הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל דרוזופילה רקמות באתר
14 באוגוסט 2014
צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין או להשביע רקמות ב-C two באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר סוניקציה. זה מושג תחילה על ידי איסוף דגימות עובריות וזחלים ולאחר מכן קיבועם באמצעות פורמלדהיד, הפטן ומתנול. השלב השני הוא סוניקציה של הדגימה הקבועה על מנת להסיר את הציפורן כדי לאפשר חדירת נוגדנים.
לאחר מכן, הדגימה היא כתם חיסוני עם נוגדנים משניים ראשוניים ופלואורסצנטיים. השלב האחרון הוא הרכבת הדגימה בתמיסת אנטיפה מבוססת גליצרול. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית או אפי פלואורסצנטית משמשת להמחשת הרקמה המתפתחת כמו גם ביטוי חלבון ולוקליזציה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כמו דיסקציה של רקמות, הוא שהיא מאפשרת הדמיה של מגוון רקמות מתפתחות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ששלב הסוניקציה תלוי במספר גורמים כדי להשיג יעילות מקסימלית, כולל המיקום הנכון של בדיקת הסוניקה. המדגימות את ההליך יהיו אשלי פידלר ולורן בול, שתי חוקרות מוכשרות לתואר ראשון מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בניסוי, הסר בזהירות עוברים שנאספו על צלחת אגר באמצעות מברשת צבע קטנה המשולבת במאגר פוספט Triton X 100 או תמיסת PBTX. לאחר מכן, נגב את מברשת הצבע העמוסה בדוגמה על הרכס הפונה הפנימי של מסננת תאים. מניחים מכסה צלחת פטרי מתחת למסננת התאים.
לאחר מכן שטפו את המכחול ואת דפנות מסננת התאים עם בקבוק שפריץ המכיל PBTX. לאחר העברת הדגימה למסננת, שפכו מספיק PBTX לתוך המסננת כדי להרים את הדגימה מהרשת. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי להסיר שמרים ופסולת זבוב, להסיר PBTX.
לאחר מכן שפכו תמיסת אקונומיקה של 50% למסננת והניחו לזחלים לשבת בתמיסה למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הפתרון. לאחר מכן שטפו את הדגימה עם PBTX והניחו לדגימה לשבת בתמיסה למשך שלוש דקות.
חזור על השלב חמש פעמים, יבש את החלק התחתון של מסננת התאים. לאחר מכן השתמש במברשת צבע המשולבת ב-PBTX כדי להעביר את הדגימה לבקבוקון נצנוץ המכיל 1.75 מיליליטר פם. במכסה אדים, הוסף 250 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד ושמונה מיליליטר בדרגת ריאגנט.
הפטן לבקבוקון הנצנוץ, ונער את הבקבוקון ב-200 סל"ד למשך 20 דקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר מתנול לבקבוקון הנצנוץ מבלי להסיר את השלב המימי ונערו במרץ ב-500 סל"ד. לאחר הטלטול, שפכו מיד את התכולה למסננת תאים מעל מיכל פסולת נוזלית.
הוסף מתנול נוסף לבקבוקון והעביר את התוכן דרך מסננת התאים. כדי להבטיח שהדגימה כולה הוסרה. נסה את החלק התחתון של מסננת התאים עם רקמת מעבדה.
לאחר מכן יש למרוח מברשת כדי להעביר את הדגימה מהמסננת לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטר מתנול. המתן עד שהדגימה תתייצב. לאחר מכן הסר את המתנול בעזרת פיפטה והחלף אותו במנה טרייה של 0.5 מיליליטר מתנול.
חזור על שלב זה שלוש פעמים והוסף 0.5 מיליליטר אחרון של מתנול לצינור לפני אחסונו ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. למועד מאוחר יותר, השתמש באחזור הדגימה המאוחסנת מהמקפיא והסר את המתנול בעזרת פיפטה. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מאגר מתנול פוספט 50% או PBTW לשפופרת, ונדנד את הצינור למשך שלוש דקות.
לאחר מכן, שטפו את הדגימה עם מיליליטר אחד של PBTW פעמיים ואפשרו לדגימה להתייצב לפני ששולפים את ה-PBTW עם פיפטה, הוסיפו 1.0 מיליליטר של אלבומין פוספט בסרום בקר, או BBTW לבקבוקון, ונדנדו אותו במשך שלוש דקות. אפשר לדגימה להתיישב והסר את ה-BBTW בעזרת פיפטה. חזור על שלב זה פעמיים.
הקפדה להסיר כמה שיותר BBTW מבלי לאבד אף אחת מהדגימה. לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר BBTW לצינור והניחו אותו על קרח. לאחר מכן, הגדר את הסוניקט ל-10% משרעת מקסימלית וזמן ריצה של שתי שניות עם קבוע, נקה את בדיקת הטור על ידי הנחת קצה הבדיקה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא במים נטולי יונים והפעל את הסוניקט.
