Name: הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למד שיטת הדמיה חצי אוטומטית לזיהוי תאים רגישים לאסטרוגן בעוברי דג הזברה חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה ממונעת. הפרוטוקול מאפשר הדמיה ספציפית לרקמה של פעילות קולטני האסטרוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסוזן פארמר ואת צוות של מתקן מחקר דג הזברה UAB לטיפול בדג זברה. מימון הניתן על ידי קופות הזנק מהמחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה.

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית ברמינגהאם. 1. רבייה דג הזברה ואוספי ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לפני תחילת חשיפה לחומרים כימיים, להרכיב טנקי רבייה עם חוצצים לזכרים ונקבות נפרדים. ממלא כל מחצית הדרך מיכל עם מים מערכת חקלאות ימית. שימוש ברשת, להעביר Tg (5xERE: GFP) דגי c262/c262 לטנקים רבייה, הצבת 2 זכרים ונקבות 3 בכל אחד טנק מופרד על ידי מחיצה. מניחים את המכסה על כל טנק ותווית עם תאריך וזנים שחצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את כל המחסומים והטיה מתסכלת ליצור אזור רדוד בקצה אחד של מיכל הרבייה. לאפשר דג הזברה להזדווג, איסוף עוברים ב10 מרווחי דקות כדי להבטיח היערכות התפתחותית מדויקת. ביצים נקיות על ידי שטיפה דרך מסננת תה באמצעות מדיום E3B ועוברים בעדינות סומק לצלחות פטרי. חזור דגים בוגרים לקבועיםטנקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, למיין, לספור, והסר את כל עוברים מופרים, נורמליים או פגומים. עוברי מקום בצלחות פטרי במדיום E3B ובית ב28.5 ° C עם אור 14:10: מחזור כהה. צפיפות עובר יכולה להשפיע על התפתחות. מניחים לא יותר מ 100 עוברים בצלחת מ&quot;מ 100 x 35 ולא יותר מ 50 עוברים בצלחת מ&quot;מ 60 x 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי 24 hpf, להחליף מדיה עם E3B מכיל 200 1 מיקרומטר-פניל 2-thiourea (PTU). PTU מונע היווצרות פיגמנט ושומר על עוברי דג הזברה וזחלים שקופים לבהירות תמונה משופרת. זהירות: מניית PTU מרוכזת היא מסוכנת; ללבוש כפפות בעת ביצוע פתרון E3B + PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 לאחר ההפריה (DPF), להסיר באופן ידני את סיסי מכל עובר באמצעות מלקחיים בסדר. סיסי אינו מופיע כדי להשפיע על חדירה של אסטרוגנים, עם זאת ההסרה משפרת את בהירות תמונה. אין צורך להסיר את chorions מהתקשורת. הערה: כחלופה לdechorionation הידני, ניתן צ&#39;ה קבוצות של עובריםmically dechorionated באמצעות 1 מ&quot;ג / מיליליטר pronase טיפול, כפי שתואר 11 בעבר. </li></ol> 2. טיפול הכימי של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הטיפול, להכין פתרונות מניות של כל כימי בריכוז של פי 1,000 בDMSO (או ממס מתאים). לדוגמה, כדי לחשוף את העוברים ל10 יספנול מיקרומטר (BPA), להכין פתרון מניות 10 מ&quot;מ BPA ב100% DMSO. זה מבטיח ריכוז DMSO אחיד בכל טיפול ומאפשר 1:1,000 דילול רעיל של DMSO לשמש כשליטה ברכב. פתרונות מניות חנות ב -20 ° C. עבור פרוטוקול זה, עוברים יהיו חשופים ל1 מיקרומטר ומיקרומטר 10 BPA, 18.5 ננומטר ו1.85 מיקרומטר גניסטאין, 367 אסטרדיול ננומטר (בקרה חיובית) ורכב (DMSO 0.1%, בקרה שלילית). זהירות: כימיקלים כגון BPA ואסטרדיול הם מסוכנים ויכולים להיות השפעה מזיקה על העובר האנושי. ידית משבשים האנדוקרינית בזהירות ותמיד להשתמש בציוד מגן אישי מתאים.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של טיפול, הפשרה הכינה פתרונות כימיים מניות. לדלל 1:1,000 ידי pipetting 1 מיליליטר E3B + PTU לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge והוספת 1 μl של תמיסה כימית מניות. וורטקס במרץ. לדלל DMSO 1:1,000 לE3B + PTU כמו שליטה ברכב. השתמש 1 מ&quot;ל E3B + PTU בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר כביקורת שלא טופלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה פלסטיק גדולה נשא, עוברי העברה מצלחות פטרי לבאר כל צלחת 96 היטב, 3 עוברים לכל טוב, 3 בארות לכל מצב. על מנת למנוע אידוי במהלך טיפול ממושך, להשמיט עוברים משורות ועמודות חיצוניות של הצלחת (שורות ו-E, עמודות 1 ו 12). יכולות להיות מלאות בארות חיצוניות עם 300 μl של E3B + PTU. לתייג את המכסה הצלחת כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מכל טוב עם פיפטה העברה פלסטיק קנס הטתה. לעבוד במהירות כדי למנוע התייבשות העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון טיפול למתאים היטב. מניחים את המכסה underneath הצלחת כמדריך כדי להבטיח תוספת של טיפולים לתוך הבארות המתאימות. מערבולת צינור אחד לפני pipetting להפיץ הכימי בתמיסה. חזותי לאשר כל עובר הוא בפתרון הטיפול. אם הם עוברים בצד של הבאר, השתמש pipet העברה נקי כדי לשטוף אותם לתוך הבאר עם פתרון הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת באינקובטור ב 28.5 ° C. עוברים ינותחו לקרינה ב72 hpf. </li></ol> 3. אוטומטית הדמיה של עוברים בצלחות 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עוברים על ידי הוספת 10 μl של 4 מ&quot;ג / מיליליטר tricaine היטב כל אחד. הערה: הרדימי עוברים לפני ההדמיה. ב24-96 hpf, דג הזברה תערוכת תנועה ספונטנית ותגובה בהלה למקור האור משתנה במהלך לכידת תמונה. הרדמה עובר מפחיתה את התנועה במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 96, גם בשלב הממונע ולכייל את הבמה. באמצעות Zeiss זן הכחול 2011 תוכנה לאוטומצית מיקרוסקופיהובבקרה, בחר באפשרות ספק מדגם ובחר 96 multiwell. בחר לכייל. בצע את ההוראות בשלבים לכייל את הבמה. הערה: אל תסיר את סימון כפתור האריחים לאחר שלב זה. אם לחצן האריחים אינו מסומן, הגדרות כיול עלולות ללכת לאיבוד וצלחת 96 היטב תהיה צורך recalibrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 10x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה הולמת לBF וערוצי ה-GFP, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה. התמקד בעובר יחיד ולתכנת את מיקרוסקופ כדי לרכוש 3 Z-סעיפי סך הכל, תמונה אחת 50 מיקרומטר לעיל ואחד 50 מיקרומטר מתחת למישור המוקד הנוכחי. הערה: מאחר שרקמות שונות לכבוש מטוסי מוקד שונים, זה יבטיח שלכל תמונות דג הזברה שנתפסו עם הלב וכבד בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הפרמטרים בתוכנה כדי לרכוש תמונת רעפים באמצעות GFP וchanne BFls. תחת לשונית הרכישה, בחר התקנה מתקדמת. אזורי אריח בחרו, אז אריחים. בחרו את האפשרות גם המעגל. הערה: אריח משמש ליצירת תמונה מורכבת של כל אחד. שדה ראייה של יחיד לוכדת רק חלק קטן מכל אחד. פונקצית הריצוף יכולה באופן אוטומטי ללכוד מרובה סמוכה משדות של נוף כל טוב, ויוצרת תמונה מורכבת של כל כן. ניתן, אפוא, כדי ללכוד באופן אוטומטי 96 תמונות משולבות לכל צלחת, שבו כל תמונה מורכבת מכילה כמה עשרות תמונות בודדות מבאר אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ספק ולמלא גורם 90%. בחירת גורם מילוי של 90% יהיה ללכוד מספר תמונות של הבארות שנבחרו כך ש90% מהשטח של כל אחד גם יהיו גלויים בתמונה המורכבת. הערה: בעת בחירת גורם מילוי, תרשים יוצג מייצג את האזור להיות צילם. בחר אחוז שיכלול את האזור היטבמתאים לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אפשרויות, בחר את מידת חפיפה הרצויה. הערה: כאשר תופרים יחד אריחים לתמונת נציג יחיד, חפיפה של 5-10% מאפשרת תפר חלק בין תמונות. עם זאת, אם תפרים תמונה הוא מיותרים, באמצעות חפיפה 0% יפחית את זמן הדמיה. שימוש 90% גורם מילוי וחפיפה של 5%, תמונה מורכבת של גם אחת מורכבת מ59 תמונות בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל הדמיה. מיקרוסקופ באופן אוטומטי לרכוש תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לבדוק תמונות משולבות של כל טוב לקרינת רקמות ספציפיות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: עדיף להתחיל עם הביקורת החיובית כדי לאשר שהחשיפה הכימית עבדה לפני התבוננות בארות טיפול ניסיוני. </li></ol> 4. לכידת תמונה ידנית של עוברים בצלחת 96 היטב הערה: כדי לאשר את התוצאות, השתמש מטרת 20x מרחק עבודה ארוכה לacמקהלת תמונות מפורטות יותר באופן ידני (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 20x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה לערוצי BF ו-GFP כראוי, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברי אדם וללכוד תמונות באופן ידני. הערה: ברגע שהגדרות החשיפה נבחרו לעובר השליטה החיובי, אינו משנה את ההגדרות. זה מאפשר השוואה של עוצמת הקרינה כמו כל תמונה שנתפס בתנאים אחידים. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצור תמונות מורכבות. הצטיידות מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת יכולה לספק אלטרנטיבה מעשית, פחות יקרה לרכישת ציוד מיוחד לסינון גבוה תוכן. שלבים ממונעים נעים בין כמה אלף לעשרות אלפי דולרים בארה&quot;ב, בהתאם לסוג והדגם ...

דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי 1, חומצה רטינואית 2 ואסטרוגנים 3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) 4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי 5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צלחת מיוחדים מצוידים למיקרוסקופיה confocal 7,8. מטרתה של שיטה זו היא באופן אוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות assay בעוברי דג הזברהבצלחת 96 היטב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence סטנדרטי. הקרינה רקמות ספציפיות ניתן להבחין באמצעות טכניקה זו ועלולה להיות גישה סבירה למעבדות שאין גישה לקוראי צלחת מיוחדות או ציוד גבוה הקרנת תוכן. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהדמיה אוטומטית כדי לזהות קולט רקמות ספציפיות אסטרוגן (ER) אגוניסטים בדג הזברה לחיות ב3 ימים לאחר הפריה (DPF). הקו המהונדס Tg (5xERE: GFP) c262/c262 מכיל 5 רצפי טנדם תגובת אסטרוגן אלמנט ה-DNA (ERE) במעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 3. בהעדר ליגנד, מיונים הם בדרך כלל לא פעילים. ליגנד מחייב מעורר שינוי קונפורמציה, המאפשר הקולטנים להיקשר ERE-DNA ולווסת את השעתוק 9. 5xERE: ניתן להשתמש בדגים GFP למסך ספריות כימיות למאפנני ER ויכולים לשמש מסך דגימות מים סביבתיים למזהמים אסטרוגניים.

<table><tbody><tr><td>פיפטות העברת פלסטיק; פיפטות העברה מפלסטיק רחבות פישר</td><td></td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברת פלסטיק; קצה עדין</td><td>פישר</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות, צלחות תחתונות עגולות ושטוחות</td><td>פישר</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 100 x 35 מ"מ</td><td>פישר</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 x 60 מ"מ צלחות</td><td>פישר</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>מידות קצה 0.05 x 0.01 מ"מ, להסרה ידנית של כוריון מעוברים</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>ראה ספר דג הזברה למתכון (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-פניל 2-תיאוריאה (PTU)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P7629-10G</td><td>הכן מלאי של 20 מ"מ (פי 100) והשתמש ב-200 &mu; M ב-E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>פרוטוקול Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם שלב ממונע</td></tr><tr><td>20x מטרת מרחק עבודה</td><td>ארוך Carl Zeiss</td><td></td><td>אנו משתמשים במטרה עם מרחק עבודה של 0.4 NA ו-8.4 מ"מ</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית Axiocam HRm Carl</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 תוכנת בקרת מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>הפרוטוקול דורש תוכנת אוטומציה ובקרה של מיקרוסקופיה כדי לאפשר לכידת תמונות מרוצפות באמצעות שלב ממונע</td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MB-1; 25 גרם</td><td>מייצרים תמיסה של 2% במי RO לשימוש ב-E3B (להלן)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 תמיסה: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17.2 גרם KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.76 גרם CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2.9 גרם MgSO4-7H2O&nbsp; - 4.9 גרם או MgSO4 - 2.39 גרם ממיסים ב-1 ליטר מים Milli-Q; יש לאחסן בבקבוק סטרילי של 1 ליטר.תמיסת 1X E3B לדגי זברה: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 מ"ל 2% מתילן כחול&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; מביאים ל-9 ליטר עם Milli-Q מים &nbsp;</td></tr></tbody></table>

