טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

שלום, אני כריסטינה מקנאן מאוניברסיטת הלסינקי, פינלנד. אחד האתגרים באפיון של קומפלקס חלבונים מסוים הוא קביעת ההרכב המולקולרי שלו. דבר זה דורש פיתוח של שיטות לבידוד וניקוי של הקומפלקס מהסביבה התאית שלו.

תחום המחקר במיקרוביולוגיה הוא אינטראקציות בין וירוסי צמחים למארחם, ולכן אנו מעוניינים במגוון קומפלקסים של חלבונים גרעיניים ריפוניים ויראליים הנוצרים במהלך ההדבקה. בעבר, חקרנו בהצלחה קומפלקסים אלו באמצעות טיהור מבוסס טאג זיקה (affinity tag). ה-Twin-Strep tag הוכח כאחד הטאגים הטובים ביותר.

עם זאת, הבחנו במגבלות מסוימות בשימוש בשיטה זו, אחת מהן היא תפוקה נמוכה, ולכן ביקשנו לשפר את השיטה. שלום, שמי מאטה ואני אלווה אתכם לאורך הפרוטוקול הניסויי. אך ראשית, הרשו לי לסקור את עיקרי השיטה.

אנו משתמשים בחרוזי strep tachin macro prep לטיהור קומפלקסים ספציפיים בין חלבונים בעלי תג twin strept לבין השותפים הפיזיולוגיים שלהם לקשירה. ה-Strep strept tagged והטטראמר מוצגים בירוק, חלבון ה-twin strept tagged בכחול, השותף לקשירה שלו בכתום ושני עותקים של ה-strep tag באדום.

בגישה הקנונית, החלבונים שאינם קשורים, המוצגים כצבעים אפורים, מוסרים על ידי שטיפה. הקומפלקסים הקשורים נאלוטים באופן תחרותי באמצעות ביוטין, המוצג בצבע ורוד. עם זאת, בעת שימוש בגישה זו, הבחנו באלוציה חלקית של הקומפלקסים הקשורים, כאשר רק חלק קטן הצליח להתנתק מחרוזי ה-strep tachin.

דבר זה מוביל להתאוששות נמוכה של חלבון המטרה. כדי להקל על ניתוחים עוקבים, ניתן לשפר את התאוששות חלבון המטרה על ידי ביצוע אלוציה דנטורטיבית (denaturing elution) באמצעות S-D-S-S-D-S. משקעים (Miss cells) נוצרים סביב חלבון הפיתיון twin strep ttag הדנטורטיבי.

השותף לקשירה שלו ומסביב למנומרים שהתפרקו של strept actin. זיהום הדגימה שנוצר כתוצאה משחרור strept actin אינו קביל אם יש צורך בניתוח נוסף של הדגימה באמצעות ספקטרומטריית מסות. כדי להתגבר על בעיית זיהום הדגימה, פיתחנו שיטה שבה טטראמר של strep tachin מיוצב תחילה באמצעות קשירה כימית (crosslinking).

השרף מקושר-הצלב המתקבל משמש לטיהור חלבון הפיתיון ושלדגם השותף לקשירה שלו; אלוציה עם SDS מבטיחה השבה גבוהה של חלבונים, בעוד שקישור צולב כימי של השרף מבטיח אלוציה של חלבון הפיתיון המסומן ב-strept והשותף לקשירה שלו ללא זיהום של הדגם על ידי ה-strept המשוחרר. יש להביא לטמפרטורת החדר מיקרו-מבחנה אחת אטומה המכילה 2 mg של BS3 crosslinker.

הכינו קצה של פפטה להעברת שרף על ידי חיתוך קצה הפפטה; השביו מחדש את שרפי ה-strep tact וה-macro prep על ידי ניעור קצר ונמרץ, והעבירו מיד 600 µL מהסספנזיה לעמודת סננטריפוגה מסוג CoStar spinx filter column. סנטריפוגו במהירות של 4,000 RPM למשך 30 שניות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 450 µL של phosphate buffered saline. מטרת שלב זה היא להחליף את ה-primary am mean triss בפוספט שאינו ריאקטיבי.

יש להשליך את הנוזל שעבר דרך העמוד (flow through). ערבבו את התכולה על ידי הפיכה של המבחנה מספר פעמים. חזרו על שלבי הצנטריפוגה והשטיפה פעמיים והשאירו את שרף הסינון ב-430 µL של P-B-S-P-H eight.

לאחר הסבב האחרון של סנטריפוגה, נקבו את רדיד האלומיניום של המיקרו-מבחנה באמצעות טיפ של פיפט המכיל 100 µL של Milli-Q Water. המיסו את אבקת ה-BS3 במים על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה. ברגע ש-BS3 התמוסס לחלוטין, הוסיפו מיד 20 µL מהתמיסה לעמודת ה-spin X. ודאו שהתכנים מעורבבים כראוי.

סובב את העמודה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך וידוא שהשרף מעורבב כראוי עם תמיסת BS three. כדי לעצור את התגובה, הוסף 6 µL של tris בריכוז 3 M המותאם ל-pH 7.5 באמצעות חומצה כלורית. סובב את העמודה למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר וסבב בצנטריפוגה במהירות של 4,000 RPM למשך 30 שניות.

בטמפרטורת החדר, השעו את השרף (resin) הקשיר ב-450 microliters של tris buffered saline עם tween 20 והשליכו את נוזל השטיפה (flow through). חזרו על שלבי הסנטריפוגציה והשטיפה פעמיים נוספות. בשלב האחרון, השעו מחדש את השרף ב-450 microliters של TBS. העבירו את תגלי השרף למבחנה נקייה, השעו מחדש את השרף שנותר בעמודה עם 450 microliters נוספים של TBS והעבירו לאותה מבחנה.