לאחר מכן יבש את בדיקת הסוניקט עם רקמת מעבדה. טבלו את הגשושית לתוך הצינור, שלושה עד ארבעה מילימטרים מעל הדגימה והתחילו את הסוניקציה. לאחר מכן הסר את הצינור והנח אותו על קרח למשך 30 שניות כדי למנוע התחממות יתר מהסוניקציה, וכדי לאפשר לדגימה להתיישב בתחתית הצינור.
חזור על שלב זה כנדרש לפי גיל המדגם לאחר השלמת הסוניקציה. שטפו את הדגימה פעמיים עם מיליליטר אחד של BBTW. לאחר כל שטיפה, הניחו לדגימה להתייצב לפני ייבוש BBTW בעזרת פיפטה, הוסיפו מיליליטר אחד של BBTW לבקבוקון והניחו אותו על נדנדה.
לאחר שלוש דקות, הניחו לדגימה להתיישב והוציאו את ה-BBTW בעזרת פיפטה. ואז חזור על זה. שלב פעמיים, חסום את הדגימה עם 0.5 מיליליטר של 5% סרום רגיל מדולל ב-BBTW לצינור, והנח את הדגימה על נדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית וטלטלו את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, אפשרו לדגימה להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן יש להסיר את הנוגדנים הראשוניים בעזרת פיפטה ולשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של BBTW. הוסף מיליליטר אחד של BBTW לבקבוקון ולאחר מכן הניח אותו על נדנדה למשך שלוש דקות.
לאחר מכן הסר את ה- BBTW בעזרת פיפטה וחזור על כך. שלב חמש פעמים, חסום את הדגימה עם תמיסת BBTW בסרום רגיל של 5% ונדנד אותה למשך 30 דקות. ואז הסר את הפתרון.
הוסף נוגדן משני מדולל בתמיסת BBTW סרום רגילה של 5% ועטוף את הצינור בנייר אלומיניום. לאחר מכן נדנד את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. משוך נוגדנים משניים בעזרת פיפטה ושטוף את הדגימה במיליליטר אחד של PBTW פעמיים.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PBTW לבקבוקון והניח אותו על נדנדה למשך חמש דקות. לאחר מכן אפשר לדגימה להתיישב והסר את ה- PBTW בעזרת פיפטה. חזור על זה.
שלב שלוש פעמים. הוסף 80 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת DAB co לצינור ואחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לבסוף, כדי להרכיב את הדגימה, השתמש בחמישה עד 10 מיקרוליטרים של dab BCO p lene diamine, או PPD anti fade.
לאחר מכן צפו בו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תחזיות Z אלה של ארבע פרוסות קונפוקליות מדגימות את יעילות הפרוטוקול להדמיית מאפיינים מורפולוגיים כמו גם תאים בודדים ב-C 2 במהלך העובר המאוחר עד תחילת ואמצע L שלושה שלבים של התפתחות דרוזופילה. התפתחות האשכים היא מערכת טובה במיוחד להמחשת יעילות הפרוטוקול מכיוון שהבשלת האשכים היא דינמית לאורך כל התפתחות הזחל.
תמונות אלה מדגישות תאי נבט בתאים אדומים ומרכזיים ואזורי FU בחלקים קונפוקליים בודדים ירוקים של מוחות אמצעיים L. כתם חיסוני לתאי אם גנגליון, נוירונים לא ממוינים בנוירונים ירוקים ולא בשלים וראשוניים. באדום מראים צביעה חזקה עם דפוסי ביטוי מובהקים באונות המוח ובחוט העצב הגחוני, בהתאם לכיוון הגברה, הדמיה מאפשרת הדמיה של רקמת המוח מפני השטח הגבי, משטח הגחון או בחתך סגיטלי.
טכניקה זו מאפשרת לביולוגים לחקור את התפתחות האיברים במורפוגנזה של רקמות באורגניזמים שבהם קוטיקולה מגנה מונעת חדירת נוגדנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע סוניקציה ואימונוסטית של דגימות וושט עובריות וזחלים בשלב מאוחר על מנת לדמיין רקמות מתפתחות ב-C שתיים. אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד, הפטן ומתנול יכולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כמו עבודה במכסה אדים.
יש להקפיד תמיד על לבישת כפפות מתאימות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לצביעה אימונוהיסטוכימית של רקמות Drosophila melanogaster באמצעות סוניקציה. השיטה מאפשרת הדמיה של סוגי תאים וחלבונים ספציפיים ללא צורך בניתוח, ובכך משפרת את היעילות של חקר רקמות בשלבי התפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- צביעה אימונית היא קריטית להדמיה של חלבונים ברקמות.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות נתיחה, פעולה שעלולה להיות גוזלת זמן.
- סוניקציה יכולה להקל על חדירת הנוגדנים על ידי הסרת הקוטיקולה.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת לצפייה במיקום החלבון.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית יעיל עבור זחלים שלמים.
- להדמיות של ביטוי חלבונים ברקמות של Drosophila.