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.

איור 1 מציג תמונות מרוכבים מבארות בודדות של צלחת 96 היטב. כל תמונה מורכבת מורכבת מ59 תמונות בודדות עם 5% חפיפה תמונה. שים לב שדג הזברה לחיות מכוונים באופן אקראי בתוך כל טוב, אך אנו מסוגלים להבחין הקרינה בלב מהכבד. תמונות brightfield שימושיות כמו אזכור להעריך נטייה דג הזברה ולדמיין מומים מורפולוגיים (איורים 1 א ו 1 ג). הדמיה אוטומטית באמצעות מטרת 10x משמשת לסינון כימיקלים ולקבוע איזו מתחייב הערכה ידנית בהגדלה גבוהה יותר. איור 2 מרא...

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות באופן אוטומטי תאים המגיבים לאסטרוגן בעוברים חיים של דגי זברפיש. מטרה זו מושגת תחילה על ידי רבייה של חמישה דגי זברפיש בוגרים מסוג X-E-R-E-G-F-P ליצירת עוברי זברפיש בעלי רפורטר לאסטרוגן. לאחר מכן, העוברים מועברים לבארים בודדות בלוח של 96 בארות.לאחר מכן, מוסיפים אסטרוגנים לצלחת עם העובריים. לבסוף, סורקים את הצלחת לפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי-אפי (epi fluorescent) בעל במה ממוטרת. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להראות פעילות ספציפית לרקמה של רצפטורים לאסטרוגן.אם כן, היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני טכניקות מסורתיות אחרות, כגון סינון בתושבה גבוהה (high throughput) או סינון בתוכן גבוה (high content screening), הוא שניתן לדגום פלואורסצנציה ספציפית לרקמה בזריקי zebrafish באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epi סטנדרטי בלבד. כאשר הוא מצויד בבמה ממוטורית, אין צורך בקורא לוחות ייעודי. זהירות: כימיקלים המכילים BPA ואסט radiological (estradiol) הם מסוכנים ויכולים להשפיע לרעה על העובר האנושי.יש לטפל במשבשי אנדוקרין בזהירות ולהשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים. בהדגמה זו, דגי זברה ייחשפו לאסטרוגנים 17 beta estradiol, bisphenol A ו-genine במינונים שונים, החל מ-48 שעות לאחר ההפריה, לאחר רביית דגי הזברה ואיסוף והשוואת הביצים. בהתאם לטקסט, ביום הטיפול, יש לדלל תמיסות כימיות מומסות ביחס של 1:1000 בתוך 1 mL של E3B + PTU ולערבב במיקסר vortex בעוצמה.כביקרת נשאי (vehicle control). השתמש בדילול של 1:1000 של DMSO ב-E3B ו-PTU באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק עם פיה רחבה. העבר שלושה עוברים לכל באער בלוח של 96 באערים, תוך הכנת שלושה באערים לכל תנאי.יש להימנע מהנחת עוברים בבארים חיצוניות כדי למנוע התאיידות של המצע במהלך טיפול ממושך. כדי למנוע את התייבשות העוברים, יש לפעול במהירות, להסיר את המצע מכל באר ולהוסיף 200 µL של תמיסת טיפול מעורבבת היטב. יש לוודא חזותית שכל העוברים טבולים בתמיסה ואינם דבוקים לדופן הבאר.דגרו את העובריים בטמפרטורה של 28.5 °C למשך 72 שעות לאחר ההפריה. הרדימו את העובריים על ידי הוספת 10 µL של trica בריכוז של 4 mg/mL לכל באער בלוחית 96 באערים. הניחו את הלוחית על במה ממוטרת והשתמשו בתוכנת Zeiss Zen Blue 2011.