וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות את השלבים שבהם ביטוי גנים ויראליים מושפע מטיפול כימי. לשם כך, תאי תרבית רקמה נזרעים ומודגריים עד להגעה לשכבה תאית רציפה (confluent). לאחר מכן, התאים מודבקים באחד משני סוגי הנגיפים: נגיף vaccinia עם שלושה רפורטרים או נגיף בקרה ללא פרומוטר.

בשלב הבא מחילים את תרכובות הטיפול ומדגירים את התאים למשך 18 שעות כדי לאפשר השלמה של כל שלבי הביטוי הגני הויראלי. לאחר מכן, נקבעת הפלואורסצנציה המתקבלת באמצעות קורא פלטות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים יחסיים בביטוי שנגרמו על ידי התרכובות הניסיוניות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני הדבקה בנגיס המבטא חלבון היתוך פלואורסצנטי יחיד הוא שסט נגיסים זה מספק מידע רב יותר לגבי השלב במחזור החיים של הנגיס שבו פועל תרופה טיפולית ספציפית, ובכך מאפשר תובנה לגבי מנגנון הפעולה שלה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לזיהוי מעכבים של הדבקה נגיפית, ניתן להשתמש בה גם כדי לזהות את שלב השכפול הנגיפי שהושלם בקווי תאים שאינם פירמיסיביים או במסכי RNAi, ובכך לזהות גורמים תאיים הנחוצים להדבקה. פרוטוקול זה עושה שימוש בנגיס דיווח רב-שלבי משולש או TrpV, שבו שלושה פלואורופורים בעלי ספקטרום נפרד מוטמעים בתוך הגנום בעל הגדיל הכפול של נגיס vaccinia יחיד.

כל אחד מהפלואורופורים הללו נשלט על ידי פרומוטור ספציפי לשלב מוגדר. הפרומוטור C 11 R לביטוי מוקדם של Venus, הפרומוטור הבינוני G eight R לביטוי של m-cherry והפרומוטור F 17 R לביטוי בשלב מאוחר של tag BFP. לפיכך, Venus, m-Cherry ו-tag BFP מבוטאים באופן עקיב במהלך הזיהום.

קבקרה, נעשה שימוש בנגיף ללא מקדם (promoter-less virus). ה-PLV מכיל מבנה Venus דומה לזה שנמצא ב-TrpV, אך הוא חסר מקדם שעתוק תפקודי.

התחילו את הפרוטוקול על ידי דיסוציאציה של תאי Hela שגדלו בצלחת של 10 סנטימטר. דללו את התאים במצע גידול לריכוז של כ-2.0 × 10⁵ תאים למילליליטר. לאחר מכן, חלקו 100 µL לכל באר בלוח 96 בארות בעל דפנות שחורות, תחתית שקופה ושטוחה. הדגירו את התאים למשך 24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עד להגעתם לקונפלואנס. כדי לדלל את הנגיפים, הפשיתו את TrpV ו-PLV באמבט מים של 37 °C, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך חמש דקות כדי לפרק צברים. לבסוף, דללו את מלאי הנגיף לריכוז של 1.0 × 10⁷ PFU למילליליטר במצע הדבקה שחומם מראש ל-37 °C.

כדי להדביק את התאים, החליפו את מצע הגדילה ב-50 µL של הווירוס המדולל בכל באער. עבור כל טיפול, הדביקו שלושה באערים חוזרים עם TrpV ושלושה נוספים עם PLV, כדי להבטיח תיקון עבור פלואורסצנציית רקע הספציפית לכל טיפול. זמן זה מוגדר כשעה 0 לאחר ההדבקה. לדוגמה, הכינו 350 µL עבור 7 באערים של 96 באערים עם 50 µL בכל אחד. יש לדלל כל תרכובת לפCly פי שניים מהריכוז הסופי, מכיוון שהיא תתווסף לנפח האינוקולום שכבר נמצא בבאער. לאחר מכן, עבור כל תנאי טיפול, הכינו תערובת מאסטר (master mix) בריכוז פי 2 על ידי דילול התרכובות הניסיוניות או ממס הבקרה (vehicle control) כגון PBS או DMSO בתוך כמות מספיקה של מצע הדבקה עבור כל החזרות, פלוס אחת. שימו לב כי ריכוז הממס הן בבקרה הניסיונית והן בבקרה של הווקטור בלבד חייב להיות זהה. לדוגמה, אם אתם משתמשים ב-IBT בריכוז של 1 µL per mL ב-DMSO, עליכם להשתמש ב-DMSO לבדו בריכוז של 1 µL per mL כבקרה לווקטור. מיד לאחר הוספת הווירוס, הוסיפו לכל באער 50 µL של מצע הדבקה המכיל את התרכובות של הטיפול והבקרה הרצויים, כפי שמוצג באיור זה.

שימו לב שכל תרכובת נבדקת עם TrpV ו-PLV בשלוש חזרות, ובקרת רכב (vehicle control) מורצת בשלוש חזרות עבור כל נגיף.

הדגירה תתבצע למשך 18 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובתוספת 5%carbon dioxide. למחרת, קבעו את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 8%paraformaldehyde למצע ההדבקה שנמצא בכל באר. הדגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, תוך הגנה מאור.

