Name: תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למד שיטת תרבות ייחודית לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בשכבה אחידה באמצעות מעכבי Rho-associated kinase ולמינין 521. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול של תאים הומוגניים לצורך מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) במכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי. אנו רוצים להודות לד"ר רונלד ד. מקיי על הדיון והערותיו על הפרויקט הזה.

<ol><li>Cherry, A. B., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammed+cells+for+disease+modeling+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine.</a> Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li>
<li>Mallon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StemCellDB%3A+The+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Database+at+the+National+Institutes+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health.</a> Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+considerations+for+maintenance%2C+expansion%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF+and+FGF+cooperatively+establish+the+regulatory+stem+cell+niche+of+pluripotent+human+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro.</a> Nature. 448, 1015-1021 (2007).</li>
<li>Moogk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC+colony+formation+is+dependent+on+interplay+between+self-renewing+hESCs+and+unique+precursors+responsible+for+niche+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation.</a> Cytometry A. 77, 321-327 (2010).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).</li>
<li>Amit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+culture+of+undifferentiated+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).</li>
<li>Dang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Serra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).</li>
<li>Steiner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((propagation+and+controlled+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension.</a> Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Jozefczuk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Kozhich, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. , (2012).</li>
<li>Kunova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+robust+monolayer+expansion+produces+human+pluripotent+stem+cells+with+improved+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability.</a> Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nat Commun. 2, 167(2011).</li>
<li>Amps, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).</li>
<li>Baker, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+oncogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo.</a> Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).</li>
<li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li>
<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin-511+but+not+-332%2C+-111%2C+or+-411+enables+mouse+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro.</a> Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).</li>
<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li>
<li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ישנן שתי דרכים עיקריות לhPSCs התרבות במבחנה: תרבות קונבנציונלית מושבה מהסוג (של תאים במתקני האכלה או מטריצות תאיים) ותרבות השעיה של hPSCs כמו אגרגטים ללא ניזונים 6. המגבלות של שיטות תרבות הן המושבה מסוג וההשעיה כוללות הטרוגניות שנצברה ושינויים אפיגנטיים בירושה. תרבות לח&quot;י, המבוססת על שני passaging תא בודד וציפוי תא בצפיפות גבוהה, מייצגת שיטת תרבות חדשה ל6,18 צמיחת hPSC. למרות ששיטות passaging תא בודד שונות תועדו בספרות, אבל אף אחד מהם משמשים להפ...

