השתנה במבחנה פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

מאמר וידאו זה מתאר שיטה שונה במבחנה לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או גורמי גדילה בהנעת פלישת תאים סרטניים.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להקים מבחן מבחנה לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או גורמי גדילה בהנעת פלישת תאים סרטניים. זה מושג על ידי קביעה אם יש הבדל בין מדד הפלישה של וריאנטים שונים של תאים או מוטציות כשלב שני. בדיקת הפלישה חוזרת על עצמה באמצעות מדיה מופשטת פחם, המסירה כל הורמונים, גורמי גדילה או ציטוקינים מהסרום.

לאחר מכן חוזרים על בדיקת הפלישה עם תוספת של גורם ידוע ספציפי למדיום הפחם כדי לקבוע אם ההגירה לכיוון גורם זה מגבירה או מעכבת את הפלישה. התוצאות מראות את השינויים במדד הפלישה עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות המתרחשים במהלך הנדידה לעבר גורמי ניסוי ידועים בהתבסס על נורמליזציה של התוצאות מול המדד הפולשני של אוכלוסיות תאים לא פולשניות. קיבלתי את הרעיון לשיטה זו לראשונה כאשר ביצעתי בדיקת פלישה מסורתית, ושמתי לב שיש הבדל משמעותי בין מדדי הפלישה עבור מוטציות תאים שונות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת הפלישה המסורתית, הוא שבעזרת טכניקה זו ניתן לחקור באופן ספציפי את תפקידם של הורמונים, גורמי גדילה ספציפיים וציטוקינים בקידום או עיכוב פלישת תאים. שיטה זו עשויה להועיל במענה על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כולל אילו גורמים מובילים לגרורות סרטניות. ההשלכות של טכניקה זו עשויות לספק גישה טיפולית לתכנון תרופות עתידיות עבור כל קו תאים שייבדק, השתמש בצלחת 24 בארות עם 12 תוספות.

לאחר מכן סמן את הלוחות בהתאם לתנאים שיש לנתח. לאחר מכן, בזהירות, חלקו 75 מיקרוליטר תמיסת מטריצת קולגן טרייה שהוכנה לכל תוספת שתשמש לבדיקת פלישה תוך הקפדה לא ליצור בועות. לאחר מכן דגרו את הצלחות עם התוספות המצופות קולגן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להתמצק.

לאחר ניתוק תאי הניסוי עם טריפסין, הוסף מדיום בתוספת 10% FBS כדי לנטרל את האנזים ולשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במדיום נטול סרום וספרו את התאים. הוסף מדיה נטולת סרום לריכוז סופי של 50,000 תאים למיליליטר כאשר מטריצת הקולגן התמצקה.

לאחר 30 דקות, הוסף 700 מיקרוליטר של מדיום עם FBS 2% מוגדר FBS 2% פחם מופשט או 2% FBS מופשט פחם בתוספת הרכיב הנוסף לכל אחד. ובכן הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים במדיום נטול סרום לחלק העליון של כל נדידה או פלישה. הכנס, דגרו את הבדיקות למשך 22 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הוסף מתנול, קיבוע, אואין והמטין לשלוש הבארות הריקות של צלחת החדר. לאחר מכן, הסר את התאים והמטריצה מהחלק העליון של כל תוספת עם שני צמר גפן עוקב. ואז באמצעות מלקחיים.

טבלו כל תוספת חמש פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם בכל אחת משלוש תמיסות הצביעה ברצף, והניחו לתוספות להתייבש למשך הלילה הפוך. למחרת. השתמש במטרה של פי 20 כדי להשיג תמונות של התאים על התוספות על ידי צפייה ישירה בתוספות המוכתמות.

חמש תמונות נלקחות עבור כל דגימה, כולל ארבע מהשדות החיצוניים של הממברנה ואחת מהמרכז. לבסוף, באמצעות תוכנת תמונה J, ספרו את התאים עבור כל תמונה וחשבו את אינדקס הפלישה כמנורמל לקו תאים לא פולשני. מודל זה מדגים את התוצאות הפוטנציאליות שעלולות להיתקל במהלך בדיקת פלישה וכיצד לפרש את הנתונים המתאימים.

כל עיגול ממחיש תוצאה מייצגת לפילטר מוכתם מאחד משלושת התנאים שנבדקו, וכל נקודה מייצגת תא שעבר דרך מטריצת הפלישה ונצבע בתחתית הממברנה. לאחר מכן מחושב מדד הפלישה עבור כל מצב בהתאם לנורמליזציה שלו לקו תאים לא פולשני. לדוגמה, בניסוי מייצג זה, נבדקו שלושה הורמונים כדי לזהות גורם x אפשרי.

לשניים מההורמונים לא הייתה השפעה על מדד הפלישה, אך אחד זוהה כבעל תכונות מעכבות לאחר ששולט בו. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כארבע שעות ביום הראשון ושעה ביום השני אם כל השלבים מבוצעים כראוי. בעת השימוש בטכניקה זו, חשוב לתייג כראוי כל תוספת תא בנפרד בקפידה.

השתמשנו במערכת מקודדת בצבע ובנקודות שונות כדי לתייג בזהירות כל הכנסת תא לאחר מכן. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו in vivo, מודלים של עכברים לגרורות כדי לאמת את תוצאות המבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחון את הרלוונטיות הפיזיולוגית של גורמים כגון הורמונים, גורמי גדילה וציטוקינים כמשפרים או מעכבים של פלישת תאים במודל מבחנה.

תודה על התעניינותך בסרטון שלנו ובהצלחה בניסויים שלך.