כוון את הבמה על ידי בחירת אפשרות נשא הדגימות (sample carrier) ובחירה ב-multi well 96. לאחר מכן, בחר בכיול (calibrate) ופעל לפי ההוראות השלביות; בעזרת עדשה פי 10 ובהגדרת שדה בהיר (bright field או BF), זהה עובר המשמש כביקורת חיובית והגדר את הגדרות החשיפה באופן מתאים לערוצי BF ו-GFP, תוך וידוא שאות הפלואורסצנציה אינה גורמת לרוויה במצלמה. התמקד בעובר בודד ותכנת את המיקרוסקופ לרכוש סך כולל של שלושה חתכי Z, הכוללים תמונה אחת 50 micrometers מעל ומישור אחת 50 micrometers מתחת למישור המוקד הנוכחי.בשלב הבא, הגדירו את פרמטרי התוכנה לרכישת תמונה בשיטת אריחים (tiled image) באמצעות ערוצי GFP ו-BF. תחת לשונית הרכישה (acquisition), בחרו בהגדרות מתקדמות (advanced setup), בחרו באזורי אריחים (tile regions), ולאחר מכן באריחים (tiles). בחרו במעגל.במסך אפשרויות, בחרו את סוג מחזיק הפלטות (carrier) ואת מקדם המילוי (fill factor) של 90% כדי ללכוד מספר תמונות של הבארים שנבחרו, כך ש-90% משטח כל באר יהיה גלוי בתמונה המורכבת. תחת האפשרויות, בחרו את רמת החפיפה הרצויה, כגון 5% עד 10%, המאפשרת חיבור חלק בין התמונות. לאחר מכן, התחילו את תהליך הדמיה כדי ללכוד תמונות באופן ידני באמצעות עדשה של 20x ובהגדרת BF, וזהו עובר המשמש כביקורת חיובית.הגדירו את הגדרות ה-BF וה-GFP כפי שנעשה קודם לכן וצלמו תמונות. איור זה מציג תמונות מורכבות מבארות בודדות של פלטת 96 בארות. כל תמונה מורכבת מ-59 תמונות בודדות עם חפיפת תמונות של 5%.שימו לב כי דגי הזברה החיים מכוונים באופן אקראי בתוך כל באר. עם זאת, אנו מסוגלים להבחין בין פלואורסצנציה בלב לבין פלואורסצנציה בכבד. תמונות בשדה בהיר (Brightfield) שימושיות כנקודות ייחוס להערכת כיוונם של דגי הזברה ולויזואליזציה של הפרעות מורפולוגיות.התמונות המוצגות כאן צולמו באמצעות עדשה אובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך של 20x לצורך ניתוח מפורט יותר, ונלקחו מיד לאחר הסריקה האוטומטית שהודגמה כעת, ללא הוצאת הפלטה מבמת המיקרוסקופ. באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20x, ניתן לאתר במדויק את הפלואורסצנציה בלב במסתמי העליות והחדרים המצוינים על ידי החצים, ובמסתמי אבי העורקים כפי שמוצג על ידי ראש החץ. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לצלם תמונות מ-3 פלטות של 96 באריים ליום.אל תשכחו כי עבודה עם תרכובות המשבשות את מערכת ההורמונים עלולה להיות מסוכנת, לכן יש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות המתאימים, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

מקור: Zhang, X., et al. מודל עובר דג זברה להדמיה in vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של עוברי דג זברה שהוזרקו עם Staphylococcus aureus, המאפשר כימות של התקדמות הזיהום והתפלגות החיידקים כדי להעריך את ההשפעה של מיקרוספירות ביו-חומר על אינטראקציות מארח-פתוגן in vivo.

 הדמיה פלואורסצנטית של זיהום חיידקי הקשור לביו-חומר בעוברי דג זברה

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד שיטת הדמיה חצי אוטומטית לזיהוי תאים רגישים לאסטרוגן בעוברי דג הזברה חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה ממונעת. הפרוטוקול מאפשר הדמיה ספציפית לרקמה של פעילות קולטני האסטרוגן.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים