היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב
May 8th, 2014
bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מיקרו-מערכי ממברנה ביולוגית בשיטת הכנה פשוטה. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של חרוזי סיליקה עם ממברנות דו-שכבתיות של שומנים. השלב השני של ההליך הוא הפקדת החרוזים המצופים בשומנים על מצע הסיליקון microwell.
השלב השלישי הוא הסרת חרוזים לא במיקרו בארות, באמצעות מגב פולימתיל סובוקסן. השלב האחרון הוא לדמות את מערכי החרוזים המצופים בשומנים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע קבועי קשירה לאינטראקציות שומנים רעילנים באמצעות גישת הדמיית מערך.
ניתן להשתמש בשיטה זו ליצירת מערכים של שכבות שומנים דו-שכבתיות נתמכות כדוריות וחלקיקי ממברנה טבעיים שמקורם בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמלבד ייצור המיקרו-בארות, הטכניקה אינה דורשת שינוי כימי של המצע או של ממברנות השומנים כדי ליצור מערכי ביו-ממברנה מוגדרים מרחבית. ניתן להרחיב את היישומים של טכניקה זו לזיהוי ללא תוויות של אינטראקציות חלבון שומנים באמצעות פלזמה ותהודה על פני השטח המבוססים על מערכי חורי מתכת ננומטריים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות חלבון שומנים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מחקרים על הידבקות מוקדית תאית, מערכי בארות מיקרו ותכשירי מגב מפורטים בפרוטוקול הטקסט. סרטון זה מתחיל בהכנת שלפוחית. תחילה בתערובת בקבוקון זכוכית קטנה, השומנים המרכיבים לשלפוחית.
בסך הכל חצי מיליגרם של שומנים נמצאים בתמיסה זו תחת ייבוש ואקום של התערובת למשך שש שעות. לאחר מכן, הכינו תמיסת נתרן כלורי 0.1 מולרית והוסיפו חצי מיליליטר לשומנים המיובשים. הניחו לתערובת לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
למחרת, מערבל את התערובת כדי לתלות את השלפוחית. לאחר מכן סוניקציה של התערובת למשך 20 דקות באמבטיה, סוניקציה בטמפרטורת החדר. לאחר הסוניקציה, הוצא את המתלה דרך מסנן קרום פוליקרבונט 100 ננומטר.
העבירו את המתלה דרך מסנן האקסטרוזיה בסך הכל 17 פעמים. לאחר מכן אחסן את השלפוחיות המוחצנות בבקבוקון זכוכית בארבע מעלות צלזיוס. תחילה השתמשו בחרוזי צורן דו חמצני בקוטר 700 ננומטר.
הכינו תרחיף של 15 מיליארד חרוזים בנתרן כלורי 0.1 מולארי. מערבל את המתלה ואז צנטריפוגה אותו ב-1700 Gs למשך 20 דקות והשליך את הסופרנטנט. חזור על הכביסה על ידי החייאה, השהה את החרוזים במיליליטר נוסף של תמיסת מלח וסובב אותם למשך 20 דקות נוספות.
לאחר מכן חזור על התהליך בפעם השלישית ליצירת שכבות השומנים הנתמכות הכדוריות או SSBs. מערבבים 25 מיקרוליטר מתלה חרוזי הסיליקון הדו חמצני עם 200 מיקרוליטר של מתלה השלפוחית מהסעיף הקודם. מערבל את התערובת והדליק אותה דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת בחום של 1700 גרם למשך 20 דקות.
השליכו את הסופרנטנט. הכדור ורוד עד לשלפוחיות קרועות עם שורה DPPE על החרוזים. השעו אותו ב-225 מיקרוליטר PBS ב-PH 7.4.
חזור על שלבי הסיבוב וההשעיה של Resus פעמיים כדי להסיר את השלפוחיות הלא קרועות ולהשלים את יצירת ה-SSBs. חלקו פרוסות של מערכי מיקרו בארות לחתיכות מלבניות עם ארבעה עד שישה מערכים כל אחד. לאחר מכן, מערבולת, מתלה ה- SSLB מהסעיף הקודם ומעביר 10 מיקרוליטר לכל מערך באר מיקרו.
המתן שעה עד שה-SSBs יתייצבו מאוחר יותר. שטפו את שבבי המערך עם PBS בעדינות וטבלו את המערך לתוך PBS באמצעות החלקת המגב על פני השבבים השקועים חמש פעמים. זה מסיר SLPs לא בתוך בארות המיקרו
.לאחר מכן, אחזו בכל שבב מערך בפינצטה ונערו בעדינות את ה-PBS. לאחר מכן העבירו אותו לאמבט PBS טרי. המשטחים העליונים של השבבים חייבים להישאר רטובים.
מוציאים שבב מהאמבטיה ו-W. רוב ה-PBS עם מגבון מעבדה. השאירו מספיק PBS כדי לשמור על לחות המערך.
כעת הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת BSA למערך כדי לחסום כריכה לא ספציפית. אפשר למערך לדגור במשך שעה. בקופסה לחה מאוחר יותר, הסר את ה- BSA עם מיקרו פיפטה והוסף 200 מיקרוליטר תמיסת רעלן כולרה.
לאחר מכן החזר את המערך לתא הלח. המתן שעה נוספת, ואז שטוף את המערך עם PBS ונדף עודפי PBS עם מגבון ברכיים. לאחר מכן הנח את שבב המערך על שקופית מיקרוסקופיה רגילה והצמד למערך פתק כיסוי מרובע בגודל 24 על 40 מילימטר והמשך בהדמיה.
ניתוח תמונה יכול להיעשות עם התמונה J.פונקציות ניתוח חלקיקים אוטומטיות. לאחר מכן, עבור כל מערך, סכם את העוצמות הממוצעות של ה-SSBs הבודדים כהיסטוגרמות. לאחר שימוש בשיטות המתוארות, שטח מרובע של 100 מיקרון במערך מציג 936 SSBs.
בעוד שנתוני התפוסה חושבו והיסטוגרמה של עוצמות פלואורסצנטיות SSLB נוצרה לאחר שבוע באחסון. אותו מערך נותח מחדש באותו אופן, ולא היה שינוי בעוצמות הפלואורסצנטיות או בתפוסת המערך. תצהיר רציף של SSBs שונים עם סמני זיהוי שונים היה אפשרי גם בשיטות המתוארות.
ה-SSBs השני הופקדו בעשירית אחת. ריכוז ה- SSBs הראשונים שהופקדו. שכבת-על של שני הסמנים מוצגת לניסוי.
המערכים יוצרו עם SSBs עם ריכוזים שונים של GM one ונחשפו לריכוז קבוע של רעלן כולרה. ההיפוך בוצע גם כדי לקבוע את קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל. עבור GM אחד.
מערכי קשירת רעלן כולרה יכולים להיות עשויים גם מממברנות ביולוגיות טבעיות, כגון מערך זה העשוי מחלקיקי מיאלין. הוא מסומן בפלואורו ליפופילי ארבע FM 1 43. רפסודות שומנים מועשרות בכולסטרול וגנגליוסידים כגון GM one.
לפיכך, רעלן כולרה מצומד Alexa 4 88 נקשר חזק למיקרו-מערכי רפסודות שומנים, לעומת זאת, עדן מופשט עם תווית פלואורסצנטית אינו נקשר למערכים אלה. מערך נוצר על ידי אספקת רפסודות מיאלין ושומנים לבארות המיקרו באמצעות שבב מיקרופלואידית עם תעלות של 250 מיקרון. הוא סומן באנטי-אוליגודנדרוציטים IgM וה-S סולפיד שנמצא במיאלין סומן, אך רפסודות השומנים לא.