- לשיפור נגישות חדירת הנוגדנים בדגימות מקובעות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות של עוברי זחלים ולרוות.
- קיבוע באמצעות פורמלדהיד, הפטן ומתנול.
- סוניקציה להסרת הקוטיקולה.
- צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים פלואורסצנטיים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של רקמות בהתפתחות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- חדירה יעילה של נוגדנים שהושגה באמצעות סוניקציה.
- מיקום ברור של חלבונים בתוך הדגימות.
- הפרוטוקול משפר את היעילות של הליכי צביעה אימונוהיסטוכימית.
מסקנות
- השיטה המתוארת מפשטת את תהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית.
- סוניקציה היא טכניקה בעלת ערך להכנת רקמות של Drosophila.
- ניתן לאמץ פרוטוקול זה באופן נרחב למחקרים דומים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו לאימונופלואורסצנציה בסיוע סוניקציה נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי במחקר בביולוגיה התפתחותית: הקוטיקולה הבלתי חדירה בעוברים וזחלים של Drosophila בשלבים מאוחרים, המעכבת חדירה של נוגדנים. על ידי מתן אפשרות לצביעה אימונוהיסטוכימית של הדגם כולו (whole-mount) ללא צורך בניתוח, הפרוטוקול משפר את התפוקה ומשמר את מורפולוגיית הרקמה, ובכך תומך בתיקוף אמין של מטרות במסכים גנטיים ופנוטיפיים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת נתונים כמותיים של ביטוי חלבונים ברזולוציה מרחבית, שהם קריטיים להורדת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של מיקום חלבונים ברקמות שלמות, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: תומך בעיבוד בתפוקה גבוהה של מספר רב של דגימות, מה שמשפר את היעילות בתהליכי תיקוף מטרות.
- ערך אסטרטגי: מקל על סריקה פנוטיפית על ידי מתן אפשרות לניתוח סימולטני של סוגי רקמות מרובים (למשל, אשכים, שחלות, רקמות עצביות) לאורך שלבי התפתחות שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות הערכה סטנדרטית של רמות ביטוי של אנטיגנים.
- ערך תפעולי: שומר על ארכיטקטורת הרקמה in situ, ובכך מבטיח שחזוריות של הבדיקה ומפחית שונות הנובעת מארטפקטים של ניתוח.
- ערך אסטרטגי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בשלבים מאוחרים יותר על ידי אישור מעורבות המטרה ודפוסי ביטוי.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מספק רזולוציה תאית רלוונטית למחלה במודלים של Drosophila, ובכך תומך בגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים עבור מסלולים נוירו-התפתחותיים ורבייתיים.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על פרוטוקולים עקביים של הכנת רקמות וצביעה.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים אמינים ובעלי רזולוציה מרחבית של לוקליזציה חלבונית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל משלב תיקוף המטרה המוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), במיוחד כאשר סריקה פנוטיפית דורשת ניתוח של רקמה שלמה ואיתור כמותי של מיקום חלבונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של סוגי תאים ספציפיים וביטוי חלבונים ברקמות בהתפתחות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית וניתנת לשחזור, עם פלטי פלואורסצנציה כמותיים המתאימים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מדידות (עוצמת פלואורסצנציה, דפוסי לוקליזציה) המאפשרות לצוותים להשוות תנאי ניסוי ולהעריך מודולציה של המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי אספקת נתונים ברמת הרקמה התואמים לפנוטיפים התפתחותיים הרלוונטיים למודלים של מחלות אנוש.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הכנה של דגימות הניתנת לשימוש חוזר וישקומה במגוון פרויקטים בביולוגיה התפתחותית ובסריקה גנטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת תוצאות שגויים-שליליים הנובעים מחדירה לקויה של נוגדנים ושיפור הדיוק של תיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקול יעיל, ללא צורך בניתוח, התואם לעיבוד של נפחים גבוהים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי אספקת תובנות מכניסטיות מהימנות, ובכך מפחית את הסיכון הביולוגי בשלבים מאוחרים של קידום המטרה.
- השפעה על תיק הפעילות (Portfolio): מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על דפוסי ביטוי מתוקפים ורלוונטיות תפקודית במערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטימיזציה של פרמטרי הסוניקציה (מיקום הפרובה, אמפליטודה, משך זמן) כדי למנוע נזק לדגימה תוך הבטחת הסרת הקוטיקולה.
- תלוי בגישה לציוד סוניקציה עם בקרות מדויקות של אמפליטודה ותזמון, יחד עם ריאגנטים סטנדרטיים לאימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הסוניקציה והצביעה כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין משתמשים ומעבדות שונות.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי רקמות ושלבים התפתחותיים שונים של Drosophila, שכן יעילות הסוניקציה עשויה להשתנות בהתאם לגיל הדגימה ולעובי הקוטיקולה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך באופטימיזציה של זמני אינקובציית הנוגדנים עבור מטרות בעלות שפע נמוך, וטיפול זהיר בריאגנטים מסוכנים (formaldehyde, heptane, methanol).
