הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בכימרות של צינורות שליו כאמצעי לחקור מנגנונים שדרכם תאי קרום עצבי מייצרים דפוסים ספציפיים למינים במהלך התפתחות הפנים הגולגולתית. זה מושג תחילה על ידי ניתוח והסרה של רצועה של הקפל העצבי מאזור המוח האחורי האמצעי והקדמי של עובר שליו שלב 9.5. השלב השני כולל העברת הקפל העצבי של תורם השליו לעובר המארח של הברווז.

השלב השלישי כולל ניתוח והסרה של האזור המקביל של עובר מארח ברווז שלב 9.5. השלב האחרון הוא למקם את הקפל העצבי של הסליל לתוך אזור הברווז, המוח האחורי האמצעי והקדמי. בסופו של דבר, העוברים הכימריים המתקבלים יכולים לאתר שינויים בתיווך פסגה עצבית בביטוי גנים באמצעות הכלאה ב-C שתיים, ויכולים גם לחשוף שינויים מורפולוגיים באמצעות ניתוחים היסטולוגיים.

הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשצפיתי בשקנאים חומים עפים מעל חוף אושן בסן פרנסיסקו. הבנתי שתאי הפסגה העצבית חייבים להיות המקור לדפוס ספציפי למין מכיוון שהם מולידים את העצמות והסחוסים של שלד המקור הארוך שלהם. למרות שלא הצלחתי לאתר ביצי שקנאים חומות, הצלחתי למצוא ברווז פקין לבן.

בהתחשב בכך שבסן פרנסיסקו יש את צ'יינה טאון הגדולה ביותר מחוץ לאסיה על ידי ניצול ההבדלים בשיעורי ההתבגרות והמורפולוגיה בין שליו לברווזים. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון הבנת המקורות של דפוס ספציפי למין, תבצע את הניתוח ד"ר ג'ניפר פיש, שהיא חוקרת פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, תסייע קייט אוביץ, שהיא סטודנטית לתואר שני באמצעות לחמניות ומבער מחממים את הקצה הצר של פיפטת משחה עד שהזכוכית לאורך המתחדד מתחילה להימס. הסר אותו מהלהבה ומשוך את הקצה עד שהפיפטה נאטמת.

ודא שלחלק מהחלק המחודד יש קוטר חיצוני בין 0.7 למילימטר אחד. ואז נתק את הקצה האטום כארבעה סנטימטרים מהמתחדד. לאחר מכן, חבר כשני מטרים של צינורות גומי לקצה הפתוח של מכת הפיפטה בקצה השני.

לא אמור להיות אוויר שעובר דרך החיבור או הקצה האחר של הפיפטה תוך מתן לחץ עדין על ידי נשיפה על הצינור. השתמש בעיפרון פרופאן, לפיד להבה כדי לחמם אזור סגלגל בצד אחד של הפיפטה ממש מתחת לתחילת ההתחדדות. ברגע שהזכוכית מתחילה להתכופף כלפי חוץ, הסר את הפיפטה מהלהבה ונשוף בעדינות דרך צינור הגומי.

זה יגרום לחלק המחומם של הכוס ליצור בועה בצורת נקניק. לחץ רב מדי יגרום לבועת הזכוכית להתפוצץ, ויש להימנע מכך. החלון שנוצר בפיפטה צריך להיות ברוחב של סנטימטר אחד ואורך של סנטימטר וחצי עד שני סנטימטרים.

כעת כוונו את הקצה המחודד כלפי מעלה וגרדו את הבועה לתוך מיכל פסולת זכוכית תוך כדי נשיפה עדינה דרך הצינור כדי למנוע כניסת שברי זכוכית לפיפטה. לאחר מכן, בעזרת להבת הפרופאן, שורפים בזהירות את הקצוות הנותרים של הבועה ומלטשים אש את דפנות החלון הפתוח. לאחר מכן, החזק את עיפרון קצה היהלום במצב אנכי, השתמש בעיפרון קצה יהלום כדי לקלוע את הקצה המחודד של הפיפטה סנטימטר אחד מתחילת ההתחדדות.

בעזרת מלקחיים, שברו בעדינות את הפיפטה בקו הניקוד. כדי להסיר את הקצה, בדוק תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהשבר נקי ולא משונן. החזיקו את הפיפטה כפי שהיו מחזיקים עיפרון עם אצבע מורה מעל החלון הפתוח במרחק של כ-9.5 מילימטרים מהקצה.

רככו את הכוס על הפיפטה על ידי החזקתה בסמוך לקצה הלהבה של מבער אלכוהול. הפעל לחץ על הקצה בעזרת מלקחיים כדי לכופף את הקצה הצר של הפיפטה כלפי מטה בזווית של 60 מעלות תחת טווח חיתוך. במהירות ובזהירות, אש ליטשה את הקצה עם מבער האלכוהול.