הקיבולת של hPSCs לבדל לכיוון רקמות בוגרות multilineage פתחה אפיקים חדשים לטיפול בחולים הסובלים ממחלות קשות הכרוכים בלב וכלי דם, כבד, לבלב, ומערכות נוירולוגיות 1-4. סוגי תאים שונים הנגזרים מhPSCs היינו גם מספקים פלטפורמות סלולריות חזקות לדוגמנות מחלה, הנדסה גנטית, הקרנת סמים, ו1,4 בדיקה טוקסיקולוגית. הנושא המרכזי המבטיח יישומים הקליניים ותרופתיים עתידם הוא הדור של מספרים גדולים של hPSCs קליני כיתה באמצעות תרבית תאים במבחנה. עם זאת, מערכות התרבות הנוכחיות הם או לא מספיק או מטבעו משתנה, הכוללים תרבויות ומזין ללא מזין שונות של hPSCs כמושבות 5,6. צמיחת מושבה מסוג מניות hPSCs הרבה תכונות מבניות של מסת התאים הפנימית (ICM) של עוברי יונקים מוקדמים. ICM הוא נוטה להתמיין לשלוש ניבט שכבותבסביבה תאית, בשל קיומה של הדרגתיים איתות הטרוגנית. לכן, הרכישה של ההטרוגניות בהתפתחות עוברית מוקדמת נחשבת כתהליך הנדרש לבידול, אבל תכונה לא רצויה של תרבות hPSC. ההטרוגניות בתרבות hPSC מושרה לעתים קרובות על ידי אותות אפופטוטיים מוגזמים והתמיינות ספונטנית בשל תנאי גידול אופטימליים. כך, בתרבות של מושבה מסוג התאים הטרוגנית הם נצפו לעתים קרובות בפריפריה של המושבות 7,8. זה כבר גם הראה כי התאים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מושבות תגובות ההפרש תערוכה למולקולות איתות כגון BMP-4 9. יתר על כן, שיטות תרבות המושבה לייצר תשואות תא נמוכות, כמו גם שיעורי החלמה תא נמוך מאוד מהקפאה בשל שיעורי צמיחה בלתי נשלטים ואיתות אפופטוטיים מסלולי 6,9. בשנים האחרונות, תרבויות השעיה שונות פותחו עבור hPSCs culturing, particulקארלי להרחבה של כמויות גדולות של hPSCs ובמזין תנאים 6,10-13 ללא מטריצה. ברור שיש להם מערכות תרבות שונות יתרונות משלהם וחסרונות. באופן כללי, הטבע הטרוגנית של hPSCs מייצג את אחד החסרונות העיקריים בשיטות מושבה מסוג והתרבות מצטברת, שהם הכי מוצלח להעברת חומרי DNA ו-RNA לhPSCs להנדסה גנטית 6. ברור, יש צורך הכרחי כדי לפתח מערכות חדשות הלעקוף כמה חסרונות של שיטות תרבות הנוכחיות. התגליות של מעכבי מולקולה קטנים (כגון מעכב ROCK Y-27632 וJAK מעכב 1) המשפרות את הישרדות תא בודד לסלול את הדרך לתרבות ניתק-hPSC 14,15. עם השימוש במולקולות קטנות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו שיטת תרבות המבוססת על סוג הלא מושבה צמיחה (מלח&quot;י) של ניתק-hPSCs 9. שיטת התרבות החדשנית זו משלבת גם passaging תא בודד וצפיפות גבוההציפוי שיטות, מאפשר לנו לייצר כמויות גדולות של hPSCs הומוגנית תחת מחזורי צמיחה עקביים ללא פגמים בכרומוזומים עיקריים 9. לחלופין, תרבות לח&quot;י עלולה להיות מיושמת עם מולקולות קטנות שונות ומטריצות מוגדרות (כגון laminins) על מנת לייעל את שיטת התרבות עבור יישומים רחבים. כאן, אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על תרבות לח&quot;י ולהתוות נהלים מפורטים להנדסה גנטית. כדי להדגים את הרבגוניות של פרוטוקולים מלח&quot;י, אנחנו גם נבדקו תרבות לח&quot;י עם מעכבי ROCK מגוונים ועם איזופורם laminin אחת 521 (כלומר, LN-521).

<table><tbody><tr><td>מונה סלולרי אוטומטי של הרוזנת</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>ספירת תאים אוטומטית</td></tr> מערכת <tr><td>רנטגן של ארון פקסיטרון</td><td>תאגיד רנטגן Faxitron, Wheeling, IL&nbsp;</td><td>דגם RX-650</td><td>הקרנת רנטגן של MEFs</td></tr><tr><td>MULTIWELL לוחות 6 בארות</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td>לוחות פוליסטירן</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>עבור MEF בינוני</td></tr><tr><td>מיטומיצין C</td><td>Roche</td><td>107409</td><td>מעכב מיטוטי</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>עבור ניתוק MEF</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330&ndash; 032</td><td>עבור hPSC בינוני</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני&nbsp;</td><td>Invitrogen בע"מ</td><td>31985-062</td><td>עבור טרנספקציה hPSC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td>רכיב של MEF בינוני</td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828&ndash; 028</td><td>KSR, רכיב של מדיום hPSC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate-Buffered</td><td>Saline Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, ללא Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Invitrogen</td><td>11140&ndash; 050</td><td>NEAA, רכיב של מדיום hPSC</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030&ndash; 081</td><td>רכיב של mTeSR1 בינוני hPSC</td></tr><tr><td>& תוספי תזונה</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>ללא חלבון מן החי</td></tr><tr><td>TeSR2 & תוספי תזונה</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>מדיום נטול קסנו</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>M7522</td><td>רכיב של hPSC בינוני</td></tr><tr><td> MEF (CF-1) ATCC</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC)&nbsp;</td><td>SCRC-1040</td><td>לתרבית מזין של hPSCs</td></tr><tr><td>מוסמך hESC Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td>לתרבית ללא מזין של hPSCs</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>חלבון רקומביננטי</td></tr><tr><td>אנושי FGF-2 (FGF רקומביננטי, בסיסי)</td> <td>R& D Systems, MN</td><td>223-FB</td><td>גורם גדילה במדיום hPSC</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td> 1X מעכב <td>JAK תמיסה אנזימטית מעורבת</td></tr><tr><td>I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>מעכב מעכב Janus kinase</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>ROCK</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>מעכב ROCK</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>מעכב ROCK I</td></tr><tr><td>Phenylbenzodioxane</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>מעכב ROCK II</td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>מעכב ROCK חדשני</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer BD</td><td>Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &micro; מסננת תאים m</td></tr><tr><td>Nalgene 5100-0001 Cryo 1 & deg; סי</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>C6516F-1</td> <td>"מר פרוסטי" מיכל הקפאה</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>ריאגנטים לטרנספקציה</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>לא ממוקד miRIDIAN miRNA Transfection Control</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>מסומן ב-Dy547, לניטור אספקת מיקרו-RNAs&nbsp;</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>ייקבע</td><td>וקטור Lentiviral</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td> <td>כלול בכל ערכת טרנספקציה</td><td>פלסמיד ביטוי לבקרת טרנספקציה</td></tr><tr><td>Oct-4</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-5279</td><td>עכבר IgG2b, סמן פלוריפוטנטי</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-21702</td><td>IgM עכבר, סמן התמיינות</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-21704</td><td>עכבר IgG3, סמן פלוריפוטנטי</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-21705&nbsp;</td><td>IgM של עכבר, סמן פלוריפוטנטי</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>Mouse IgM, סמן פלוריפוטנטי</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>Mouse IgG1, נגד ציטוקרטין 8</td></tr><tr><td>&alpha;-fetoprotein</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, עכבר IgG2a</td></tr><tr><td>HNF-3&beta; (ת/19)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, נוגדן פוליקלונלי עיזים</td></tr><tr><td>טרופונין T (Av-1)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>עכבר IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>ארנב IgG</td></tr><tr><td>אנטי-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, יפן</td><td>RCAB0004P-F</td><td>נוגדן פוליקלונלי&nbsp;</td></tr><tr><td>חולדה anti-GFAP</td><td>Zymed</td><td>13-0300</td><td>חלבון חומצי סיבי גליה</td></tr><tr><td>אלבומין (שיבוט HSA1/25.1.3)</td> <td>מעבדות סידרלן בע"מ</td><td>CL2513A</td><td>עכבר IgG1</td></tr><tr><td>אקטין שריר חלק (שיבוט 1A4)</td> <td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611 / IS611</td><td>עכבר IgG2a</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>ארנב פוליקלונלי נוגדן</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, עכבר IgG2a</td></tr><tr><td>HNF4&alpha; (C11F12)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>3113</td><td>נוגדן חד שבטי ארנב</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (תמיסה)</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>PFA, מקבע, מדולל ב-D-PBS</td></tr></tbody></table>

