Name: במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: למדו איך לנטר את קינטיקת הצבירה של חלבון טאו מופוספורל-יתר לעומת טאו לא מעובד במבחנה. השיטה משתמשת בצביעת תיופלאבין ומסייעת לחוקרים להבין את מנגנוני מחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG039768) ל-MHK. אנו מודים לד"ר תומאס שארקי ולד"ר הונגאו יאן על אספקת המכשירים בנדיבות, כמו גם לשון וייס ויאן וו על הסיוע הטכני.

1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ צבירה (20 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). אחסן בRT, יציב במשך חודשים. להשלים dithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT) לפני השימוש. הערה: חיץ מבוסס HEPES (10 מ&quot;מ HEPES, pH 7.5, 0.1 מ&quot;מ EDTA, 5 מ&quot;מ DTT) גם מייצר תוצאות דומות בצבירת טאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן thioflavin T או thioflavin פתרון S המניה (3 מ&quot;מ, מומס חיץ צבירה), ולסנן לפי 0.22 מיקרומטר יחידת סינון סטרילי. חנות ב -20 ° C בצינור מכוסה על ידי רדיד אלומיניום, יציב במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות הפרין (300 מיקרומטר, מומס חיץ צבירה). חנות ב -20 ° C, יציבה במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן dithiothreitol מניות (DTT) (1 M, מומסים במים). Aliquot לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני מבחני צבירה, להפשיר את הפתרון 1 M ב RT. מהמניות 1,000x זה, להכין aliquot של 100 מ&quot;מ עובדים המניה עם מים ללא יונים. השאר על קרחעד מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר טאו ממקפיא -80 מעלות צלזיוס. להפשיר על קרח. התאם טאו לריכוז שנקבע מראש עם חיץ הצבירה. ספין בmicrocentrifuge ב20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר אגרגטים גדולים מראש יצרו. צעד מראש ספינינג זה מגדיל עקביות במדידת הקרינה שלאחר מכן של כל מנה של הכנת החלבון. מעביר את supernatant לצינור אחר; להשאיר על קרח עד מוכן להרכיב את תגובת הצבירה. </li></ol> 2. אין-צבע, Assay Terminal הערה: תגובת הצבירה של assay זה נעשה בהעדר הצבע פלואורסצנטי. לאחר ערבוב כל הרכיבים, התגובה מותר להמשיך לנקודות זמן שנקבע מראש. אז Aliquots לקוחים מתוך תגובת הצבירה ומעורבבת עם tht או THS לעמילואיד מחייב לפני קריאת הקרינה. הנפח הראשוני של תגובת הצבירה תלויה במספר נקודות זמן הדרוש. גישה זו עשויה requזעם כמות גדולה של חלבון טאו, אבל הוא מהיר, פשוט, וניתן לעשות זאת בfluorometer או קורא צלחת רב היטב (ראה דיון). להלן פעולת צעד-אחר-צעד, באמצעות spectrofluorometer הקומפקטי ISA SPEX FluoroMax-2 לכימות הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כמו בטבלה 1. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 100 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת. להתאים את הכמות לתערובת הצבירה כולו מבוססת על נקודות הזמן דרושות לניסוי המסוים. להוסיף 10% נוספים מכל רכיב לתת מקום לpipetting שגיאה. ניתן להחליף הפרין התגובה מכילה הטיפוסי מוצג כאן על ידי חומצה הארכידונית או חיץ צבירה. להוסיף DTT עד 1 מ&quot;מ לתערובת התגובה. אם כל התגובה נמשכת יותר מיום אחד, להשלים יומיומי DTT טרי (1 מ&quot;מ) כדי להבטיח סביבת הפחתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב. Plaהספירה כל תגובה באמבט חממה או מים 37 מעלות צלזיוס. תסיסה אינה נחוצה לצבירת טאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מדידת הקרינה, להדליק את spectrofluorometer (המנורה ראשונה, ולאחר מכן מחשב). הערה: מנורת קשת קסנון, שניתן להשתמש מייד. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר עבור לאפשר להתקן להתחמם במשך כ -10 דקות לפני קריאת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה במחשב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר במצב בזמן אמת תצוגה במכשיר Control Center, גל עירור מוגדר 450 ננומטר (חריץ 2 ננומטר) ואורך גל פליטה 510 ננומטר (חריץ 5 ננומטר). מצב חלון תצוגה לסגור בזמן אמת כדי לחזור למרכז בקרת Instrument. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מפתח אורך גל ניתוח, הוספת עיתונות &gt;&gt; קבוע במסגרת העליונה להוסיף סטי אורכי גל. פרמטרים שנקבעו רכישת שגיאת תקן 1 וניסויים מרביים עד 3, ולאחר מכן לחץ על הוסף. לחץ על Go! כדי לפתוח את תצוגת נתוניםחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון תצוגת נתונים, לחץ על התחל ACQ כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח מדגם החדשה. בחר &quot;לא ידוע&quot; לסוג מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תערובת צבירה 100 μl, להוסיף 98 μl חיץ צבירה ו -2 μl 3 מ&quot;מ thioflavin מספר פעמים ט Pipet לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת כולה לקובט (FCA3, ממד חיצוני, wxlxh = 12.5 מ&quot;מ x 12.5 מ&quot;מ x 45 מ&quot;מ). מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט. </li></ol> 3. עם צבעים, מתמשך המצב Assay על קורא צלחת SpectraMax M2 הערה: assay זו שונה מהקודמת שבצבע הניאון tht או THS כלול בaggregaתגובת tion. זה מאפשר מדידה רציפה של אותה הקבוצה של תגובות. בשל השימוש החוזר ונשנה של התגובה, שיטה זו טובה יותר לעשות עם קורא צלחת רב גם אוטומטי (כפי שמוצגת להלן הניתוח של SpectraMax M2). Fluorometer רגיל גם עובד, אבל תדירות מדידה של תגובות צבירה מהירות היא מוגבלת למדי, בשל האופי הידני של הפעולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את תמהיל הצבירה בצלחת 96-היטב (96-גם צלחת מוצקה שחורה, גם בנפח 360 μl, תחתית שטוחה) כמו בטבלה 2. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק לאחד מדידת נקודת הזמן. מערבבים היטב על ידי pipetting מספר פעמים. להשלים טרי 1 המ&quot;מ DTT בכל יום במהלך כל ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת 96-גם על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לפני מדידת הקרינה, להפעיל את קורא microplate מצב מרובה ומחשב. לאפשר מספיק זמן לmachine לייצב, כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה במחשב. להגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולבחור עוצמת הקרינה מצב (FI-Top קרא), גל עירור להגדיר באורך גל ופליטה 450 ב 510 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת 96-היטב למגירה ולחץ על מקש READ להתחיל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקריאה, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה לחממה 37 ° C. להעתיק את הנתונים ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני Excel לניתוח נתונים ומזימות. </li></ol> 4. עם צבעים, המתמשך המצב Assay על Spectrofluorometer קומפקטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כבטבלה 3. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את spectrofluorometer ולהגדיר את התוכנה כבצעדים 2.3 ו -2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל התערובת tקובט OA. מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קריאה במרווחי זמן המתאים על-ידי לחיצה על הפעלה והקלטת נתונים. אם הצבירה היא להיות במעקב בתדירות גבוהה (לדוגמא, בכל שנייה 30 או 60), השאר את התגובה בקובט ובמכונה עד או המדידה סיימה, או כאשר יש מספיק זמן כדי להחליף תגובות או cuvettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט. </li></ol>

אין לנו מה לחשוף.