לא לאחר הכנת החרוזים המצופים בבטור השומנים. ניתן להשתמש בטכניקה זו להכנת מערכים תוך שעה אם מבוצעת כראוי, לאחר יצירת מערכי חלקיקי ממברנה טבעיים. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון פלזמה ותהודה של פני השטח של ננו-חורים לחישה ללא תוויות של אינטראקציות ביו-מולקולריות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מערכי ממברנה ביולוגית באמצעות חרוזים מצופים בשכבת מרה ליפידים וחלקיקי ממברנה טבעיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת מערכי מיקרו-ממברנות ביולוגיות באמצעות דו-שכבות שומנים תומכות. התהליך כולל ציפוי כדורי סיליקה עם דו-שכבות שומנים והפקדתם על מצע מיקרו-בארות סיליקון.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- כימיה אנליטית
רקע
- דו-שכבות שומנים תומכות מחקות תכונות של קרום התא.
- ניתן להשתמש בחלקיקי קרום טבעיים באסטרטגיות אנליטיות שונות.
- מערכי מיקרו מאפשרים את המחקר של אינטראקציות ביו-מולקולריות.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשת לדמיית המערכים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה פשוטה להכנת מערכי מיקרו-ממברנות ביולוגיות.
- לאפשר את קביעת קבועי הקישור לאינטראקציות רעל-שומן.
- לשפר את היכולות האנליטיות בחקר דינמיקה של קרום.
שיטות ששימשו
- ציפוי כדורי סיליקה בדו-שכבות שומנים.
- הפקדת כדורים מצופים שומנים על מצע מיקרו-בארות סיליקון.
- הסרת כדורים שאינם במיקרו-בארות באמצעות מגבת פולימתיל סובקסן.
- דמיית מערכי הכדורים המצופים שומנים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של מערכי מיקרו מצופים בדו-שכבת שומנים.
- דמייה מודגמת של מערכי כדורים מצופים שומנים.
- יישום פוטנציאלי במחקר אינטראקציות שומנים עם רעלים.
- סיפקה מתודולוגיה פשוטה ויעילה לחוקרים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת יצירת מערכי מיקרו-ממברנות ביולוגיות פונקציונליים.
- ניתן להשתמש בה עבור יישומי אנליזה שונים במדעי המוח ובביולוגיה.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את האינטראקציות הנחקרות באמצעות שיטה זו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables the creation of stable, high-density supported lipid bilayer arrays for studying biomolecular interactions without chemical modification of substrates or membranes. It supports target validation and assay development by providing a reproducible platform for quantifying ligand-receptor binding, such as cholera toxin to ganglioside GM1, with long-term stability and multiplexing capability. The approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by isolating membrane-specific interactions in a controlled, scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-protein interactions in a defined membrane environment to validate targets like ganglioside GM1.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative binding measurements using fluorescence intensity histograms.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by measuring binding constants in a disease-relevant membrane system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized SLB arrays with >75% well occupancy and consistent fluorescent readouts for reliable compound screening.
- Reproducibility: Maintains signal stability over one week, enabling longitudinal assay performance and cross-run comparison.
- Multiplexing Capability: Allows serial deposition of different SSLBs to profile multiple lipid targets in a single array format.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses natural membrane particles (e.g., myelin-derived lipid rafts) to study cell-specific membrane components in pathophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling biomarker-aligned assays, such as ganglioside enrichment in lipid rafts.
- Risk De-risking: Supports go/no-go decisions by providing predictive binding data from native-like membranes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid-mediated mechanisms by isolating bilayer properties from cellular complexity.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via fluorescence intensity of individual SSLBs for hit confirmation.
- Analytics: Enables binding constant determination through histogram analysis of SSB intensities under varying ligand concentrations.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using natural membrane particles to reflect disease-relevant lipid composition.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple targets via sequential deposition without substrate re-functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions by reducing false positives from non-specific binding.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through bead-based self-assembly and squeegee purification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content screening with minimal reagent consumption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane targets based on quantitative interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation, bead functionalization, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to microfabricated microwell arrays and controlled extrusion equipment for vesicle sizing.
- Necessitates standardization of washing and blocking steps (e.g., BSA incubation) to minimize noise across arrays.
- Adaptation to different membrane systems requires optimization of bead-to-lipid ratios and incubation times.
- Practical limitation: Array occupancy is typically >75%, leaving some wells empty, which must be accounted for in data analysis.