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) טומנים בחובם הבטחה גדולה לרפואה רגנרטיבית ויישומים ביו-פרמצבטיים. נכון לעכשיו, תרבית אופטימלית והרחבה יעילה של כמויות גדולות של hPSCs ברמה קלינית הם נושאים קריטיים בטיפולים מבוססי hPSC. באופן קונבנציונלי, hPSCs מופצים כמושבות הן במערכות גידול מזינות והן במערכות גידול ללא מזין. עם זאת, לשיטות אלו יש מספר מגבלות עיקריות, כולל תפוקת תאים נמוכה ויצירת תאים ממוינים הטרוגניים. כדי לשפר את שיטות התרבית הנוכחיות של hPSC, פיתחנו לאחרונה שיטה חדשה, המבוססת על תרבית חד-שכבתית (NCM) שאינה מסוג מושבה (NCM) של תאים בודדים מנותקים. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי NCM מפורטים המבוססים על מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) Y-27632. אנו מספקים גם מידע חדש לגבי תרבית NCM עם מולקולות קטנות שונות כגון Y-39983 (מעכב ROCK I), פנילבנזודיוקסאן (מעכב ROCK II) ותיאזוביבין (מעכב ROCK חדש). אנו מרחיבים עוד יותר את הפרוטוקול הבסיסי שלנו לטיפוח hPSCs על חלבונים חוץ-תאיים מוגדרים כגון איזופורם למינין 521 (LN-521) ללא שימוש במעכבי ROCK. יתר על כן, בהתבסס על NCM, הוכחנו טרנספקציה או התמרה יעילה של DNA פלסמיד, חלקיקים לנטי-ויראליים ומיקרו-RNA מבוססי אוליגונוקלאוטידים ל-hPSCs על מנת לשנות גנטית תאים אלה לצורך ניתוחים מולקולריים וגילוי תרופות. השיטות המבוססות על NCM מתגברות על החסרונות העיקריים של תרבית מסוג מושבה, ולכן עשויות להתאים לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים לטיפולים קליניים עתידיים, מחקר תאי גזע וגילוי תרופות.

סכימה כללית של תרבות לח&quot;י איור 1 מייצג סכימת תרבות לח&quot;י טיפוסית מראה את השינויים הדינמיים של hPSCs לאחר ציפוי תא בודד בצפיפות גבוהה בנוכחות מעכב ROCK Y-27632. שינויים מורפולוגיים אלה כוללים קשרים אינטר לאחר ציפוי, היווצרות אשכולות סלולריים, וצמיחת תאי מעריכי אחרי עיבוי תא (איור 1 א). ניסוי נציג מציין WA01 hESCs (H1), מצופה בתאים בודדים בצפיפות של 1.9 x ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

alternative-cultures-for-human-pluripotent-stem-cell-production

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב"ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים למעבדות לבצע תרבית תאי גזע ניתנת להרחבה בתפוקה גבוהה עם עלות השקעה מינימלית של עבודה, ניסיון וציוד באמצעות רובוט טיפול בנוזלים הניתן לתכנות וצלחות של 96 בארות.  iPSCs שעברו יותר מ-20 פעמים במערכת זו שמרו על פלוריפוטנטיות, קריוטיפים נורמליים והתמיינו לקרדיומיוציטים.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

להלן פרוטוקול לגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) ותאי גזע עצביים (NSC) במערכת תרבית תאים סגורה המאפשרת סטריליות ושחזור מקסימליים, ומחליפה את ארון הבטיחות הביולוגית והחממה המסורתיים. ציוד זה עומד בהנחיות שיטות ייצור קליניות טובות (cGMP) ושיטות מעבדה קליניות טובות (cGLP).

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

אפיון קבוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כדי לוודא שמירה על מצבם הפלוריפוטנטי, הוא צעד חשוב לפני שתאים אלה משמשים ליישומים אחרים. כאן אנו מתארים שיטה להתפשטות בקנה מידה קטן של iPSCs אנושיים שתוכננה במיוחד כדי לאפשר אפיון קל ושגרתי שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

כדי להימנע מהמגבלות הקשורות למעבר אנזימטי או מכני של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בתרבית על תאי הזנה, ביססנו שיטה מהירה, יעילה, חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לקצירת מושבות hESC או hiPSC המתוחזקות על שכבת תאי הזנה של פיברובלסטים אנושיים של עורלה באמצעות דיס-הדבקה בתיווך EDTA.

העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למד שיטת תרבות ייחודית לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בשכבה אחידה באמצעות מעכבי Rho-associated kinase ולמינין 521. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול של תאים הומוגניים לצורך מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

גלה סרטונים נוספים