במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר ולהשוות את קינטיקה הצבירה של מיני חלבוני טאו לא מותאמים והיפר-זרחניים. זה מושג על ידי יצירת חלבון טאו לא שונה והיפר-זרחני על ידי מערכת הזרז בסיוע רוכסנים. השלב השני הוא להגדיר את מבחני הצבירה כך שיתאימו לכל אחד משני מכשירים שונים.

תהליך צבירת הטאו מנוטר על ידי הקרינה של שני תיואים שונים. פלבין מת, theof flavin S ו-theof flavin T.השלב האחרון הוא לשרטט ולהשוות את עקומות הצבירה. בסופו של דבר, השינויים הקינטיים של פלואורסצנטיות תיאו פלבין מקשירה למיני TA מצטברים משמשים כדי להראות את השיפור התלוי בהיפר-זרחון של פרפור טאו במבחנה.

היי.ברוכים הבאים למאמר JOV שלנו. בדיקות צבירה במבחנה באמצעות חלבון היפר פוספו טאו. שמי מינקו, והניסויים יבוצעו ויודגמו בדרך זו.

ועבור פרוטוקול זה, מאגר צבירה טרי למדי שנעשה במהלך החודש האחרון. רגע לפני השימוש בו הוסף DIO שלושה אטול למילימולר אחד נדרש גם תה תיאו פלבין מסונן או תמיסת מלאי S. תמיסת מלאי Hein, שניהם ניתנים לאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס וחלבון מגבת המאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.

משוך את המגבת על הקרח, ולאחר מכן כוונן את הריכוז שלה באמצעות מאגר הצבירה כנדרש לעקביות. סובבו את המגבת עם מאגר צבירה ו -20, 800 גרם למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. כעת העבירו את הסופינט לצינור אחר ושמרו אותו על קרח עד שיגיע הזמן להרכיב את תגובת הצבירה.

הגדר את תערובת הצבירה בצינורות מיקרו צנטרי של 1.5 מיליליטר. על פי הטבלה, 100 מיקרוליטר מספיקים למנה אחת של מגיבים. חשב את הנפח הכולל על סמך מספר התגובות והגדל אותו ב -10%כדי לקחת בחשבון שגיאות פיפטינג.

ניתן להחליף את הפלפל בחומצה ראונית או במאגר צבירה במידת הצורך. מערבבים את התגובות בהיפוך ומעבירים אותן ל-37 מעלות צלזיוס ללא צמחייה. לאחר כל 24 שעות, מלאו את התגובות במילימולרית משלימה של DTT כדי להבטיח סביבה מפחיתה למדידת הקרינה.

מחממים את פלואוריומטר הספקטרום למשך כ -10 דקות. זה ישפר את עקביות המדידות בתוכנת המחשב. בחרו את מצב התצוגה בזמן אמת שנמצא במרכז הבקרה של המכשירים.

הגדר את אורך גל העירור ל-450 ננומטר עם החריץ בשני ננומטר והגדר את אורך גל הפליטה ל-510 ננומטר עם חריץ של חמישה ננומטר. לאחר מכן חזור למרכז הבקרה של המכשיר ובחר ניתוח אורך גל קבוע. לחץ על מקש ההוספה במסגרת העליונה כדי להוסיף קבוצה של אורכי גל.

הגדר את פרמטרי הרכישה של שגיאת התקן לאחד ואת הניסיונות המקסימליים לשלושה. לאחר מכן לחץ על הוסף. לאחר מכן, לחץ על Go כדי לפתוח את חלון תצוגת הנתונים.

כעת בחלון תצוגת הנתונים, לחץ על התחל פעולה כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח לדוגמה החדשה ובחר לא ידוע עבור סוג המדגם. לאחר מכן הכינו את התגובות לביצוע מדידות לכל 100 מיקרוליטר ב-98. מיקרוליטרים של מאגר צבירה, ושני מיקרוליטרים של שלושה מילי-מולארי של פלבין S או T פיפטה את התערובת מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב טוב.

העבירו את כל 200 המיקרוליטרים של תערובת אחת ל-FA שלוש qve וטענו אותה למקומה. לאחר מכן ללקק לרוץ כדי לאסוף את נתוני הקרינה לאחר הוצאת התמיסה מהווט, שטפו אותה שלוש פעמים במים מזוקקים וייבשו אותה בזרם אוויר. בדיקה זו כוללת את הצבע הפלואורסצנטי בתגובת ה-aion, המאפשרת מדידות רציפות ונעשית טוב יותר עם קורא צלחות אוטומטי של באר מחצלת.

פרמטר רגיל עובד גם מוגבל על ידי מהירות הפעולה הידנית. הגדר את תערובת הצבירה בצלחת שחורה אטומה 96 באר. עם 360 מיקרוליטר באר נפח 200 מיקרוליטר מספיקים לכל מדידת נקודת זמן.

מערבבים היטב כל תגובה עם פיפטינג. דגרו את צלחת 96 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס וכל 24 שעות הוסיפו מילי-טוחנת נוספת של DTT כדי להבטיח סביבה מצמצמת בכל נקודת זמן. למדידה, הפעל את קורא המיקרו-פלטות הרב-מצבי ואת המחשב לפחות 10 דקות מראש בתוכנת המחשב.

הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ובחר את מצב עוצמת הקרינה. לאחר מכן הגדר את אורך גל העירור ל-450 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-5 ו-10 ננומטר. הכנס את צלחת 96 הבאר לתוך הציור ולחץ על מקש הקריאה.

לאחר ביצוע מדידות, החזר מיד את הצלחת לחממה לפני ניתוח הנתונים, ניתן לבצע את בדיקת המצב הרציף באמצעות ספקטרופוטומטר קומפקטי לבדיקה זו. הגדר את תערובת הצבירה בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. 200 תגובות מיקרוליטר מספיקות כדי למדוד נקודת זמן.

הפוך את הצינורות לערבוב. הגדר את התגובות ב-37 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר והוסף מילימולר אחד של DTT כל 24 שעות כדי לבצע מדידות. הגדר את האורומטר והתוכנה כפי שנעשה עבור בדיקת מסוף ללא מת.

העבירו את כל התערובת לווטרינר והניחו אותה במחזיק הדגימה בתא הדגימה וסגרו את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה במרווחי הזמן המתאימים. אם מרווח זה קצר, כמו 30 או 60 שניות, זה בסדר להשאיר את וטרינר ה-Q במכונה בין המדידות עד להגעה לנקודת הזמן האחרונה.

החזר את התגובה מהווט לצינור הדגימה שלו והחזר את הצינור לחממה בסיום. נשען על הווט כפי שהוראה קודם לכן באמצעות טאו רקומביננטי ו-P tal. שני פרוטוקולים שונים נקבעו כדי להשוות את הקינטיקה של צבירה של טאו ו-p tal, תוך ניצול הפליטה הפלואורסצנטית החזקה של פלבין t ו-s בעת הקישור לצברי חלבון עמילואיד, כולל טאו ו-p tal, עם או בלי הצבע הפלואורסצנטי.

בתגובת הצבירה, היה שיפור עקבי של צבירת טאו על ידי זרחון יתר. בדרך כלל, T ו- p tal liga עולים במהירות במהלך 30 הדקות הראשונות לפני האטה משמעותית, כולל theof flavin. T בתגובות הצבירה גורם לפיגור משמעותי בקצב הצבירה.

גם תיאוף פלביאן וגם t התקרבו לרמה לאחר שהגיבו במשך 160 דקות. Bio flavin s, לעומת זאת, לא גרם להאטה ניכרת של הצבירה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מערכת עצבים מרכזית נוספת לאיזופורמים או חלבונים אחרים המועדים לצבירה בניוון עצבי, כמו באמצעות הבדיקה על מנת להבין את התרומה של איזציה של חלבון בפתוגנזה לאחר התפתחותו.

טכניקה זו של הכנת חלבון היפר פוספט דרך PA למחקר בתחום, מחלות רבות כדי לחקור את הטיפולים ופיתוח התרופות שלנו.