Name: הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד ליצור עוברים כימריים מברווז ושליו לחקר תרומות תאי הציפוי העצבי להתפתחות הקרניו-פניאלית. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מכון לאומי למחקר דנטלי Craniofacial מענק F32 (NIDCR) (DE021929) לJLF וDE016402 מענק NIDCR R01 לRAS

1. הכן את מחטי טונגסטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מוט טונגסטן במחצית באמצעות מספרי תיל כדי שהמוט לא מתכופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השחל את המוט עד הסוף מחודד של 5 3/4 כוס בורוסיליקט פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השארת כ 3/4 בשל דבק המוט מהזכוכית, לדבוק המוט לקצה פיפטה עם חרוז קטן של &quot;דבק חם להמיס&quot; (מוזיאון), המהווה את מקל הדבק המשמש לאקדח דבק. HMA צריכה להיות נמסה במהירות בלהבת אלכוהול, נזהר שלא לשרוף את הדבק וליצור עשן שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, לכופף את קצה מוט טונגסטן (כ 1/4 מהקצה העליון) עד לזווית של ° 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את פיפטה פסטר, הנח על 1/8 מקצה מוט טונגסטן ללהבת לפיד פרופאן. החזק את הקצה יציב ובדיוק בניצב ללהבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המחט מתוך להבת רגע גרגר כתום זעיר של טונג נאעשרה זבובי הנחה של המחט. </li></ol> 2. הכן פיפטות Spemann <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במבער בונזן, מחמם את הקצה הצר של פיפטה פסטר עד הזכוכית זמן קצר מעבר ללהתחדד מתחילה להתמוסס. להסיר מלהבה ולמשוך את הקצה עד פיפטה הופכת אטומה. להיות בטוח שיש עדיין חלק של החלק מחודד שיש OD של כ 0.7-1.0 מ&quot;מ. לשבור את הסוף סגר על 4 סנטימטר מלהתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סביב 2 רגל (60 סנטימטר) של צינור גומי לקצה הרחב (הפתוח) של פיפטה. מכה בקצה השני של צינור הגומי כדי לוודא ששום אוויר יכול לעבור את החלק מחודד של פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכל דלק פרופן עם לפיד להבת עיפרון מצורף, לחמם אזור סגלגל בצד אחד של פיפטה בדיוק מתחת לתחילה להתחדד. לפוצץ באוויר בעדינות רבה וכל הזמן דרך צינורות גומי עם כמות קטנה של לחץ (כ כמות הלחץ הדרושה כדי לומר תחילת letter &quot;P&quot; ברמת שיחה). כאשר הזכוכית הופכת רכה בצד אחד ומתחילה לקרוס כלפי חוץ, להסיר במהירות את פיפטה מהאש ולפוצץ קשה ויציב דרך צינורות הגומי. זה יגרום לחלק המחומם של הזכוכית כדי ליצור בועה בצורת נקניק שעלולה לצוץ, וזה בסדר. אם הבועה קטנה מדי, נסה נמס ונושב הזכוכית שוב. החלון הפתוח הסופי בכוס צריך להיות סביב 0.25 ב( 6.35 מ&quot;מ) רחב על ידי ארוך 0.5 ב( 12.7 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבעה לקצה חד כלפי מעלה, לגרד את הבועה לתוך מיכל פסולת זכוכית בעת נושבת בעדינות דרך צינורות כדי למנוע שברי זכוכית מלהיכנס לפיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהבת הגז, לשרוף את הקצוות הנותרים של הבועה ואש פולנית צידי החלון הפתוח. יש להיזהר שלא להמס את הפיר של פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעיפרון נקודת יהלום, ציון הסוף מחודד של פיפטה כ 1.25 ב( 30 מ&quot;מ) מהחלון ולשבור את הקצהעם מלקחיים כדי שפתיחת פיפטה נחתך בצורה נקיה (טפטפות נזרק עם טיפים שבורים או לא אחידים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים והקצה של להבה ממבער אלכוהול, לכופף את החלק הצר של פיפטה 0.375 ב( 9.5 מ&quot;מ) מהקצה לזווית של כ 60 מעלות כך שהחלק הכפוף הוא במישור אנכי בעת פתיחת החלון הוא בעמדת 1:00 לשימוש ביד ימין ו -11:00 לשימוש ביד שמאל. צעד זה מתבצע הטוב ביותר במתחם ללא טיוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פולנית הקצה באמצעות להבת האלכוהול תחת מיקרוסקופ לנתח. הקפד שלא לסגור את הקצה אלא להשאיר את הפתח עגול וחלקה ללא כל התכווצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של צינור גומי 1 ב( 25 מ&quot;מ), לרסס את חתיכת הצינור עם 70% אתנול, והחלק את צינורות מעל הפיר של פיפטה עד פתיחת החלון מכוסה לחלוטין. זה מתפקד כמו &quot;הסרעפת&quot; של פיפטה Spemann. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הנורה מיליליטר לטקס גומי 2מעל התחתית הפתוחה של פיפטה. הנורה שומרת על לחץ שלילי בפיפטה Spemann. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרגל באמצעות פיפטה Spemann, להעביר חרוזים כרומטוגרפיה של סביב 100-200 מיקרומטר בקוטר ממקום מסומן באחד צלחת פטרי למקום מסומן באחר תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את פיפטה Spemann, הסר את נורת הגומי ופיפטה המקום, להטות כלפי מטה, בכוס גבוהה מרופדת בצמר גפן או גזה בתחתית ומלאה במים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית. </li></ol> 3. לעקר ודגירת ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב ביצים עם 70% אתנול ומניח את הביצים במגשי ביצי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ביצים באינקובטור מחומם ב37.5 ° C ו 85-87%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים עד שהם מגיעים HH9.5, כ 26 שעה שליו ו48 שעות לברווז. </li></ol> 4. חלון ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת חתיכה קטנה של מעטפת חיצונית מהחלק העליון של הביצה עם מלקחיים, נזהרת שלא לנקב מ &#39;הקליפה הפנימיתembrane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק עם 18 G על ידי מחט 1 אינץ, לתקוע חור בקצה הצר של הביצה ולסגת כ 1-2 מיליליטר של חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את סרט הדבקה שקופה מעל החור והסימן לנקב בקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור &quot;חלון&quot; על פני השטח העליונים של הביצה (באמצעות סרט ההדבקה השקופה) באמצעות מספריים מעוקלים. </li></ol> 5. דמיינו עוברים ולהתכונן לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מוט זכוכית, מבריש בעדינות כמות קטנה של אדום ניטרלי (0.02 גר &#39;/ מיליליטר בBSS של האנק) על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קרום vitelline ולמשוך אותו על פני העובר באמצעות מחט טונגסטן חדד להבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לאטום את הביצה על ידי הצבת קלטת שקופה מעל החלון. </li></ol> 6. הפרד את רקמות התורמות מהעובר התורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט מהחלון על הביצה של עובר התורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הקיפול העצבי מהאאקטודרם הצמוד של עובר התורם, להפוך את החריצים בשני sides של הצינור העצבי, באמצעות מחט חדדה להבה טונגסטן (מיוצרת כמתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, חצה את הצינור העצבי ברמות הקדמית וגם האחוריים הרצויות של השתל ולהפריד את השתל משאר הצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקיפול העצבי מן עובר התורם או באמצעות פיפטה Spemann או סוג אחר של micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הוצא את הקלטת מהחלון על ביצת המארח ולהשתמש פיפטה Spemann למקום הקיפול העצבי תורם לצד עובר המארח בסמוך לאזור של הצינור העצבי שיקבל את ההשתלה. </li></ol> 7. הפרד את רקמות המארח והשתלת רקמות התורמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הקיפול העצבי מהצינור העצבי של עובר המארח, כפי שנעשה עם התורם. תשמור על עצמך כדי להסיר את שתל בגודל שווה כמו הרקמות התורמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחפו בעדינות רקמות מארח זה רחוק מהעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, עם מחט טונגסטן בוטה או הקצה המעוגל של מילcropipette, בעדינות להזיז את עצבי התורם לקפל לתוך הצינור העצבי מארח, שמירה על אוריינטציות Antero, אחורי וdorso-הגחון הראויה. ודא השתל הוא תחוב בלאורך הצדדים, אבל להיות בטוח שלא לתקוע או נזק לרקמות הבסיסיות. כדי לעזור לעקוב אחר פתק הכיוון המקורי סימטריה כלשהו ברקמות התורמות או מכתים ההפרש מהאדום ניטרלי. אנחנו גם צילום מסמך עובר התורם עם הרקמה הנלווית נכרתה, כמו גם את הכימרה מייד לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח סטרילית יש להוסיף לביצה אם עובר המארח מראה סימנים של התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, בזהירות מחדש חותם ולתייג את הביצה, ובעדינות להחזיר אותו לחממת לחות גבוהה (70-80%) שבו עובר chimeric יכול להתפתח לשלב הרצוי לניתוח. </li></ol> 8. אוסף של מפלצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לאסוף עובר chimeric במקבע של סרה קרה טרי ומניח אותם באופן מיידי על rocker על 4 מעלות צלזיוס לקיבעון O / N. זה יאפשר זיהוי רגיש יותר של תאי שליו עם הנוגדן אנטי שליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ביטוי גני מנתח באמצעות RT-qPCR, להקפיא עובר ישירות בחנקן נוזלי לפני מיצוי RNA. </li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הרכס העצבי הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת שנודדת בהרחבה לאורך כל העובר ומבדיל לסוגים שונים של תאים, כוללים כונדרוציטים וosteoblasts, שתורמים לשלד craniofacial. השתלת רכס עצבי במערכת chimeric שליו-הברווז תרמה רבה להבנה של יחסי גומלין הרקמה ומסלולי איתות המווסתים את התפתחות שלד craniofacial שלנו. עם זאת, בהתחשב בפוטנציאל העצום של רכס עצבי גם לייצר תאי שריר חלק, תאי שומן, מלנוציטים, תאי שוואן, ותאי עצב, מערכת הכימרה שליו-הברווז יש לו פוטנציאל אדיר ליישומים עתידיים, במיוחד בשילוב עם הקידום המהיר של ביולוגיה של תאי גזע ורפואה רגנרטיבית. מאז שליו וברווז הם שני מינים התרבו באופן מסחרי, אספקה ​​מוכנה של ביצים מופרות זולות יחסית היא זמינה ממגוון רחב של משקים. לכן, טכניקה זו צריכה להיות נגישה לresearcשלה הפועל במגוון רחב של תקציבים ושטח מתקן. למרות שטכניקה זו היא חזקה מאוד, נותרו מספר מגבלות. כמו טכניקות ניתוחיות אחרות, את האיכות ואת הכדאיות של מפלצות שליו-ברווז להסתמך על מיומנויות כירורגיות של החוקר, ולכן, לא תהיה וריאציה יותר הבין ותוך אישי בין ניסויים בהשוואה לדגמים אחרים, כגון עכבר ניצול אלה גנטיקה. יתר על כן, יש גם וריאציה בשיעורי של פיתוח ושלבים של עוברי אדם שתורמים לשחזור ולהצלחה של כל השתלה. עוברי עופות הם גם מאוד רגישים להתייבשות ולכן שלבים קריטיים במהלך הניתוח כוללים שמירה על רמות האור נמוכים, הזמן מתחת למיקרוסקופ עד למינימום, את הביצים חתומות עם קלטת ככל האפשר, ולחות גבוהה בחממה לאחר הניתוח ל להימנע מהתייבשות. במונחים של כדאיות של מפלצות, usually בין 50-75% לשרוד, למרות שאחוזים אלה יכולים להקטין את מעלה את שלב האיסוף. בפגישת 4-6 שעות טיפוסית של ניתוח, מנתח מנוסה יכול ליצור 10-15 מפלצות. ההצלחה של ההשתלה תלויה גם במידה רבה על איכות הכלים. כלים טובים מובילים לתוצאות עקביות יותר, לשחזור. באמצעות לפיד פרופאן כדי להפוך את מחטי טונגסטן מאפשר מחטים חדות ביותר להתבצע. הסוג של לפיד המשמש עושה הבדל גדול משום שהיא שולטת בגודל של הלהבה. יכול לשמש גם חידוד אלקטרוליטי, אך גישה זו אינה מתקרבת אפילו לייצור מחטים חדות כ. השתמש במוטות טונגסטן במקום חוט נגלל כך שהמחטים יכולות להתבצע ישר. Micropipette Spemann, בעוד זמן רב וקשה לעשות, הוא כלי אידיאלי להעברת רקמות. פיפטה יכולה להיות מותאמת אישית עם פתחים בגדלים שונים, וניתן להשתמש בם שוב ושוב. גורם קריטי למנצליםmicropipette ga Spemann הוא לקבל קצת נוזל בפיפטה לפני שתיגע בקצה אל פני השטח של העובר. חלק מהנוזל תמיד יזרום החוצה כאשר קשר הוא עשה עם המניסקוס על העובר. לחיצה על הסרעפת מאפשרת רקמת נוזל ושתל להיפלט בדיוק רב, ואילו מעט מרפה על הסרעפת בעדינות מוצצת את רקמת שתל מתורם לתוך פיפטה. שמירה קצת לחץ חיובי על הסרעפת שומרת על רקמת שתל מתורם בקצה פיפטה במהלך העברה, ולחץ נוסף קטן בסרעפת מאפשר את רקמת שתל מתורם כדי להיות ממוקמת במכוון במארח. להגנה של פיפטה Spemann במהלך אחסון ועיקור, הסר את הנורה מהקצה הרחב ובזהירות הכנס את הקצה מחודד לתוך הנורה. הנח את פיפטה Spemann במבחנה זכוכית, לכסות את החלק העליון בנייר אלומיניום, וחיטוי לפני הניתוח. לאחר טפטפות מרובה הן מחדשעדי לעבור עיקור שוב לניתוח, להפוך את טפטפות, לחמם אותם כמעט לרתיחה באותה התמיסה של מים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית, ולאחר מכן לשטוף שוב ושוב במים מזוקקים. טפטפות החיטוי בצינורות הבודדים שלהם. צינור הגומי שיוצר את הסרעפת ואת הנורה הגומי יש להחליף לאחר מספר עיקורים או כאשר הם הופכים לחשוכים ונוקשים. רבים מהרכיבים של פרוטוקול זה כרוך בציוד מסוכן. לדוגמא, את ההליך להכנת Micropipette Spemann כולל שלושה סוגים של להבות, כמו גם חימום, מושך, נושבת, כיפוף, חיתוך, ליטוש וזכוכית. לכן, לובש ציוד מתאים מגן אישי (PPE) שמגביר את הבטיחות כגון משקפי מגן וחלוק מעבדה הוא קריטי. בנוסף, משום שאנשים רבים סובלים מ, או שיש לו את הפוטנציאל להתפתח, אלרגיות ביצה, תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בביצים. עם אמצעי זהירות אלה בחשבון, מערכת chimeric שליו-ברווז isa שיטה בטוחה, יעילה ונגישה יחסית שיש לו יישומים רבים בעתיד.

שלד הפנים מתפתח מהצמיחה ושילוב של תהליכי פנים מרובים שמורכבים מרכס העצבי וmesenchyme mesodermal המוקף ectodermal ושכבות אפיתל endodermal 1-11. אירועי morphogenetic בתוך כל תהליך נשלטים על ידי אינטראקציות איתות ברורות בין mesenchyme וepithelia סביב 12-16. שינויים באינטראקציות אלה איתות ו / או effectors במורד הזרם שלהם לתרום לפנוטיפים מחלה ויכולים גם להיות רלוונטי להתפתחות של שלד craniofacial 17, 18. לכן, הבהרת העיתוי ואופי אינטראקציות רקמה יש פוטנציאל גדול להגדיל את ההבנה של הביולוגיה התפתחותית ואבולוציה של שלד הפנים שלנו. השימוש בעוברי chimeric לחקור אינטראקציות רקמה יש היסטוריה ארוכה בביולוגיה התפתחותית. גישה זו הייתה חלוץ ידי הנס Spemann והמעבדה שלושגילו את &quot;מארגנים&quot; עובריים על ידי השתלת רקמות בין העוברים של מינים דו חיים שונים. Spemann היה אמן של טכניקות מיקרו כירורגים שיד כישוריהם כהשלמה הפיתוח של כלים מיוחדים, בעיקר פיפטה Spemann. ויקטור המבורגר היה סטודנט לתואר שני במעבדה של האנס Spemann בפרייבורג במהלך 1920s, וזה כאשר ניסויי ההשתלה המקוריים שהובילו לפרס נובל של Spemann בוצעו. כאשר המבורגר עבר לאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ב1935, הוא פרט את התהליך של קבלת micropipette Spemann בידנית של ניסויי אמבריולוגיה 19. דרו Noden היה סטודנט לתואר שני במעבדתו של המבורגר באוניברסיטת וושינגטון עד 1972. לאחר שעברו לאוניברסיטה של ​​מסצ&#39;וסטס, אמהרסט ולאחר מכן לאוניברסיטת קורנל, Noden המשיך בודה ובאמצעות micropipettes Spemann להשתלות כירורגית מעורבת מפלצות שליו חומוס. &amp;160 #;. בעוד סטודנט לתואר שני, אחד מהמחברים (ריץ&#39; שניידר) התאמנו עם דרו Noden באוניברסיטת קורנל 1995-1998 הפרוטוקול להכנת micropipette Spemann הבא מבוסס על תיאורים שנכתבו על ידי המבורגר וNoden, וכולל שינויים שנערכו נעשו על ידי שניידר. השימוש במפלצות שליו חומוס ללימוד פיתוח craniofacial ובמיוחד להבנת תרומתם של תאי רכס עצביים היה חלוץ ידי Noden ועל ידי Le Douarin בתחילת 1970s, שנסקרו בLe Douarin אח&#39; 20. גישה זו אומצה באופן נרחב במחקרים רבים ועל ידי חוקרים רבים אחרים 1, 4, 5, 21-38. השיעורים המקבילים של צמיחה ומורפולוגיה של שליו וחומוס עושים השתלות בתוכם אידיאליים לחקר גורל תא ומעקב שושלת. עם זאת, בגלל הדמיון בין השליו וחומוס, שינויים מורפולוגיים induced ידי תאי תורם הוא קשה לפענוח. לעומת זאת, מערכות chimeric עופות אחרות כללו ברווז מקומי כדרך ללמוד מנגנונים ההופכים את העוברים נפרדים 39-50 מבחינה אנטומית. באופן ספציפי יותר, מערכת chimeric שליו-הברווז מציעה יתרונות מרובים להבחנה את השפעותיו של התורם במחשב המארח, ולהיפך. ראשית, עוברי שליו וברווז נבדלים בגודל גוף ובצורה, אשר מספק דרך ישירה כדי לחקור תורם או מנגנוני מארח ספציפי של היווצרות דפוס על ידי assaying לתחומים ההפרש של ביטוי גנים (איורים 1 ו-B). שנית, יש עוברי שליו וברווז שיעורים שונים במידה ניכרת של התבגרות, עם שליו בקיעה ב17 ימים וברווז בקיעה ב28 ימים. רכס עצבי מושתל שומר על קצב ההבשלה הפנימי שלה בתוך סביבת המארחת, ובכך, זיהוי של שינויים זמניים בביטוי גנים, אינטראקציות רקמות, histogenesis, והמורפוגנזה אפשרי51-57. לבסוף, נוגדני גרעין אנטי שליו (ש ¢ PN) מאפשר תרומות סלולריות תורם ולארח להיות באופן קבוע נבדלות זו מזו על ידי הכרת חלבון שבא לידי ביטוי בכל מקום בתאי שליו, אבל נעדר מתאי ברווז.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>האנק' s BSS עם פנול אדום</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>אדום ניטרלי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 ומיקרו; m מעוקר</td></tr><tr><td>מסנן 18 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>מס' 5 מלקחיים של Dumont</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td> <td>ספמן</td><td>בעבודת יד במעבדה</td></tr><tr><td>מחזיק</td><td></td><td></td> ביצים <td>מאפרת זכוכית ודוגמנות חימר</td></tr><tr><td>מבער אלכוהול</td><td>פישר</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>סרט שקוף</td><td>3M סקוטש</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>מוט ערבוב זכוכית</td><td>פישר</td><td>11-380C</td><td>הקצה מצטמצם ומעוגל באמצעות</td></tr><tr><td>חוט טונגסטון להבה (0.004 x 3 אינץ')</td> <td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>הקצה מושחז בלהבה בלפיד פרופאן</td></tr><tr><td>מבער בונסון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>פסטר פיפטה</td><td>פישרברנד</td><td>22-183-632</td><td>9 אינץ' (229 מ"מ)</td></tr> <tr><td>צינורות גומי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-178C</td><td>ענבר, גומי טבעי דק; עובי דופן: 0.0625 אינץ'/1.6 מ"מ; OD: 0.375 אינץ'/9.5 מ"מ; תעודת זהות: צילינדר דלק פרופאן 0.25 אינץ'/6.4 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 עם לפיד בסגנון "A" עם לפיד פליז מוברג "להבת עיפרון"</td></tr><tr><td>עיפרון נקודת יהלום</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>נורות גומי</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

הדור של עוברי chimeric הוא גישה נפוצה ורבה עוצמה כדי לחקור את הגורל תא, אינטראקציות רקמות, ומינים ספציפי תרומות להיסטולוגית ופיתוח מורפולוגי של עוברי החולייתנים. בפרט, השימוש בעוברי chimeric ביסס את חשיבותו של רכס עצבי בהכוונת מורפולוגיה המינים ספציפיים של מתחם craniofacial. השיטה המתוארת במסמך זה מנצלת שני מיני עופות, ברווז ושליו, עם מורפולוגיה craniofacial שונה להפליא. שיטה זו מאוד מקלה על החקירה של רגולציה מולקולרית ותאית של דפוס מינים ספציפיים במתחם craniofacial. ניסויים בעוברי chimeric שליו וברווז כבר חשפו אינטראקציות עצביות בתיווך פסגת רקמות והתנהגויות תאים אוטונומיים המווסתים את תבנית מינים ספציפיים בשלד craniofacial, השרירים, וintegument. המגוון הגדול של נגזרי רכס עצביים מצביע על פוטנציאל משמעותיעבור יישומים עתידיים של מערכת chimeric שליו-ברווז להבנת התפתחות חוליות, מחלה, והתפתחות.

לפני ניתוח נוסף, את היעילות של ההשתלה צריכה להיות assayed. להיסטולוגית, ביטוי מורפולוגי, או גן מנתח בדגימות רקמה, צריכים להיות מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה תאי שליו באמצעות נוגדן ש ¢ PN כמתואר 36. עבור RNA ניתוחים, מינים ספציפי תרומות לרקמות של עניין יכולות להיות מחושבים באמצעות אסטרטגיה המבוססת על ה-PCR 58. לאחר היעילות של ההשתלה אומתה, ניתן להעריך מדדי תוצאה מורפולוגיים או מולקולריים נוספים במפלצות. יחסי גומלין בין תאי התורם העצביים פסגה ורקמות הנגזרים מארח סביב העומדות בבסיס histogenesis והמורפוגנזה של מתחם craniofacial הנכונים בעבר נחקרו בהרחבה. בפרט, mesenchyme רכס העצבי מפנה את מורפולוגיה מינים ספציפית של הפנים 7, 13, 51, 59, דפוס נוצה 52, דפוס שרירים 56 </s<html> עד&gt;, וסחוס 53, 57 באמצעות הוויסות של ביטוי גני המארח. לדוגמא, mesenchyme רכס העצבי מכתיב כאשר צורות עצם בלסת התחתונה על ידי temporally ויסות ביטוי Bmp4 55. לאחרונה, החקירות מתמקדות באינטראקציות רקמות המתרחשות בשלב מוקדם מאוד בפיתוח craniofacial. בהקשר זה, ניסויי ניצול מפלצות שליו-ברווז הראו עוברי מארח להשפיע על הגירת רכס עצבית על ידי קביעת גבולות מורפולוגיים. כלומר, בעוברי quck chimeric, תאי רכס עצביים שליו תורם נודדים לתוך קשת הלסת התחתונה, ברווז המארח בדפוס כמו ברווז (1D איור). למרות תרומת מארח זה לגודל אוכלוסיית הרכס העצבית, הרכס העצבי התורם ממשיך לייצר שלד לסת תחתון, שהוא בגודל ובצורה (איור 1E) כמו שליו. דואר 1 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 6in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. מערכת Chimeric שליו-ברווז. (א) שליו ו( ב &#39;) גולגלות ברווז להציג הבדלים ניכרים בגודל ובצורה, ובכך, מתאימות בצורה אידיאלית לשימוש במערכת chimeric ללמוד פיתוח craniofacial (שונה מTokia et al. 56). (C) עיצוב ניסיוני להפקת עוברים חד צדדיים chimeric quck משליו HH9.5 בהתאמה במה ועוברי ברווז. הקיפול העצבי מוסר מצד אחד של עוברים שליו ואחרי חתיכה של הקפל העצבי מקבילה הוסר הושתלו עוברי ברווז. (ד) תאי תורם שליו (ירוק) יכולים להיות מיושמים במפלצות באמצעות נוגדן אנטי שליו (Q ¢ PN) כפי שמוצג בתצוגת הגחון של עובר chimeric HH12. (F) בלסתות quck בHH38, שליו תורם נגזר מקל7; של סחוס הוא קצר יותר וישר יותר מזה שנצפה לסחוס הנגדי הברווז נגזר מארח של מקלה, שהוא גדול יותר ומעוקל. נדפס Tokita et al., Dev. ביו. 306, 377 (2007) באישור Elsevier.

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת עוברי chimeric שנועדו לבחון את תרומתם מינים ספציפיים של רכס עצבי ו / או רקמות אחרות לפיתוח craniofacial.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בכימרות של צינורות של בריון כדי לחקור את המנגנונים שדרכם תאי רכס עצביים יוצרים דפוסים ספציפיים למין במהלך ההתפתחות הקרניו-פציאלית. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה והסרה של רצועה מהקיפול העצבי מאזור המוח האחורי האמצעי והקדמי של עובר בריון בשלב 9.5. השלב השני כולל העברה של הקיפול העצבי של תורם הבריון אל עובר המארח מסוג ברווז.השלב השלישי כולל דיסקציה והסרה של האזור המקביל מעוברי ברווז מאב בשלב 9.5. השלב הסופי הוא השמה של קיפול העצב (neural fold) של התרנגול בתוך העובר של הברווז, באזור המוח האחורי האמצעי והקדמי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בעוברי הכימרה המתקבלים כדי לאתר שינויים בביטוי גנים המתווכים על ידי תאי רכס העצב באמצעות הגמשה באתר (in situ hybridization), וכן כדי לחשוף שינויים מורפולוגיים באמצעות אנליזות היסטולוגיות.הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר צפיתי בפלמקי חום מעופפים מעל אושן ביץ' בסן פרנסיסקו. הבנתי שתאי הרכס העצבי חייבים להיות המקור לדפוס הספציפי למין, מכיוון שהם אלו היוצרים את העצמות והסחוסים של שלד מקורם הארוך. למרות שלא הצלחתי להשיג ביצים של פלמקי חום, הצלחתי למצוא ברווזי פקין לבנים.