוניים באמצעות trypsin, יש להוסיף מצע המועשר ב-10% FBS כדי לנטרל את האנזים ולשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, יש לתלות מחדש את המשקע במצע נטול סרום ולספור את התאים. כאשר מטריצת הקולגן תתמצק, יש להוסיף מצע נטול סרום עד לריכוז סופי של 50,000 תאים למילליטר.לאחר 30 דקות, הוסף לכל באער 700 µL של מצע המכיל או 2% defined FBS, או 2% charcoal stripped FBS, או 2% charcoal stripped FBS בתוספת הרכיב הנוסף. הוסף 500 µL של תרחיף תאים במצע נטול סרום לחלק העליון של כל מכשיר מדידה של נדידה (migration) או פלישה (invasion). הכנס את מכשירי המדידה והדגר אותם למשך 22 שעות בטמפרטורה של 37 °C.לאחר מכן, הוסיפו methanol, מקבע, eoin ו-hematin לשלוש מהבארות הריקות של פלטת התא המבחנה. בשלב הבא, הסירו את התאים ואת המטריקס מהחלק העליון של כל רכיב השבצה (insert) באמצעות שתי החלקות רצופות של מקלון צמר גפן. לאחר מכן השתמשו בפינצטה.טבלו כל רכיב להחדרה (insert) חמש פעמים, למשך שנייה אחת בכל פעם, בכל אחד משלושת תמיסות הצביעה באופן עקבי, והניחו לרכיבים להתייבש למשך הלילה כשהם הפוכים. למחרת, השתמשו בעדשה עם הגדלה של 20x כדי לרכוש תמונות של התאים על הרכיבים באמצעות צפייה ישירה ברכיבים הצבועים.חמישה תמונות נלקחות עבור כל דגימה, כולל ארבע מהשדות החיצוניים של הממברנה ואחת מהמרכז. לבסוף, באמצעות תוכנת Image J, ספרו את התאים בכל תמונה וחשבו את מדד הפלישה (invasion index) כערך מנורמל לשורת תאים שאינה פולשת. מודל זה מדגים את התוצאות הפוטנציאליות שעשויות להתקבל במהלך בדיקת פלישה וכיצד לפרש את הנתונים התואמים.כל עיגול ממחיש תוצאה מייצגת של מסנן צבוע מאחד משלושת התנאים שנבדקו, וכל נקודה מייצגת תא שעבר דרך מטריצת הפלישה ונצבע בחלק התחתון של הממברנה. לאחר מכן, מדד הפלישה מחושב עבור כל תנאי בהתאם לנורמליזציה שלו ביחס לשורת תאים שאינה פולשת. לדוגמה, בניסוי מייצג זה, נבדקו שלושה הורמונים כדי לזהות גורם x אפשרי.לשני ההורמונים לא הייתה השפעה על מדד הפלישה, אך זוהה הורמון אחד בעל תכונות מעכבות. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בערך בארבע שעות ביום הראשון ובשעה אחת ביום השני, בתנאי שכל השלבים מבוצעים כראוי. בעת שימוש בטכניקה זו, חשוב לסמן בזהירות ובדיוק כל תאיב (insert) של תאים בנפרד.השתמשנו במערכת של קוד צבעים ובנקודות שונות כדי לסמן בזהירות כל תבנית תאים (cell insert). לאחר מכן, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מודלים של עכברים in vivo למטאסטזה, כדי לתקף את התוצאות in vitro. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבחון את הרלוונטיות הפיזיולוגית של גורמים כגון הורמונים, גורמי גדילה וציטוקינים, כמעודדים או כמעכבים של פלישה תאית במודל in vitro.תודה על התעניינותך בסרטון שלנו ובהצלחה בניסויים שלך.

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר...

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

סרטון זה מתאר את הטכניקה של שימוש במטריצה טבעית לחקר פלישת תאי גידול. הטכניקה המשמשת בבדיקה זו מספקת את היכולת להעריך אינטראקציות תאים אפיתליאליים-מזנכימליים בסביבה תלת-ממדית ללא צורך במטריצה סינתטית או זרה.

בדיקת פלישת תאי גידול: שיטה תלת-ממדית מבוססת מטריצה טבעית במבחנה להערכת אינטראקציות תאים אפיתל-מזנכימליים

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך גרורתי.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את הפלישה של תאי גידול לחיים שברי רקמה נורמלים בשלושה ממדים. טכניקת תרבות איבר זה מיושמת בעיקר כדי לבדוק את התרופות שעלולים להיות אנטי-פולשני במבחנה.

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

למדו שיטת מבחנה מותאמת לבחינת השפעת הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה על פלישת תאי סרטן. השיטה מאפשרת לזהות הבדלים במדד הפלישה בין וריאנטים שונים של תאים ולהעריך את תפקידם של גורמים חיצוניים בהתנהגות התאים.

השתנה

גלה סרטונים נוספים