הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות באופן אוטומטי תאים מגיבים לאסטרוגן בזחלי דג זברה חיים. זה מושג על ידי גידול ראשון של חמישה דגים בוגרים X-E-R-E-G-F-P כדי לייצר עוברי דג זברה מדווח אסטרוגן. לאחר מכן, העוברים מונחים בבארות בודדות של צלחת 96 בארות.

ואז מוסיפים אסטרוגנים לצלחת העוברים. לבסוף, הצלחת נסרקת לפלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי עם במה ממונעת. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להצגת פעילות ספציפית לרקמות של קולטני אסטרוגן.

אז היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו על פני טכניקות מסורתיות אחרות כמו תפוקה גבוהה או הקרנה של תוכן גבוה, הוא שניתן לדמות פלואורסצנטיות ספציפית לרקמה בזחלי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי בלבד. מצויד בבמה ממונעת, אין צורך בקורא צלחות מיוחד. זהירות: כימיקלים עם BPA ואסטרדיול מסוכנים ועלולים להיות בעלי השפעות מזיקות על העובר האנושי.

טפל במשבשים אנדוקריניים בזהירות והשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים. בהדגמה זו, דג הזברה ייחשף לאסטרוגנים 17 בטא אסטרדיול, ביספנול A וג'נין במינונים שונים, החל מ-48 שעות לאחר ההפריה לאחר גידול דג הזברה, ואיסוף והשוואת ביצים. על פי הטקסט ביום הטיפול, יש לדלל להפשיר תמיסות כימיות במלאי, אחד עד 1000 במיליליטר אחד של E שלוש B בתוספת מערבולת PTU במרץ.

כבקרת רכב. השתמש בדילול של 1 עד 1000 של DMSO ב-E שלוש B ו-PTU באמצעות העברת פלסטיק עם קדח גדול. פיפטה מעבירה שלושה עוברים לכל באר לצלחת של 96 בארות ומכינה שלוש בארות לכל מצב.

הימנע מהנחת עוברים בבארות חיצוניות כדי למנוע אידוי של מדיום במהלך טיפול ממושך. עובדים במהירות כדי למנוע ייבוש העוברים, מוציאים את המדיום מכל באר ומוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת טיפול מעורבת היטב. אשר חזותית שכל העוברים שקועים בתמיסה ואינם דבוקים לצד הבאר.

דגירה על העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס לאחר 72 שעות. לאחר ההפריה מרדימים עוברים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר טריקה. לכל אחד מהם, הנח היטב את צלחת 96 הבאר על במה ממונעת והשתמש בתוכנת Zeiss Zen Blue 2011.

כייל את ה-stage על ידי בחירת אפשרות מנשא הדגימה ובחירת רב בארות 96. לאחר מכן בחר כיול לפני ביצוע ההוראות המדורגות, באמצעות מטרה של פי 10 והגדרת השדה הבהיר או BF, זהה עובר בקרה חיובי והגדר את הגדרות החשיפה כראוי עבור ערוצי BF ו-GFP, וודא שאות הקרינה אינו מרווה את המצלמה. התמקדו בעובר בודד ותכנתו את המיקרוסקופ לרכוש בסך הכל שלושה קטעי Z הכוללים תמונה אחת 50 מיקרומטר מעל ואחת 50 מיקרומטר מתחת למישור המוקד הנוכחי.

לאחר מכן, כדי להגדיר את פרמטרי התוכנה לרכישת תמונה מרוצפת באמצעות ערוצי GFP ו-BF. תחת הכרטיסיה רכישה, בחר הגדרה מתקדמת, בחר אזורי אריחים ולאחר מכן אריחים. בחר את העיגול.

אפשרות באר בחר מוביל וגורם מילוי 90%כדי לצלם תמונות מרובות של הבארות שנבחרו, כך ש-90% מהשטח של כל באר יהיה גלוי בתמונה המורכבת. תחת אפשרויות, בחר את מידת החפיפה הרצויה, כגון 5 עד 10% המאפשרת תפר חלק בין התמונות. לאחר מכן התחל לצלם תמונות באופן ידני באמצעות מטרה של פי 20 והגדרת BF, לזהות עובר בקרה חיובי.

הגדר את הגדרות BF ו- GFP כמו קודם וצלם תמונות. איור זה מציג תמונות מורכבות מבארות בודדות של צלחת 96 בארות. כל תמונה מורכבת מ-59 תמונות בודדות עם חפיפה של 5% תמונה.

שימו לב שדגי הזברה החיים מכוונים באופן אקראי בתוך כל באר. עם זאת, אנו מסוגלים להבחין בין פלואורסצנטיות בלב לבין פלואורסצנטיות בכבד. תמונות Brightfield שימושיות כהפניות להערכת כיוון דג הזברה ולהמחשת חריגות מורפולוגיות.

התמונות המוצגות כאן צולמו עם מטרה למרחק עבודה ארוך פי 20 לניתוח מפורט יותר, וצולמו מיד לאחר הסריקה האוטומטית שהוצגה זה עתה מבלי להסיר את הצלחת משלב המיקרוסקופ. באמצעות מטרה של פי 20, ניתן למקם את הקרינה בלב במדויק למסתמי החדרים הפרוזדוריים המסומנים על ידי החצים ומסתמי אבי העורקים כפי שמצוין על ידי ראש החץ. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לצלם תמונות מ-3,96 לוחות קיר ביום.

אל תשכח שעבודה עם תרכובות משבשות אנדוקריניות עלולה להיות מסוכנת, לכן תמיד נקוט באמצעי הזהירות המתאימים כגון לבישת ציוד המגן האישי המתאים בזמן ביצוע הליך זה.