הפתח המוגמר צריך להיות מעוגל וללא הפרעה. שימו לב שהקצה יהפוך מכווץ ובלתי שמיש אם הוא מוחזק בלהבה זמן רב מדי. כעת יש לשמן צינור גומי באורך 2.5 ס"מ עם אתנול 70%.

החלק אותו מעל פיר הפיפטה מלמטה למעלה כדי לכסות את החלון הפתוח. לאחר מכן הניחו נורת לטקס של שני מיליליטר על הקצה הפתוח של הפיפטה. כדי לשמור על לחץ אוויר פנימי, ראשית, הכינו את ביצת המארח.

חותכים את קרום Vitale באמצעות מחט טונגסטן מושחזת להבה, ומושכים את הממברנה מעל העובר. לאחר מכן אטמו מחדש את הביצה בנייר דבק כפי שנעשה עבור הביצית התורמת. הסר את הסרט מהחלון בביצית התורמת כדי לחתוך את הקפל העצבי מהעובר התורם.

צרו חריצים משני צידי הצינור העצבי באמצעות מחט טונגסטן מושחזת להבה. לאחר מכן חתוך את הצינור העצבי ברמות הקדמיות והאחוריות הרצויות של השתל והקניט את השתל בנפרד משאר הצינור העצבי. שימו לב לכל פרט אנטומי מסוים כמו הצורה הקדמית לעומת האחורית של השתל, מה שיכוון את רקמת התורם כראוי.

כאשר הוא מונח במארח, ודא שמחט הטונגסטן חדה במיוחד. השתמש במשיכות מהירות ומכוונות על מנת להסיר את הרקמה לחלוטין ובחתיכה אחת, הסר את הקפל העצבי מהעובר התורם באמצעות פיפטה שמאן. שאב כמה שפחות נוזלים או שהרקמה עלולה לצוף בהעברה.

כעת הסירו את הסרט מהחלון על הביצית המארחת והשתמשו בפיפטה השמאנית כדי למקם את הקפל העצבי של התורם לצד העובר המארח הסמוך לאזור הצינור העצבי שיקבל את ההשתלה. כעת הפרד את הקפל העצבי מהצינור העצבי של העובר המארח כפי שנעשה עם התורם. הקפד להסיר שתל בגודל שווה לרקמת התורם.

דחף בעדינות את רקמת המארח הרחק מהעובר. לאחר מכן, בעזרת מחט טונגסטן קהה או קצה מעוגל של מיקרו-פיפטה, העבירו בעדינות את הקפל העצבי של התורם לתוך הצינור העצבי המארח, תוך שמירה על כיווני הגחון האחוריים והגביים הנכונים. ודא שהשתל תחוב לאורך הצדדים, אך הקפד לא לתקוע או לפגוע ברקמות הבסיסיות.

יש למרוח מי מלח סטריליים בזהירות ובעדינות על העובר המארח. אם יש סימני התייבשות, כעת אטמו מחדש בזהירות וסמנו את הביצה והחזירו אותה בעדינות לאינקובטור לחות גבוהה שם העובר הכימרי יכול להתפתח לשלב הרצוי. לניתוח.

לניתוח, אספו את העוברים הכימריים בקיבוע הטרי הקר של שרה. ואז הניחו אותם מיד על נדנדה בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע לילה. זה יאפשר זיהוי רגיש יותר של ביצי שליו עם הנוגדן נגד שליו.

צעד חשוב נוסף לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת הוא הקפאת העוברים והחנקן הנוזלי לפני RNA. סלילי מיצוי וברווזים מראים הבדלים ניכרים בגודל ובצורה, ולכן העוברים שלהם מתאימים באופן אידיאלי ליצירת מערכת כימרית. לחקור את התפתחות הגולגולת C.

באופן ספציפי, המערכת שימושית לחקירת תפקידם של תאי הפסגה העצבית. בדפוס שלד הפנים בתאי הפסגה העצבית של תורם העובר הכימרי נודדים לתוך קשת הלסת התחתונה של הברווז המארח. בתבנית דמוית ברווז, תאי תורם שליו בירוק נראים עם נוגדן נגד שליו ממבט הגחון.

בעובר כימרי שלב 12, הפסגה העצבית של התורם מייצרת שלד לסת תחתונה דמוי שליו בגודלו ובצורתו. לאחר השליטה, ניתן לבצע כל השתלה תוך כחמש דקות. אם נעשה כראוי יותר, מעמיד את העובר בסיכון לייבוש ושיעור ההישרדות יקטן.

בזמן ביצוע הליך זה, חשוב להיות מודע ליציבה שלך, להרפות את הכתפיים ולשמור על תנוחת יד טובה. כמו כן, פתח שגרה והנח את כלי הניתוח והריאגנטים שלך באותו מקום בכל פעם, כך שתוכל לשמור את העיניים במיקרוסקופ ולהזיז את הידיים בצורה אוטומטית.