בהינתן שסן פרנסיסקו מחזיקה בצ'יינה-טאון הגדול ביותר מחוץ לאסיה, באמצעות ניצול ההבדלים בשיעורי ההבשלה ובמורפולוגיה בין שלוחות לברווטים, שיטה זו יכולה לסייע לנו להשיב על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון הבנת מקורות התבניות הספציפיות למינים. את הניתוח תבצע ד"ר Jennifer Fish, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי, ובסיועה תהיה Kate Ovitz, סטודנטית לתואר מתקדם. באמצעות מבער בנזן, חממו את הקצה הצר של פיפטת פסטור עד שהזכוכית לאורך ההיטרוּד מתחילה להמיס. הוציאו אותה מהלהבה ומשכו את הקצה עד שהפיפטה נסגרת.וודאו כי לחלק מהחלק המ narrowed קיימת קוטר חיצוני שבין 0.7 ל-1 מילימטר. לאחר מכן, שברו את הקצה האטום במרחק של כארבעה סנטימטרים מהחלק המ narrowed. לאחר מכן, חברו כ-60 סנטימטרים של צינור גומי לקצה הפתוח של הפיפטה ונפחו דרך הקצה השני.לא אמור לעבור אוויר דרך החיבור או הקצה השני של הפ pipette בזמן הפעלת לחץ עדין על ידי נשיפה לתוך הצינור. השתמשו בעיפרון פרופאן או בלפיד להסעת שטח אובלי בצד אחד של ה-pipette, ממש מתחת לתחילת ההיצרות. ברגע שהזכוכית מתחילה להתעקם כלפי חוץ, הוציאו את ה-pipette מהלהבה ונשפו בעדינות דרך צינור הגומי.פעולה זו תגרום לחלק המחומם של הזכוכית ליצור בועה בצורת נקניק. לחץ רב מדי יגרום לפיצוץ של בועת הזכוכית, ויש להימנע מכך. החלון שיווצר בפיפט צריך להיות ברוחב של כסנטימטר אחד ובאורך של סנטימטר וחצי עד שני סנטימטרים.כעת הפנו את הקצה המצרות כלפי מעלה וגרדו את הבועה אל תוך מיכל פסולת זכוכית, תוךما נשיפה עדינה דרך הפביה כדי למנוע מרסיסי זכוכית להיכנס לפיפטה. לאחר מכן, באמצעות להבת הפרופאן, שרפו בזהירות את השוליים הנותרים של הבועה ובצעו ליטוש באש (fire polish) לדפנות של החלון הפתוח. בשלב הבא, החזיקו את עיפרון היהלום במצב אנכי והשתמשו בו כדי לסמן שריטה על הקצה המצרות של הפיפטה, במרחק של סנטימטר אחד מתחילת המצירה.באמצעות פינצטה, שברו בעדינות את הפיפטה בקו החריץ. כדי להסיר את הקצה, בדקו תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהשבירה נקייה ולא משוננת. החזיקו את הפיפטה כפי שמחזיקים עיפרון, כאשר האצבע המורה מונחת מעל הפתח במרחק של כ-9.5 millimeters מקצה הפיפטה.יש לרכך את הזכוכית של הפ pipette על ידי החזקתה בסמיכות לקצה הלהבה של מבער אלכוהול. יש להפעיל לחץ על הקצה באמצעות פינצטה כדי לכופף את הקצה הצר של ה-pipette כלפי מטה בזווית של 60 מעלות תחת מיקרוסקופ סטריאו. יש לבצע פוליש באש (fire polish) לקצה במהירות ובזהירות באמצעות מבער האלכוהול.הפתח המוגמר צריך להיות עגול ונקי מחסימות. שימו לב שהקצה יהפוך לצמיג ובלתי שמיש אם יוחזק בלהבה זמן רב מדי. כעת שמנו קטע של 2.5 centimeter של צינור גומי עם 70% ethanol.השחילו אותו על גוף הפ pipette מלמעלה למטה כדי לכסות את החלון הפתוח. לאחר מכן, הניחו נורה מגומי לטקס בנפח שני מיליליטר על הקצה הפתוח של ה-pipette. כדי לשמור על לחץ האוויר הפנימי, הכינו תחילה את ביצת המארח.גזרו את ממברנת הוויטאל (Vitale) באמצעות מחט טונגסטן המחודדת בלהבה, ומתוחו את הממברנה מעל העובר. לאחר מכן, אטמו מחדש את הביצה באמצעות סרט הדבקה, כפי שנעשה עבור ביצת התורם. הסירו את סרט ההדבקה מהחלון בביצת התורם כדי לגזור את קיפול העצבים מהעובר התורם.בצעו חריצים בשני צדי צינור העצבים באמצעות מחט טונגסטן שהשחזה בלהבה. לאחר מכן, חתכו לרוחב צינור העצבים בגבהים הקדמיים והאחוריים הרצויים עבור השתל, והפרידו בעדינות את השתל משאר צינור העצבים. שימו לב לפרטים אנטומיים ספציפיים, כגון הצורה הקדמית לעומת האחורית של השתל, כדי להבטיח שרקמת התורמום תכוון באופן נכון.בעת ההחדרה למארח, ודאו שמחט הטונגסטן חדה ביותר. השתמשו בתנועות מהירות ומדויקות כדי להסיר את הרקמה במלואה ובחתיכה אחת. הסירו את קימט העצבים (neural fold) מהעובר התורם באמצעות פיפטת שמאן. שאבו מעט נוזל ככל האפשר, כדי למנוע מהרקמה לצוף ולהתרחק במהלך ההעברה.כעת הסירו את הסרט מהחלון שעל ביצת המארח והשתמשו בפיפטת שמאן (shaman pipette) כדי להניח את קיפול העצב של התורד לצד העובר של המארח, בסמוך לאזור בצינור העצב שיקבל את השתל. כעת הפרידו את קיפול העצב מצינור העצב של עובר המארח, כפי שנעשה עם התורם. הקפידו להסיר שתל בגודל שווה לרקמת התורם.דחפו בעדינות את רקמת המארח הרחק מהעובר. לאחר מכן, בעזרת מחט טונגסטן קהה או קצה מעוגל של מיקרו-פיפט, העבירו בעדינות את קיפול העצב של התורם אל תוך צינור העצב של המארח, תוך שמירה על האוריינטציות הנכונות של קדמי-אחורי (anteroposterior) וגבי-בטני (dorsoventral). ודאו שהשתל מוכנס היטב לאורך הדפנות, אך הקפידו לא לדקור או לפגוע ברקמות שמתחתיו.יש להחיל בזהירות ובעדינות תמיסת סலைன் סטרילית מעל העובר המארח. אם ישנם סימנים להתייבשות, יש לאטום כעת את הביצה בזהירות, לסמן אותה ולהחזירה בעדינות למדגרה בעלת לחות גבוהה, שבה יוכל העובר הכימרי להתפתח לשלב הרצוי לצורך אנליזה.לצורך אנליזה, אספו את העוברים הכימריים לתוך תמיסת קיבוע קרה של Sarah שהוכנה טרי. לאחר מכן, הניחו אותם מיד על רוקר (rocker) בטמפרטורה של 4 °C לקיבוע למשך לילה. פעולה זו תאפשר זיהוי רגיש יותר של ביצי שלו באמצעות הנוגדן נגד שלו.שלב חשוב נוסף לניתוחי ביטוי גנים באמצעות real-time quantitative PCR הוא הקפאת העוברים בחנקן נוזלי לפני מיצוי ה-RNA. סלילים וברווזים מראים הבדלים ניכרים בגודל ובצורה, ולכן העוברים שלהם מתאימים באופן אידיאלי ליצירת מערכת כימרית למחקר של התפתחות הפנים והגולגולת של C.באופן ספציפי, המערכת שימושית לחקירת תפקידם של תאי הרב רכס העצבי (neural crest cells). בתהליך עיצוב השלד הפניםי בעובר כימרי של ברקת-ברווז, תאי רב רכס עצבי של תורם ברקת נודדים אל תוך קשת המנדיבולה של הברווז המארח. בתבנית דמוית ברווז, תאי תורם של ברקת המסומנים בירוק נצפים באמצעות נוגדן אנטי-ברקת ממבט ונטרלי.בעובר כימרי בשלב 12, רבב העצבים (neural crest) של התורם יוצר שלד מנדיבולרי שדומה לשלד של ברקת בגודלו ובצורתו. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע כל השתלה תוך כחמש דקות. ביצוע הפעולה למשך זמן רב יותר, גם אם נעשה כראוי, מעמיד את העובר בסיכון להתייבשות ויביא לירידה בשיעור ההישרדות.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיות מודעים ליציבה שלכם, להרפות את הכתפיים ולשמור על תנוחה נכונה של הידיים. כמו כן, מומלץ לפתח שגרה ולהניח את כלי הניתוח והריאגנטים באותו מקום בכל פעם, כדי שתוכלו להשאיר את עיניכם במקרוסקופ ולהניע את ידיכם באופן אוטומטי.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

שיטה לכמת את גודלו וצורת orofacial של עוברי laevis Xenopus פותחה. בפרוטוקול זה, מדידות גודל מסורתיות בשילוב עם morphometrics הגיאומטרי כדי לאפשר ניתוחים מתוחכמים יותר של התפתחות וליקויי orofacial.

כימות Orofacial פנוטיפים ב צפרדעים

ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo   הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

כאן, אנו מתארים לעומק שיטה, המבוססת על טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, לפלח ולמדוד מודלים תלת-ממדיים של עצמות קרניומקסילופציאליות בעכברים, להערכה טובה יותר של התפתחות עצם קרניומקסילופציאלית בעכברים ממה שמתאפשר בשיטות הנוכחיות.

ניתוח מומים קרניומקסילופציאליים בעכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת תלת מימדית

למד ליצור עוברים כימריים מברווז ושליו לחקר תרומות תאי הציפוי העצבי להתפתחות הקרניו-פניאלית. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

גלה סרטונים נוספים