חזור על השלב האחרון פעם נוספת כדי להבטיח העברה מקסימלית של השרף מהעמודה לשפופרת. השאר את השפופרת עם תרחיף השרף למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והבאת את הנפח ל-600 microliters. לאחר הסרת עודפי TBS, השרף מוכן לשימוש מיידי או ניתן לאחסון בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius ללא הקפאה.

שיטה זו מתאימה לטיהור של כל חלבון שחוברו אליו תגי twin strep ושל הקומפלקסים הקשורים אליו. החלבון יכול להיות ממקור בעלי, צמחי או בקטריאלי, וניתן לבודדו הן מליזאט תאי כולל והן מפרקציה אורגנלית מועשרת. בדוגמה זו, אנו מבודדים את חלבון ה-twin strep tag מסוג VPG Pro של potato virus A מהפרקציה הגרעינית של צמחים נגועים בנגיף. התחילו בצנטריפוגציה של מיליליטר אחד של דגימת חלבון הפיתיון (bait protein) בבופר קישור במהירות של 13,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.

העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה כדי למזער את הקישור של חלבונים ביוטיניליים אנדוגניים ל-strep tact ולשרף. הוסיפו avadon עד לריכוז סופי של 100 µg/mL, תוך וידוא שהתכולה מעורבבת היטב. סובבו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

יש להשהות מחדש את השרף הקשיר באמצעות וורטקס, ובעזרת טיפ פפטה רחב להוסיף מיד 50 µL מתלי השרף למבחנה המכילה את דגימת חלבון הפיתיון. יש לסובב למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 4 °C בזמן ההמתנה. הגדירו את התרמו-מיקסר ל-55 °C וחממו מראש 500 µL של באפר Elu לשימוש בשלב האלוציה, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C.

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את הסורבנט (resin) עם 1 mL של באפר שטיפה מקורר מראש מספר 1, תוך סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. חזרו על שלבי הסרטיפוגציה והשטיפה שלוש פעמים בשלב האחרון.

יש להשהות מחדש את השרף ב-250 µL של בופר שטיפה מספר 2 ולהעביר את תרחיף השרף לעמודת spinx נקייה. יש להשהות מחדש את השרף שנותר במבחנה ב-250 µL נוספים של בופר שטיפה מספר 2 ולהעבירו לאותה עמודה; סבב את הצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבר את העמודה למבחנת dolphin nose נקייה בנפח של 2 mL והשלך את הנוזל שעבר סינון (flow through).

עברו מיד לשלב האלוציה הבא. הוסיפו 150 µL של בופר אלוציה שחומם מראש לעמודת ה-spinx. דגרו את התמיסה ב-thermo mixer למשך חמש דקות ב-55 °C, בערבוב של 1400 RPM, סובבו בצנטריפוגה ב-4,000 RPM למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והשליכו את העמודה.

החלבונים המטרה המטוהרים מוכנים כעת לאנליזה נוספת וניתן לאחסנם בטמפרטורה נמוכה מ-20-°C; התמונה מדגימה כי אלוציה של חלבון משרף strept actin macro prep באמצעות biotin היא חלקית בהשוואה לאלוציה באמצעות SDS. ההבדל בעוצמות האות ב-western blot משקף תנובות חלבון שונות שהושגו באמצעות שתי טכניקות האלוציה. למרות שאלוציה באמצעות SDS יעילה הרבה יותר מאלוציה באמצעות biotin, היא מובילה לזיהום של הדגימה על ידי strept actin ששוחרר.

התמונה מציגה ג'ל בצביעת כסף של SDS EITs משרף Strept actin Macro prep; שימו לב לנוכחות של strept actin ששוחרר בנתיב השמאלי אך להיעדרו בנתיב הימני. הדגימה משמאל הופקה מהשרף שאינו מקושר, והדגימה מימין מהשרף שקושר עם BS three. על סמך תוצאות אלו, אנו מסיקים שקישור צולב עם BS three מונע את שחרור ה-strept actin מהשרף במהלך אלוציה ב-SDS.

בדוגמה זו השתמשנו בשרף Strept actin macro prep המקושר בצלב עם BS3 כדי לטהר את חלבון הפיתיון VPG PRO ואת השותפים לקשירה שלו. מנה מהדגימה המטוהרת הועברה לאנליזת mass spec לצורך זיהוי החלבון. היעדר פס ספציפי בביקורת השלילית מאשר את הספציפיות של ה-pull down.

הפס ה lower תואם לחלבון הפיתיון VPG PRO והפס ה upper תואם לשותף הקישור שלו NIB replicate שזוהה באמצעות ספקטרומטריית מסות. שלום, הרגע הדגמנו בפניכם כיצד ניתן להשתמש בקשירה כימית (chemical cross-linking) כדי להתגבר על המגבלות הקשורות לדליפה ודיסוציאציה משרף strep tactin. בנוסף לניקוי של קומפלקסים של חלבון-חלבון, ניתן להשתמש בשיטה זו גם לניקוי קומפלקסים של חלבונים עם חומצות גרעיניות, כולל אלו שנקשרו באופן הפיך באמצעות פורמאלדהיד.

לבסוף, ניתן להשתמש בשיטה לניקוי חלבוני ממברנה עם תג strep tech. אלו מומסים באמצעות דטרגנטים. דטרגנטים נחוצים כדי לשמור על חלבונים הידרופובים אלו בתמיסה.

עם זאת, נוכחותם עלולה להוביל לזיהום הדגימה בשחרור של strep tane. גם כאשר נעשה שימוש בביוטינולגיה מתונה, אנו סבורים כי קישור צולב של שרף עשוי לספק פתרון לבעיית זיהום הדגימה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.בסדר.