Name: ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית גין משלוח בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: למדו להביע חלבונים באופן חולף בעכברים באמצעות הידרודינמית משלוח ג'ין. שיטה זו מאפשרת הכנסת DNA פלסמידי ללא תגובה דלקתית משמעותית לניתוח תפקוד גנים ומבנה חלבונים בגוף חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לשיה יו (Regeneron Pharmaceuticals) להתחלה מלמד אותנו את הטכניקה וHGD ד&quot;ר ראסל תומסון (אלברט איינשטיין לרפואה) להדרכה המתמדת שלו בהיבטים שונים של הטכנולוגיה. עבודה זו מומנה על ידי Hunter College, CUNY להתחיל את הקרנות ופרס NSF לחם IOS-1,249,166. אנו מודים NYULMC histopathology Core מרכז NYUCI תמיכת גרנט, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 להיסטולוגיה בכבד עכבר.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+therapeutic-level+hepatic+gene+expression+of+human+factor+IX+after+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo.</a> Mol Ther. 3, 947-957 (2001).</li>
<li>Magin-Lachmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+delivery+of+intact+BAC+DNA+--+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods.</a> J Gene Med. 6, 195-209 (2004).</li>
<li>Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+human+hepatitis+delta+virus+genome+Is+initiated+in+mouse+hepatocytes+following+intravenous+injection+of+naked+DNA+or+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences.</a> J Virol. 75, 3469-3473 (2001).</li>
<li>Giladi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+inhibits+hepatitis+B+virus+replication+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice.</a> Mol Ther. 8, 769-776 (2003).</li>
<li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector-based+in+vivo+RNA+interference%3A+dose-+and+time-dependent+suppression+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).</li>
<li>Layzer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activity+of+nuclease-resistant+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.</a> Rna. 10, 766-771 (2004).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA interference in adult mice.</a> Nature. 418, 38-39 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+hepatitis+C+translational+initiation+in+vitro%2C+in+cultured+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice.</a> Mol Ther. 5, 676-684 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+and+specific+morpholino+antisense+inhibitor+of+hepatitis+C+translation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.</a> Hepatology. 38, 503-508 (2003).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroporation+as+the+mechanism+of+hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery.</a> Gene Ther. 11, 675-682 (2004).</li>
<li>Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+uptake+and+gene+expression+mechanisms+following+intravenous+administration+of+plasmid+DNA+by+conventional+and+hydrodynamics-based+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures.</a> J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+procedure+involves+transient+hyperpermeability+in+the+hepatic+cellular+membrane%3A+implication+of+a+nonspecific+process+in+efficient+intracellular+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.</a> J Gene Med. 6, 584-592 (2004).</li>
<li>Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+and+its+applications+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.</a> Pharm Res. 28, 694-701 (2011).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+principle%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress.</a> Aaps J. 11, 671-681 (2009).</li>
<li>Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+what+we+know+and+what+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: what we know and what is next.</a> Aaps J. 9, (2007).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+hydrodynamic+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery.</a> Gene Ther. 14, 99-107 (2007).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamics-based+procedure+for+controlling+the+pharmacokinetics+of+gene+medicines+at+whole+body%2C+organ+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery.</a> Adv Genet. 54, 65-82 (2005).</li>
<li>Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+delivery+of+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+to+livers+of+mice+by+hydrodynamic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection.</a> Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).</li>
<li>Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-based+in+vivo+monitoring+of+NF-kappaB+activity+through+a+gene+delivery+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach.</a> Cell Commun Signal. 11, (2013).</li>
<li>Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery of DNA.</a> Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).</li>
<li>Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+expression+of+naked+plasmid+DNA+encoding+hepatocyte+growth+factor+in+mice+promotes+liver+and+overall+body+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth.</a> Hepatology. 33, 848-859 (2001).</li>
<li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4, 333-341 (2002).</li>
<li>Hen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+foreign+genes+in+chicks+by+hydrodynamics-based+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Domestic+animal+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo.</a> Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).</li>
<li>Eastman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li>
<li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li>
<li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+Epidemiology+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li>
<li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li>
<li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trypanolytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li>
<li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li>
<li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li>
<li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li>
<li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+lytic+factor%2C+a+subclass+of+high-density+lipoprotein%2C+forms+cation-selective+pores+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li>
<li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li>
<li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li>
<li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li>
<li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li>
<li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאשר מבוצע כהלכה, HGD הוא אמצעי בטוח ויעיל להפליא של משלוח transgene. השלבים הקריטיים לHGD המוצלח הם: 1) מספק את הכמות הנכונה של ה-DNA בנפח גדול של מי מלח רכב 2) לוריד הזנב של עכבר 3) בפחות מ -8 שניות. למרות התהליך של הזרקה עצמה ללא ספק דורש קצת מיומנות ידנית, ההצלחה של הליך שש שני זה לעתים קרובות נמצאת בהכנה קפדנית של הניסוי. כמות pDNA הדרושה כדי להשיג ביטוי גנים מקסימאלי עשויה להשתנות במידה רבה בהתאם לפלסמיד המ...