הוספת פאראפורמלידהיד בריכוז של 2% או 8% ישירות למצע ההדבקה תמנע התזה של הווירוס לאוויר, דבר שעלול להתרחש אם הווירוס שלא קובע ייהפך ישירות לתוך כלי הפסולת. לאחר חלוף 15 דקות, הסירו את המקבע על ידי הפיכת הפלטה לתוך כלי הפסולת. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של PBS בטמפרטורת החדר ואטמו את הפלטה בעזרת סרט דבק שקוף אופטית.

אם לא תבצעו קריאה של הפלטה באופן מיידי, אחסנו אותה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. הקפידו להחזיר את הפלטות האטומות לטמפרטורת החדר לפני הקריאה, כדי למנוע מעיבוי מים להשפיע על מדידות הספקטרופוטומטר.

כדי לכמת את צמיחת הנגיף, השתמשו בספקטרופוטומטר למדידת פלואורסצנציית נקודת סיום. בצעו ארבע מדידות לכל באר תוך שימוש בהגדרות הגבר (gain) אופטימליות לכל ערוץ. קורא הלוחיות TECAN Infinite M 1000 Pro המשמש בסרטון זה מייצא את מדידות הפלואורסצנציה הגולמיות לקובץ Microsoft Excel. לאחר קבלת הקריאות, פתחו את הנתונים הגולמיים ב-Microsoft Excel.

לאחר מכן, העתיקו והדביקו את הנתונים לגיליון תוצאות ב-GraphPad Prism. ב-Prism, קבעו את הממוצע של בארי TrpV ו-PLV החוזרים. לאחר מכן, החסירו את ערך הממוצע של PLV מערך הממוצע של TrpV עבור כל טיפול. כדי להקל על ההשוואה עם ניסויים חוזרים, נרמלו את הנתונים על ידי חלוקת הנתונים לאחר חיסור הרקע בבארי TrpV שקיבלו את חומר הנשאי (vehicle) בלבד. לאחר שniסוי חזר מספר פעמים, בצעו ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA) ומבחן השוואות מרובות (multiple comparison post-test) כדי לקבוע אם אחד מהטיפולים שונה באופן מובהק מהטיפול ב-DMSO עבור כל ערוץ. לביצוע בדיקות קינטיות, הדביקו את התאים והחילו את תרכובות הבדיקה כפי שנעשה קודם לכן; חשוב במיוחד להשתמש במצע מתוחצב (buffered medium) כדי לשמור על pH תקין ללא הוספת 5% carbon dioxide.

לאחר איטום הפלטה בסרט דביק, הניחו אותה בתא קורא הפלטות שהגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C. יש להקפיד על שמירה עקבית של הפלטות בטמפרטורה של 37 °C. דבר זה ימנע עקה מיותרת לתאים והיווצרות עיבוי.

כוון ידנית את הגבר (gain) של קורא הלוחיות כדי למנוע רוויה בנקודות זמן מאוחרות יותר. בצע קריאות מדי שעה למשך שמונה עד 24 שעות לאחר ההדבקה, ובצע נורמליזציה כפי שנעשה בבדיקת נקודת הסיום (endpoint assay). ניתן לנתח נקודות זמן בודדות למשמעות סטטיסטית באמצעות שיטות דומות לאלו שתיארו קודם לכן עבור בדיקת נקודת הסיום.

על מנת להשוות נקודות עיכוב, תאי HeLa שהודבקו ב-TrpV או ב-PLV vaccinia גודלו בנוכחות מעכבי נגפי האבעות AraC, IBT, Rifampicin ו-ST 246. סרטון timelapse זה מציג את הביטוי הרצפי של פלואורופורים ירוקים, אדומים וכחולים במהלך גדילת הנגיף בתאי ביקורת. כאשר התאים הודבקו בנוכחות AraC, תרופה החוסמת את השכפול של ה-DNA, הפלואורופור הירוק המוקדם נוצר כרגיל, אך ייצור ביניים ומאוחר של פלואורסנציה אדומה וכחולה אינו מתרחש.

ניתוח כמותי באמצעות ספקטרומטריה הראה עלייה של 210% בביטוי גנים מוקדמים, אך היעדר ביטוי ביניים וביטוי מאוחר בתאים שטופלו ב-araC. תאים שהודבקו בנוכחות IBT, אשר נחשב כמעודד תעתוק מסוג read-through, הראו רמות ביטוי ביניים ומאוחר שהיו 24.7% ו-2.9% מרמות הביקורת. תאים שהודבקו בנוכחות ST246 וריפמפיצין, המעכבים את ביטוי הגנים המאוחרים במהלך הרכבת והבשלת הויריונים, לא הראו הבדל משמעותי לעומת הביקורות. תוצאות אלו עקביות עם מנגנון הפעולה המוכר של תרכובות אלו, ומצביעות על כך שניתן להשתמש בוירוס הדגמאי TrpV כדי לזהות את השלב הספציפי של העכבה הוויראלית עבור תרכובות לא ידועות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לכלול בקרות מתאימות. הדבר מאפשר לא רק נורמליזציה נכונה של התוצאות, אלא גם קביעת מנגנון פוטנציאלי עבור התרכובת הניסויית שלכם. זכרו כי עבודה עם נגיף הווקסיניה עלולה להיות מסוכנת ביותר; עבדו תמיד עם ציוד מגן אישי מתאים ופעלו לפי טכניקות ההכלה המומלצות לרמת בטיחות ביולוגית BSL-2.