וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את השלבים שבהם ביטוי הגנים הנגיפי מושפע מטיפול כימי. לשם כך, תאי תרבית רקמות מצופים ומודגרים. עד להתלכדות, התאים נדבקים בנגיף חיסון מדווח משולש או בנגיף רשימת מקדמי בקרה.

לאחר מכן מיושמים תרכובות טיפול והתאים מודגרים למשך 18 שעות כדי לאפשר השלמת כל שלבי ביטוי הגנים הוויראליים. הקרינה המתקבלת נקבעת לאחר מכן באמצעות קורא צלחות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את השינויים היחסיים בביטוי הנגרמים על ידי תרכובות הניסוי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני זיהום בנגיף המבטא חלבון היתוך פלואורסצנטי יחיד הוא שקבוצת נגיפים זו מספקת מידע נוסף על היכן במחזור החיים הנגיפי פועלת תרופה טיפולית ספציפית, ומספקת תובנה לגבי מנגנון הפעולה שלה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לזיהוי מעכבי זיהום נגיפי, ניתן להשתמש בה גם כדי לזהות את שלב השכפול הנגיפי שהושלם בשורות תאים לא מתירניות או במסכי RNAi, ולזהות גורמים תאיים הנחוצים לזיהום. פרוטוקול זה משתמש בנגיף המשולש או בווירוס המדווח הרב-שלבי Trip V, שבו שלושה פלואורו רביעיות נפרדות מבחינה ספקטרלית משולבות בגנום התקוע הכפול של נגיף וריד יחיד.

כל אחד מרביעיות הפלואורו הללו נשלט על ידי מקדם ספציפי לשלב מוגדר היטב. מקדם C 11 R לביטוי מוקדם של נוגה, מקדם הביניים G eight R לביטוי דובדבן m ומקדם F 17 R לביטוי שלב מאוחר של תג BFP. לפיכך, ונוס מ דובדבן ותג BFP באים לידי ביטוי ברצף במהלך ההדבקה.

כבקרה, נעשה שימוש בווירוס רשימת מקדם. PLV מכיל מבנה ורידי דומה לזה שב-Trip V.עם זאת, אין לו מקדם שעתוק פונקציונלי. התחל את הפרוטוקול הזה על ידי דיסוציאציה.

תאי הלה הגדלים על צלחת של 10 סנטימטרים, מדללים את התאים במדיום הגידול לכ-2.0 פעמים 10 עד לתאים החמישיים למיליליטר. לאחר מכן הוציא 100 מיקרוליטר בכל באר של צלחת תחתית שטוחה שקופה עם דופן שחורה 96 באר דגירה על התאים למשך 24 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד שהם מתכנסים כדי לדלל את הנגיפים להפשיר את Tripp V ו-PLV באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ואז סוניקציה למשך חמש דקות לפירוק. לאחר מכן, יש לדלל את מלאי הנגיף ל-1.0 פעמים 10 ל-PFU השביעי למיליליטר במדיום זיהום שחם מראש ל-37 מעלות צלזיוס כדי להדביק את התאים.

החלף את אמצעי הגידול ב-50 מיקרוליטר של הנגיף המדולל לכל באר לכל באר לכל טיפול. הדביקו שלוש בארות משוכפלות ב-Tripp V ושלוש נוספות ב-PLV כדי לקחת בחשבון את הקרינה הספציפית לכל טיפול. זה מוגדר כזמן שווה לאפס שעות.

לאחר הדבקה, למשל, מייצרים 350 מיקרוליטר עבור 6 96 בארות עם 50 מיקרוליטר כל אחת. יש לדלל כל תרכובת לריכוז כפול מהריכוז הסופי, מכיוון שהיא תתווסף לנפח החיסון שכבר נמצא בבאר. לאחר מכן, עבור כל תנאי טיפול, הכינו תערובת של שני x מאסטר על ידי דילול התרכובות הניסיוניות או ממיסי בקרת הרכב כגון PBS או DMSO למספיק ממדיום הזיהום עבור כל השכפולים.

בנוסף אחד, שים לב שריכוז הממס הן בבקרות הניסיוניות והן בבקרות הווקטור בלבד צריך להיות זהה. לדוגמה, אם אתה משתמש ב-IBT במיקרוליטר אחד למיל ב-DMSO, עליך להשתמש גם ב-DMSL בלבד במיקרוליטר אחד למיל כבקרת הווקטור שלך. מיד לאחר הוספת הנגיף, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום זיהום המכיל את תרכובות הטיפול והבקרה הרצויות לכל באר כפי שמוצג באיור זה.

שימו לב שכל תרכובת נבדקת עם Tripp V ו-PLV בשלוש עותקים, ובקרת רכב מופעלת בשלוש עותקים עבור כל נגיף. דגירה למשך 18 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני. למחרת, תקן את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 8% אלדהיד פרפורמי למדיום הזיהום שכבר נמצא בכל באר דגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגנת מפני אור.