מאז התיאור הראשון שלה על ידי יו et al. וג&#39;אנג et al., משלוח הידרודינמית גן (HGD) הפך לכלי רב ערך ללימוד תפקוד גן במערכות מכרסמים מודל 1, 2. הטכניקה כרוכה בהזרקה המהירה (5-7 שניות) בהיקפים גדולים (8-12% ממשקל גוף) של פתרון לוריד הזנב של עכברים כדי להקל על הספיגה של ה-DNA פלסמיד על ידי התאים של אברי מטרת 1, 2. תנאים אלו מובילים לביטוי גנים חזק בכבד ובביטוי פחות גנים בכליות, טחול, הריאות ולב. הזרקה של 10 מיקרוגרם פלסמיד pCMV-LacZ יכולה transfect ככל 40% מhepatocytes, מה שהופך HGD השיטה היעילה ביותר, לא ויראלי, in vivo מסירת הגן עד כה 1. בניגוד לנישאים נגיפיים, pDNA הוא קל להכנה, לא לעורר תגובה חיסונית במארח המכרסם 3 ואינו מהווה סיכון בריאותי על ידי recombining עם הסוףוירוסי ogenous. בנוסף, מאחר שמולקולות ה-DNA מועברות על ידי HGD לא צריכה אריזה, שיטה זו מתאימה למשלוח של כרומוזומים בקטריאלי מלאכותיים (BAC) גדולים כמו 150 KB 4. סוגים אחרים של מולקולות שכבר נמסרו על ידי שיטה הידרודינמית כוללים RNA 5-10, 11 morpholinos, חלבוני 12, 13 ומולקולות קטנות אחרות 12, 14. היתרונות והחסרונות של HGD על פני שיטות משלוח אחרות כבר נדונו בביקורות מצוינות בספרות 15-20 ומספר המחברים סיפק תיאור מפורט של ההליך 21-23. היכרות transgenes לעכברים על ידי HGD היא בטוחה ויעיל 1-3, 24 והשיטה נעשתה שימוש בחולדות עם הצלחה דומה 25. עם שינויים מסוימים, ניסויי הוכחה של הקונספט בוצעו בתרנגולות 26, ראבביטים 27 וחזירים 28, אם כי, vivo היישום בטכניקה זו בבעלי חיים גדולים יותר עדיין מהווה אתגר. בעת השימוש בשיטה זו, עוד הגבלה נפוצה היא שרבים מוקטורי הביטוי היונקים הזמינים חסרים את המרכיבים כדי להשיג רמה גבוהה מתמשכת, של ביטוי גנים. באמצעות פלסמיד, ביטוי גני pCMV לוק באברי המטרה ניכר כבר בעשר דקות לאחר HGD, לעומת זאת, רמת הביטוי הראשונית, הגבוהה יורדת בצורה חדה בשבוע שלאחר הזרקת 1 הראשון. ביטוי transgene ארוך טווח אפשרי בהתאם לאמרגן ואינטרון השתמש בפלסמיד עיצוב 3, 24 זריקות עם זאת, תחזוקה של ביטוי גנים ברמה הגבוהה דורשת לעתים קרובות חוזרות ונשנות. מסיבה זו, HGD עשוי להיות פחות מתאים ללמוד מחלות כרוניות שהן תוצאה של חשיפה ארוך טווח לחלבונים מזיקים או מוצרי חלבון. עם המגבלות האלה, HGD הוא כלי רב עוצמה במיוחד ללימוד פותפקיד tential של גן ואת ההשפעה שלו מוטציות in vivo, כמו גם את ההשפעות והרגולציה של חלבונים הטיפוליים ולהקמת מודלים של בעלי חיים למחלות (לסקירה, ראה 15). לדוגמא, HGD ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציה לתחומים וחומצות אמינו של חלבונים על ידי החדרת בנפרד מבני גנים שונים לעכברים שהגנים המתאימים בנוקאאוט. יתר על כן, בטכניקה זו ניתן להשתמש בכל זן עכבר. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים עם דגש על ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להשיג transfection המוצלח: החדרת מחט נכונה לוריד, הזרקת הנפח ומהירות המשלוח. יישומה של שיטה זו בא לידי הביטוי במודל של עכברים של trypanosomiasis אפריקה, מחלה של בני אדם ובעלי חיים קטלנית 29, 30. בעוד כמה מינים של trypanosomes לגרום למחלות בבעלי חיים, רוב לא יכול לגרום למחלה בבני אדם בשל מולדת מתחמים חיסוניים בבגורמי עונג עילאי טבע דם הנקראים trypanosome ממס (TLFs) 29, 31 ב, 32. , ליפופרוטאינים אלה יוצרים הנקבוביות בצפיפות גבוהה (HDL) מכילים שני חלבונים ייחודיים, הפרימטים ספציפיים:. HPR, ליגנד, המאפשר את הספיגה של TLFs לtrypanosomes, ותתנצ-I, את רכיב ממס ביום 31 ב, 33-38 Trypanosoma rhodesiense brucei הוא מסוגל להדביק בני אדם בשל ביטוי של חלבון בסרום הקשורים התנגדות (SRA) שנקשר ומנטרל תתנצ-אני אדם 34, 39. בון TLF לא נוטרל על ידי SRA בשל תתנצ-חלבון מסתעף 40. כפי שדווח בעבר, באמצעות וקטור יונקים ביטוי (pRG977), ביטוי מהונדס של רכיבי TLF בון בעכברים מקנה הגנה מפני trypanosomes אדם זיהומיות 40. הנתונים שהוצגו כאן הנציג להדגים כיצד מסירת גן הידרודינמית ניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של חלבון.

