הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה במבחנה יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב גנים של גאג שמקורם בתת-סוג CHIV אחד אנשים נגועים בפלסמיד HIV אחד מוכשר לשכפול. על מנת להעריך את ההשפעה של פולימורפיזמים של רצף gag על יכולת שכפול HIV אחד במבחנה, זה מושג על ידי הגברה ראשונה של גן ההקאה מפלזמת המטופל. השלב השני הוא לשכפל את רצף הגאג הנגזר מהמטופל לשיבוט המולקולרי הזיהומי המוכשר MJ 4.

לאחר מכן, פלסמיד הכימרה של גאג MJ ארבע עובר טרנספטציה על מנת ליצור מלאי ויראלי זיהומי ועובר טיטרציה כדי להעריך את ההדבקה בקו תאי אינדיקטור. השלב האחרון הוא מדידת יכולת שכפול במבחנה בקו תאי ה-T G XR 25. בסופו של דבר, בדיקת טרנסקריפטאז הפוך עם תווית רדיו משמשת לכימות ייצור הוויריונים לאורך זמן על מנת להמחיש קינטיקה של שכפול ויראלי.

השיטה שאנו הולכים לתאר היום יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ה-HIV. אלה כוללים הגדרת הגורמים הקובעים של כושר שכפול HIV והבנה כיצד כושר HIV משפיע על פתוגנזה ארוכת טווח. מי שיתארו את השיטות היום יהיו ג'סיקה פרינס ודן קלבן, שניים מהסטודנטים שלי לתארים מתקדמים.

כדי להתחיל בהליך זה, תמלל הפוך CDNA מ-RNA והגביר את תוצרי ה-DNA העגולים הראשונים באמצעות טרנסקריפטאז הפוך ו-DNA פולימראז יציב תרמו ב-RT PCR שלב אחד. לאחר מכן באמצעות מיקרוליטר אחד של הגברת ה-PCR בסיבוב הראשון כתבנית ה-DNA, בצע הגברת PCR סיבוב שני מקונן. לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של חמישה x צבע טעינה לחמישה מיקרוליטרים מנפח התגובה של הסיבוב השני.

הפעל אותו ב-120 וולט על ג'ל TAE של 1%aros המכיל כתם DNA פלואורסצנטי UV עד לפתרון הרצועות. לאחר מכן דמיין את רצועות ה-1.6 KB על תאורת אור כחול. לאחר מכן, הפעל את נפח התגובה הנותר של 45 מיקרוליטר על ג'ל TAE של 1%aros המכיל את כתם ה-DNA.

הסירו את הרצועות המתאימות בעזרת סכין גילוח נקי ושלבו שלוש תגובות חיוביות לכל אדם. לאחר מכן יש לחלץ DNA מפרוסת הג'ל באמצעות ערכת טיהור ג'ל ולשים אותו במים נטולי נוקלאז. הקפיאו את המוצר במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש בהמשך הליך זה.

לאחר הגברת הטרמינל הארוך, חזור על חמישה אזורי UTR ראשוניים של הפלסמיד MJ ארבעה. דמיין את מוצרי ה-1.3 KB PCR על המאיר, הסר את המגברים החיוביים ולאחר מכן טהר והקפיא אותם כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, צור את ה-MJ המותך ארבעה מגפרי גאג LTR באמצעות PCR מאריך חפיפה של אחוי.

הדמיה, מסירה, טיהור והקפאה של המגבר באורך 3.2 kb. כעת עכל 1.5 מיקרוגרם של MJ ארבעה פלסמיד ו -1.5 מיקרוגרם של מוצר LTR מטוהר gag PCR עם BCL אנדונוקלאז הגבלה אחת למשך 1.5 שעות ב -50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של NGOM four לתגובת העיכול ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, הוסף חמישה x צבע טעינה לתגובות עיכול ההגבלה. לאט לאט אלקטרופורזה הנפח הכולל על ג'ל TAE של 1% המכיל כתם DNA למשך שעה עד שעתיים ב -100 וולט. דמיין, כרת וטהר את הרצועות המצוינות לשיבוט כפי שתואר קודם לכן.

לאחר מכן, הכינו את תגובות הקשירה באמצעות גאג LTR מטוהר. הכנס DNA של MJ ארבעה וקטורים ביחס של שלושה לאחד הכנסה לווקטור. דגרו את תגובות הקשירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הפוך חיידקים בעלי יכולת כימית JM 1 0 9 עם מוצרי קשירה המפוזרים על צלחות מקדחה LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר. אמפיצילין מגדל חיידקים שעברו טרנספורמציה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות לפחות. כדי לאשר את נאמנות השיבוט, חתכו את ה-DNA המיני עם אנזימי הגבלה NGO M four ו-HPA one בעיכול כפול ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, נתח אותו על 1%aros. TAE ג'ל. חשב את נפח הנגיף הדרוש מכל מלאי על סמך ה-IU לטיטר מיקרוליטר מבדיקת תאי TZM BL על מנת להדביק חמש פעמים 10 ל-G XR החמישי שני חמישה תאים בריבוי הדבקה של 0.05.

הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לעבודה עם HIV מוכשר לשכפול, הכולל חלוק מלא, מסכת פנים וכפפות כפולות ביום ההדבקה. מוציאים את מלאי הנגיפים מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ומפשירים. לאחר מכן, יש לדלל את הנגיף במדיה C-R-P-M-I לנפח של 100 מיקרוליטר.

על מנת להשיג MOI של 0.05 הוסף אותו לצלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמות vbo, כולל בקרה חיובית ושלילית בכל קבוצה של ניסויי שכפול והגדר את הצלחת כך שכל עמודה שנייה תהיה ריקה כדי להגביל זיהום צולב בין בארות. לאחר מכן, ספרו את ה-GXR שני חמישה תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וחשבו את מספר התאים הדרושים בסך הכל לכל הזיהומים. יש להכניס את הנפח הנדרש לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה כדי לגלול את התאים.

לאחר מכן שאפו את המדיה בזהירות והשעו מחדש ב-C-R-P-M-I בריכוז של חמישה פעמים 10 עד חמישית תאים ל-100 מיקרוליטר, פיפטו את התאים לשוקת סטרילית וערבבו היטב. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת 96 הבארות המכילה את הנגיף המדולל וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של חמישה מיליגרם לתמיסה של מיליליטר של מוח פולי לכל באר וערבב היטב את התאים.

לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה עם 5% CO2 למשך שלוש שעות על מנת לשטוף את צנטריפוגת התאים הנגועים. הצלחת התחתונה של 96 באר V לכדור התאים. לאחר מכן הסר בזהירות 150 מיקרוליטר מהמדיום והחלף ב-150 מיקרוליטר טריים של C-R-P-M-I מבלי להפריע לכדור התא.

חזור על ההליך פעמיים נוספות כדי לשטוף מספיק את התאים לאחר הצנטריפוגה האחרונה ותוספת של 150 מיקרוליטר C-R-P-M-I להשעות מחדש את גלולת התא עם פיפטה רב-ערוצית. מוסיפים את התערובת מכל באר ל -800 מיקרוליטר C-R-P-M-I בבאר של צלחת תרבית רקמות 24 בארות. לאחר מכן הניחו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כל יומיים.

העבירו 100 מיקרוליטר של סופרנטנט מפני השטח של התרבות היטב לבאר של 96 באר את הצלחת התחתונה שלכם והקפיאו לניתוח לאחר מכן באמצעות בדיקת RT, ואז השעו מחדש את התאים ביסודיות והסירו מחצית מהנפח שנותר כדי למנוע צמיחת יתר של תאים. לאחר מכן, שחזר את הנפח המקורי על ידי הוספת 550 מיקרוליטר של C-R-P-M-I טרי לכל באר בהליך זה, הוסף אחד עד שניים מיקרוליטר של 10 מיליקורי למיליליטר DTTP וארבעה מיקרוליטר של DIO טוחנת אחת שלושה אטול לכל מיליליטר אחד של תערובת המאסטר שלנו. מערבבים בזהירות כל צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר של RT master mix DTT ו-DTTP עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר ומעבירים לשוקת סטרילית.

לאחר מכן מחלקים 25 מיקרוליטר של RT מסומן. מערבבים לכל באר של צלחת PCR דקה היטב. הוסף חמישה מיקרוליטר מכל סופרנטנט לצלחת ה-PCR המכילה את תערובת המאסטר RT. לאחר מכן אטמו את צלחת ה-PCR עם מכסה נייר כסף דבק ודגרו במשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס בתרמוסיקלר לאחר הדגירה, צרו חורים קטנים במכסה נייר הכסף באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 200 מיקרוליטר.

מערבבים את הדגימות חמש פעמים. העבירו חמישה מיקרוליטר מכל דגימה לנייר DE 81 והניחו לכל הדגימות להתייבש באוויר למשך 10 דקות. הניחו את הכתמים במיכלי כביסה נפרדים.

לאחר מכן שטפו את הכתמים חמש פעמים עם XSSC אחד. לאחר מכן פעמיים עם 90% אתנול למשך חמש דקות בכל כביסה לפני שנותנים להם להתייבש באוויר. לאחר הייבוש, עטפו בזהירות את הכתם בניילון סרן וחשפו אותו למסך הפוספו בקסטה אטומה היטב למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

לאחר שתהיה מוכן, נתח את מסכי הפוספו עם הדמיית פוספו וכימת את התעתיקים הרדיואקטיביים. המוצג. להלן תמונות הג'ל המייצגות המתארות את ההפרדה האלקטרופורטית של אמפליקוני ה-PCR השונים הדרושים ליצירת אמפליקון גאג שמקורו במטופל המסוגל להיות משובט לתוך עמוד השדרה של MJ 4 פלסמיד. תמונת ג'ל מייצגת זו מתארת את ההפרדה האלקטרופורטית של מעכלי הגבלה לשיבוט גנים של גאג מטופלים ל-MJ 4.

ותמונת הג'ל הייצוגית הזו מתארת את ההפרדה האלקטרופורטית של מעכל הגבלה מטוהר MJ ארבע כימרה פלסמיד DNA. גרף זה מציג את יכולת השחזור של מבחן השכפול לאורך זמן בקו G XR שניים חמישה תאים. אותו גאג MJ ארבעה וירוסים כימריים שימשו להדבקת G XR שני חמישה תאים בשני ניסויים עצמאיים שבוצעו בהפרש של כשנה.

ציוני השכפול נוצרו על ידי חישוב השיפוע של ערכי DLU שעברו טרנספורמציה ונורמליזציה של שיפוע זה לסוג פראי MJ ארבע. שתי המדידות הבלתי תלויות קשורות זו לזו ומדגישות את יכולת השחזור של בדיקות שבוצעו בזמנים שונים ועם תאים במעברים שונים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום עזרי ה-HIV לחקור את הגורמים הוויראליים לפתוגנזה.

בזיהום חריף תת-סוג C, תת-הסוג הנפוץ ביותר בעולם. עבודה עם HIV מוכשר שכפול אחד יכול להיות מסוכן ביותר. כל השלבים הכרוכים בנגיף חי צריכים להתבצע במתקן BSL שניים פלוס.

יש לטהר את כל המשטחים באופן קבוע וללבוש כפפות כפולות בכל עת.