הוספת שני x או 8% אלדהיד פרפורמים ישירות למדיום ההדבקה תמנע תרסיס של הנגיף, שאחרת עלול להתרחש אם הנגיף הלא מקובע הופך ישירות לתוך צלחת הפסולת. לאחר שחלפו 15 דקות, הסר את הקיבוע על ידי היפוך הצלחת לכלי הפסולת. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר ואטמו את הצלחת בסרט דבק שקוף אופטית.

אם הצלחת לא תיקרא מיד, אחסן אותה בארבע מעלות צלזיוס. הקפד להחזיר את הלוחות האטומים לטמפרטורת החדר לפני קריאתם כדי למנוע עיבוי לעוות את מדידות הספקטרופוטומטר. כדי לכמת את צמיחת הנגיף, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד פלואורסצנטיות של נקודות קצה.

בצע ארבע מדידות לכל באר באמצעות הגדרות רווח ממוטבות עבור כל ערוץ. קורא הלוחות TAN Infinite M 1000 Pro המשמש בסרטון זה מייצא מדידות פלואורסצנטיות גולמיות לקובץ Microsoft Excel. לאחר קבלת הקריאות, פתח את הנתונים הגולמיים ב- Microsoft Excel.

לאחר מכן העתק והדבק אותו בפריזמה של GraphPad. גיליון התוצאות בפריזמה קובע את הממוצע של בארות Tripp v ו-PLV משוכפלות. לאחר מכן הפחיתו את ערך ה-PLV הממוצע מערך ה-Tripp V הממוצע עבור כל טיפול.

כדי להקל על ההשוואה עם ניסויים משוכפלים, נרמל את הנתונים על ידי חלוקת נתוני הרקע שהוחסרו ברכב רק Tripp v Wells. לאחר שניסוי חזר על עצמו מספר פעמים, בצע ניתוח חד כיווני של שונות או מבחן NOVA חד כיווני והשוואה מרובה לאחר מבחן כדי לקבוע אם אחד מהטיפולים שונה באופן משמעותי מהטיפול ב-DMSO. כדי שכל תעלה תבצע בדיקות קינטיות להדביק את התאים ולהחיל תרכובות בדיקה כמו קודם, חשוב במיוחד להשתמש במדיום חוצץ כדי לשמור על pH תקין ללא תוספת של 5% פחמן דו חמצני.

לאחר איטום הצלחת בסרט דבק, הנח אותה בתא קורא הצלחות באיזון ל -37 מעלות צלזיוס. יש להקפיד במיוחד לשמור על צלחות באופן עקבי ב -37 מעלות צלזיוס. זה ימנע מתח ועיבוי תאים מיותרים.

הגדר ידנית את הרווח של קורא הלוחות כדי למנוע רוויה של נקודות זמן מאוחרות יותר. רכשו קריאות שעתיות במשך שמונה עד 24 שעות לאחר ההדבקה ונרמלו. באשר לבדיקת נקודת הקצה, ניתן לנתח נקודות זמן בודדות למובהקות סטטיסטית באמצעות שיטות דומות לבדיקת נקודת הקצה שתוארה קודם לכן.

כדי להשוות נקודות עיכוב, תאי הילה הנגועים בחיסון TPV או PLV גודלו בנוכחות מעכבי נגיף האבעבועות, Aris, CIBT, Rifampicin ו-ST 2 46. הפעם, סרטון ה-lapse מראה את הביטוי הרציף של ארבע פלואורו ירוקות, אדומות וכחולות במהלך צמיחת הנגיף בתאי ביקורת כאשר הם נגועים בנוכחות שכפול ה-DNA החוסם את התרופה aee. הפלואורו הירוק המוקדם מיוצר כמו קודם, אך ייצור ביניים ומאוחר של פלואורסצנציה אדומה וכחולה אינו מתרחש.

ניתוח כמותי על ידי ספקטרומטריה הראה עלייה של 210% בביטוי גנים מוקדם, אך חוסר ביטוי ביניים ומאוחר בתאים שטופלו בתאי C הנגועים בנוכחות IBT, שנחשב כמקדם. לשעתוק שנקרא היו רמות ביטוי בינוניות ומאוחרות שהיו 24.7% ו-2.9% מרמות הביקורת של תאים שנדבקו בנוכחות ST 2 46 וריפמפיצין, המעכבים לאחר ביטוי גנים מאוחר במהלך הרכבת הוויריון והבשלתו, לא היו שונים באופן משמעותי מקבוצת הביקורת. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מנגנון הפעולה המובן של תרכובות אלו ומצביעות על כך שניתן להשתמש בנגיף Trip V Reporter כדי לזהות את השלב הספציפי של עיכוב ויראלי עבור תרכובות לא ידועות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול בקרות מתאימות. לא רק שזה מאפשר נורמליזציה נכונה של התוצאות, אלא גם לקבוע מנגנון פוטנציאלי לתרכובת הניסוי שלך. אל תשכח שעבודה עם נגיף החיסון יכולה להיות מסוכנת ביותר, ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים ולעקוב אחר BSL המומלץ.

שתי טכניקות בלימה.