ערכת מגבון <table><tbody><tr><td>הכנה לאלכוהול</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST, Amplite Colorimetric</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי, 50 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד ערכת מקסי</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>מאיר זנב עכבר</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>או מחט שוות ערך</td></tr><tr><td>, 20 Gx 1 (0.9 מ"מx25 מ"מ)מחט</td> <td>305175</td><td></td> <td>BD</td></tr><tr><td>, 27 Gx 1/2 (0.9 מ"מx25 מ"מ)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (וקטור ביטוי יונקים)</td><td>נדרש הסכם העברת חומרים</td> <td>של Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי, 0.9% INJ USP 10 מ"ל, Hospira&nbsp;</td><td>מזרק פישר</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>, 3 מ"ל, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Luer Lock הכרחי כדי לעמוד בלחץ מ-HGD</td></tr></tbody></table>

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

ביטוי יעיל של transgenes in vivo הוא בעלת חשיבות מכרעת בלימוד תפקוד גן ובפיתוח טיפולים למחלות. בשנים האחרונות, משלוח הידרודינמית גן (HGD) התפתחה כשיטת פשוטה, מהירה, בטוחה ויעילה לאספקת transgenes למכרסמים. טכניקה זו נשענת על הכוח שנוצר על ידי ההזרקה המהירה של כמויות גדולות של פתרון פיסיולוגי כדי להגדיל את החדירות של קרום תא של איברי perfused ובכך להעביר דנ&quot;א לתוך תאים. אחד היתרונות העיקריים של HGD הוא היכולת להציג transgenes לתאי יונקים באמצעות DNA עירום פלסמיד (pDNA). היכרות עם גן אקסוגני באמצעות פלסמיד היא מינימאלי מייגע, יעיל ביותר ובניגוד לנישאים נגיפיים, בטוח להפליא. HGD שימש בתחילה להעברת גנים לעכברים, הוא משמש כעת כדי לספק מגוון רחב של חומרים, כולל oligonucleotides, כרומוזומים מלאכותיים, רנ&quot;א, חלבונים ומולקולות קטנות לעכברים, חולדותו, במידה מוגבלת, בעלי חיים אחרים. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים ומתמקד בשלושה היבטים מרכזיים של השיטה שהן קריטיים לביצוע ההליך בהצלחה: הכנסה נכונה של המחט לווריד, נפח ההזרקה ומהירות המשלוח. ניתנות דוגמאות כדי להראות את יישומה של שיטה זו לביטוי החולף של שני גנים המקודדים חלבונים מופרשים, הפרימטים ספציפיים, אפוליפופרוטאין LI (תתנצ-I) וחלבונים הקשורים לhaptoglobin (HPR).

מיקום נכון של המחט לוריד הזנב של העכבר (כפי שמודגם באיור 1) הוא תנאי הכרחי לאספקת transgene בהצלחה על ידי transfection מבוסס הידרודינמיקה. לעתים קרובות החלק המאתגר ביותר של הטכניקה, לעומת זאת, הוא השמירה של המחט בתוך וריד הזנב ללא תנועה כך שכל הנפח של הזריקה יכול להיות מועבר בתוך תקופה של 6-8. טעויות קטנות במהלך תהליך ההזרקה עלולות לגרום ליעילות transfection מופחת בהרבה וביטוי חלבון. לכן, זה הכרחי כדי לפקח על ההצלחה של HGD עבור כל ניסוי. אם החלבון המהונדס של עניין...

בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבטא גנים באופן זמני בעכברים באמצעות הולכה גנטית הידראודינמית (hydrodynamic gene delivery או HGD). העכברים נשקלים, ונערך נפח מתאים של תמיסת סלין המכילה plasmid DNA, אשר נטען לתוך מזרק.לאחר מכן מחממים את העכבר כדי להרחיב את כלי הדם בזנב ומניחים אותו במכשיר קיבוע תוך שימוש בעורק הגבי (dorsal artery). כנקודת ייחוס, מאתרים את הוורידים הצדיים (lateral caudle veins) ומזריקים את תערובת ה-DNA במי מלח לאחד מהם. לבסוף, מוציאים את העכבר ממכשיר הקיבוע ומניחים אותו על משטח חימום לצורך התאוששות.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של טרנסג'ן באמצעות ניטור רמות חלבונים בדם בשיטת Western blot. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון ביטוי באמצעות עירוי ויראלי, הוא שהחדרה הידרודינמית של גנים מאפשרת שימוש ב-DNA עירום, אשר פשוט לייצור, בטוח לשימוש וסובל מפחות מגבלות לגבי הגודל. אני דניאלה קובאצ'יץ'.אני פוסט-דוקטורנט במעבדה של ד"ר Jane Raper, ואני אדגים את השיטה הזו. התחילו את ההליך באמצעות טוש Sharpie לסימון גבם של עכברים לבנים כדי לציין את קבוצת הניסוי שלהם; רעננו את הסימונים עם הזמן לפי הצורך. ביום הניסוי, שקלו כל עכבר בנפרד במגש שקילה לבעלי חיים או בדלי שהונח על מאזניים דיגיטליים של מעבדה.רשמו את משקלם של העכברים בהתאם להוראות במסמך המצורף.

transient-expression-of-proteins-by-hydrodynamic-gene-delivery-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מציגים את הפרוטוקול להזרקה הידרודינמית של פלסמידים לאגן הכליה של הכליה של הכליה של העכבר לצורך העברת חומצות גרעין. טכניקה זו מאפשרת העברה ספציפית של פלסמידים על ידי ניצול עקרון הלחץ ההידרוסטטי הגבוה, אשר דוחף בכוח את הפלסמידים לאתר הספציפי מבלי לגרום לפגיעה ברקמות.

הזרקת אגן כליות הידרודינמית: טכניקה להעברת DNA ישירות לתאי כליות של מודל מורין

סרטון זה מתאר את הטכניקה של טרנספקציה גנטית in vivo של הפטוציטים של מורין על ידי הזרקת ורידים הידרודינמיים בזנב. מערכת טרנספקציה זו יוצרת ביטוי ארוך טווח של הטרנסגן בהפטוציטים.

העברת גנים הידרודינמיים: טכניקה לטרנספקציה In vivo של DNA אקסוגני בהפטוציטים של מורין באמצעות הזרקת ורידי זנב

עכברים מהונדסים או וקטורים נגיפיים היו בשימוש כדי להגדיל את ביטוי חלבון בתוך הריאה. עם זאת, הטכניקות האלה הן זמן רב, מאתגרים מבחינה טכנית ויש השפעות מחוץ היעד שיכול לבלבל את התוצאות. פרוטוקול transfection שלנו משתמש בחלבון מגיב transfection מבוסס שומנים וmicrosprayer ultrafine כדי לספק חלבון פעיל באופן אחיד לתאי ריאה.

Transfection החלבון של ריאות מאוס

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

בכתב יד זה, מתוארת שיטה להכנת וקטורים רקומביננטיים של נגיף 9 הקשור לאדנו-9 (rAAV9) למניפולציה של ביטוי גנים בלב העכבר.

גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

פרוטוקול זה מתאר שיטה להחדיר פלסמיד DNA לתוך הכליה העכבר באמצעות אגן הכליה כדי לייצר transgene ביטוי במיוחד בתוך הכליה.

הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.

הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

למדו להביע חלבונים באופן חולף בעכברים באמצעות הידרודינמית משלוח ג'ין. שיטה זו מאפשרת הכנסת DNA פלסמידי ללא תגובה דלקתית משמעותית לניתוח תפקוד גנים ומבנה חלבונים בגוף חי.

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג'ין משלוח בעכברים

גלה סרטונים נוספים