אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות ליגנדים מפעילים תפקודית של קולטנים מצומדים לחלבון G יתום או G PCR. זה מושג על ידי טרנסקטציה חולפת, A-G-P-C-R מעניין ומעבר cot של מבנה G אלפא 16 מופקר במערכת ביטוי תאית כדי להשיג ביטוי הטרולוגי זמני של שני החלבונים. כשלב שני, התאים המועברים נטענים בשפעת הצבע הרגיש לסידן או ארבע, המזהה שחרור סידן מהמאגרים התוך-תאיים באמצעות עלייה באות הפלואורסצנטי בעת אינטראקציה עם סידן.

לאחר מכן, בדיקת גיוס הסידן המבוססת פלואורסצנטית מתבצעת על ידי אתגר הקולטן המתבטא ההטרולוגי עם ספריית תרכובות של ליגנדים מועמדים כדי לקבוע תרכובות המפעילות את הקולטן ומעוררות מפל איתות תוך תאי וכתוצאה מכך שחרור סידן מהרטיקולום האנדופלזמי, אותו ניתן למדוד כאות פלואורסצנטי. מתקבלות תוצאות המראות עקומת תגובת ריכוז עם הריכוז האפקטיבי החצי מקסימלי של ליגנד מפעיל, המבוסס על זיהוי אותות פלואורסצנטיים שונים בהתאם לריכוזי הליגנד הניתנים למערכת הביטוי התאית. היתרון העיקרי בביצוע טרנספקט חולף כדי להשיג ביטוי זמני של ה-GPCR שלך על פני השימוש בקווי תאים משובטים יציבים הוא שהוא אינו דורש הקמה גוזלת זמן של קווי תאים כאלה שעברו טרנספטציה יציבה.

טרנספקציה של תת-היחידה המופקרת G alpha 16 יכולה להפנות מחדש את מסלול האיתות התוך-תאי של רוב ה-GPCRs לעבר שחרור סידן ללא קשר למסלול האיתות המקורי בסביבות אנדוגניות. ככזה, מערך זה מאפשר סינון תפוקה בינונית של מאות תרכובות ב-GPCRs מעניינות בטווח זמן קצר, מה שמדגים שההליך יהיה גז צהוב, דוקטורנט וניק סו, טכנאי מהמעבדה שלנו לגדל את תאי HEK 2 93 T בצלוחיות T 75 שלושה ימים לפני ביצוע בדיקת ניוד הסידן בפועל, לעבור את התאים כאשר מגיעים למפגש של 80%. הכן בקבוק T 75 אחד לטרנספקציה עם מבנה הקולטן ואחד לטרנספקציה עם וקטור ביטוי ריק כבקרה שלילית.

דגרו את הצלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO2 למשך 20 עד 24 שעות עד שתרביות התאים מתקרבות למפגש של 50 עד 70% כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, הוסף 3.9 מיקרוגרם של מבנה הקולטן או וקטור ריק ו-3.9 מיקרוגרם של ביטוי G alpha 16 Construct לצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הסילון הראשוני.

מערבבים היטב על ידי מערבולת הצינור ואחריו סיבוב קצר. לאחר מכן הוסיפו 37.5 מיקרוליטר של מערבולת המגיב הסילון והסתובבו למשך דקה אחת במהירות מרבית. דגרו את תערובת הטרנספקציה למשך 10 דקות.

בטמפרטורת החדר, סמן אוכלוסייה אחת של תאים כטרנספטציה עם וקטור הביטוי, המקודד את ה-GPCR המעניין ואת מבנה G alpha 16 ואת הבקבוק השני עם הווקטור הריק ומבנה G alpha 16. לאחר הדגירה, הוסף את תערובת הטרנספקציה טיפתית למדיום תרבית התאים, הקפד להחדיר פיפטה ישירות לתוך המדיום והימנע ממגע עם דפנות בקבוק התרבית. דגרו את הצלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO2 למשך 20 עד 24 שעות לבדיקת ניוד הסידן.

התאים המועברים נאספים ונזרעים ל-96. ובכן צלחות תחתונות שקופות עם קירות שחורים. ראשית מצפים את הצלחות ב -60 מיקרוליטר לבאר טמפרטורת החדר.

פוספט חוצץ מי מלח עם פיברונקטין. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה עם המכסה. מוציאים את התמיסה מהבארות ומדגרים שוב את הצלחות למשך שעה ללא המכסה בטמפרטורת החדר.

בינתיים, הסר את מצע הגידול הישן מהתאים. שטפו תאים מתים עם שלושה מיליליטר PBS והסירו את ה-PBS. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר לנסות EDTA לדגור למשך דקה אחת לפני הסרת התמיסה.

בשלב זה, המורפולוגיה של התאים משתנה מצורת כוכב לצורת כדור. שחרר את התאים מתחתית הבקבוק על ידי הקשה עדינה ואסוף אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם 10 מיליליטר טמפרטורת החדר. DM em מדיום העברה.

העבירו את התאים לצינור בז של 50 מיליליטר. כדי לספור את מספר התאים למיליליטר, הוסף 100 מיקרוליטר מתרבית התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה ומערבבים על ידי הקשה על הצינור.

לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר מייצב וערבבו על ידי הקשה. מלאו קלטת נוקלאו בתרחיף התאים וספרו את התאים עם הדלפק. תוכנת תצוגת הגרעין מכפילה אוטומטית את מספר התאים בשלושה מכיוון שהתאים דוללו בפקטור של שלושה.

בעת הוספת הליזיס והמאגר המייצב, יש לדלל את התאים לריכוז סופי של 600,000 תאים למיליליטר ולזרוע 150 מיקרוליטר של התאים לבאר בצלחות המצופות. כדי להשיג צפיפות תאים של כ-90,000 תאים לבאר הימנע מבועות אוויר והקש על הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה. על מנת לקבל שכבת תאים רציפה, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO2 למשך 16 עד 24 שעות.

השלך את המדיום מהתאים. שוטפים את התאים עם 200 מיקרוליטר PBS לבאר ומסירים את ה- PBS. שימו לב שכל השלבים הבאים הכרוכים בפעולות עם התאים צריכים להתבצע בחושך מכיוון שמנקודה זו ואילך, התאים ייטענו בפלואורו ארבע.

הוסף 55 מיקרוליטר של מאגר טעינה לבאר עטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפת הצלחת לאור ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במאגר כביסה כדי להמיס את הפפטידים המיובשים בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר סיליקון. הכן סדרת דילול לביצוע ניתוח תגובת ריכוז וקביעת ערך EC 50 של ליגנד.

זכור כי 50 מיקרוליטר של ליגנד מצלחת התרכובת יועברו לבאר עם 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפה על צלחת התא במהלך הבדיקה, לכן הכינו את התרכובות פי שלושה מהריכוז הסופי הרצוי שלהן. לאחר מכן, הוסף 70 מיקרוליטר של הליגנד בבאר המתאימה של צלחת התרכובת בשלוש עותקים. כלול בקרות חיוביות ושליליות על כל צלחת.

השלך את מאגר הטעינה מלוח התא והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר כדי למנוע חשיפה לאור. דוגרים את הצלחת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את מאגר הכביסה מצלחת התא והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה חדש לכל אחד.

דגרו היטב את צלחת התא, צלחת התרכובת ומתלה טיפים למשך 15 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, צור וטען את קובץ הפרוטוקול הרצוי עם התוכנה והפעל את יחידת בקרת הטמפרטורה לתא הקריאה כאן. תגובות הסידן נמדדות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, שורה אחת בכל פעם עם מרווח של 1.52 שניות בין קריאות עוקבות ב-525 ננומטר.

הגדר את עירור השפעת או ארבעה עד 488 ננומטר והעביר נפח כולל של 50 מיקרוליטר של תרכובת לצלחת התא. 18 שניות לאחר הקריאה. התחל עם מהירות החלוקה מוגדרת ל-26 מיקרוליטר לשנייה וגובה פיפטה של 135 מיקרוליטר.

מקם את התרכובת ואת לוחית התא ואת מתלה הקצה במגירות המתאימות של מכשיר התחנה. בצע קריאה בודדת של לוחית התא באותו אורך גל עירור ופליטה במצב נקודת הקצה לפני הפעלת המסך בפועל במצב גמיש. התחל את הבדיקה והמשך לנתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתוארת.

להלן גרפים המתאימים לאחד משלושה העתקים של סדרת הריכוז הקצרה של NPF אחד. הבקרה השלילית לא גרמה לאות פלואורסצנטי. בעוד שהבקרה החיובית עוררה הפעלה חזקה של הקולטן המופעל על ידי פרוטאז אנדוגני, אחד שהוביל לאות פלואורסצנטי גבוה.

התוכנה מאפשרת הזנת נוסחאות לקביעת אחוזי ההפעלה או שגיאות התקן של הריכוזים השונים בין היתר. הנתונים המתקבלים משמשים להרכבת עקומות תגובת ריכוז ראשוניות כדי להעריך את ערכי EC 50 כפי שמוצג עבור ארבעת פפטידי ה-NPF הקצרים של הוושט. העקומות כוללות גם את הנתונים עבור הבקרה השלילית, שבה סדרת הריכוזים של פפטידי NPF קצרים של דרוזופילה נבדקו על תאים שהועברו עם וקטור ריק.

התוצאות מצביעות על כך שהוספת הפפטידים לתאים אלה אינה משפיעה על קולטנים אנדוגניים, אך אכן מפעילה את הקולטן המבוקש. בוצעו עקומות תגובת ריכוז ראשוניות של בדיקת ניוד סידן מבוססת פלואורסצנטיות והריכוזים שנבדקו הותאמו לכיסוי הטווח הדינמי של העקומה. ערכי EC 50 של דרוזופילה קצרה npf 1, 2, 3 ו-4 דומים, מה שמצביע על כך שהם חזקים באותה מידה להפעלת הקולטן בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פעילות מבנית, מחקרי קשרים כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו חומצות אמינו של הפפטיד חיוניות להפעלת הקולטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע גיוס סידן המבוסס על חישת שטף כאמצעי לזיהוי ליגנדים המפעילים תפקודית של קולטנים מצומדים לחלבון G. זה כולל תחזוקה של מערכות ביטוי סולאריות ואחריה טרנספקציה טרנסג'נדרית של מערכת התאים על ידי קולטן מעניין.

לאחר בדיקת ניוד סידן נוקשה יכולה להתבצע.