פרוטוקול זה מדגים תנאי assay שונים ומכשירים המזהים קינטיקה צבירת טאו המהיר זירחון תלוי. בassay המסוף, צבע הקרינה tht מתווסף לחלק מהתגובה הוסרה מתערובת האמן בכל נקודת זמן. עמילואיד-induced כריכת הקרינה נמדדה 26 אז. במקרה השני, עם צבעי מצב, צבירת טאו מתבצעת בנוכחות tht או THS, טיוח זה סוג של תגובה מתאימה להערכה אוטומטית בזמן אמת של הצמיחה של מצרפי טאו. לכל אחת מהשיטות הללו יתרונות והחסרונות שלה. תגובת מס...

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחד מאוסף גדול של הפרעות ניווניות הידועות כtauopathies. Tauopathy פתולוגיה שבבסיס המובהק הוא סבכי neurofibrillary, NFTS, בתאי עצב, האסטרוציטים ומיקרוגליה 1-4. צפיפות NFT האזור בקורלציה עם ליקוי קוגנטיבי 3.5 ונוירון הפסד 6. NFT האזור מכיל חלבון בעיקר hyperphosphorylated טאו (המכונה &quot;p-טאו&quot; מעתה ואילך) שיוצר חוטים ישרים או לזווג סליל (PHF) 7,8. טאו הוא חלבון הקשורים microtubule חשב כדי להקל על תחבורת axonal שהיא חיוני לאיתות וסחר 9,10 עצביות. כל מולקולת טאו מכילה 2 עד 3 פוספטים במוח נורמלי, אבל עליות תוכן phosphoryl על ידי כמה קפלים בחולי tauopathy 11. קינאז מרובים עשוי לתרום לhyperphosphorylation טאו כולל GSK3β (3β kinase synthase גליקוגן) וCDK5 (cyclin-dekinase התליון 5) 12,13, אבל ההדק הישיר לזירחון פתולוגי נשאר 14 חמקמקים. זירחון החריג בתוך או ליד המוטיבים מחייב microtubule dissociates טאו מmicrotubule 15, וגורם לטאו אי-לוקליזציה לתא somatodendritic, שבו p-טאו oligomerizes לחוטי סליל ישרים או לזווג שיכול בסופו פלמר לתכלילים NFT אזור. הקשר ההדוק בין hyperphosphorylation טאו, היווצרות NFT אזור, וניוון של מערכת עצבים הוביל להשערה הרווחת כי סבכי p-טאו לעורר תגובה ציטוטוקסיות אפופטוטיים ואחרת, ובכך הוא הגורם הבסיסי לניוון של מערכת עצבי tauopathy 16,17. מסכי סמים ובדיקות קליניות מוקדמות המבוססים על הנחה זו כבר הושקו 18. עם זאת, השערה זו עומדת בפני אתגרים 19,20. לדוגמא, Santacruz et al. הראה כי תפקודים קוגניטיביים של עכברים הטרנסגניים ניתן לשפר על ידי דיכוי הביטוי של מוטציהטאו האנושי, למרות שNFTS המשיך ליצור ממולקולות טאו קיימות 21. במודל דרוזופילה, NFT אזור הוצגו לעקל טאו cytosolic הרעיל כדי להגן על תאי עצב שבבסיס 22,23. ברור, את התפקיד בפתוגנזה של NFT אזור, אם בכלל, ישפיע באופן משמעותי את הכיוון של פיתוח תרופות tauopathy. בריכוזים גבוהים, חלבון tau המוח רקומביננטי או נורמלי באופן ספונטני אבל לאט לאט polymerizes למבנה כמו PHF-במבחנה, כפי שצוין על ידי הקשירה של כמה צבעי β גיליון העדיפו ניאון, במיקרוסקופ אלקטרונים, וספקטרוסקופיה פיזור אור 24-27. הפרין הוספה או חומצה הארכידונית, חומצת שומן בשפע במוח אנושי, באופן דרסטי מאיצה היווצרות PHF בisoform- טאו ונימוסי ריכוז תלוי inducer 28-32. מעניין לציין, שטאו hyperphosphorylated מטוהר ממוח לספירה או שהוכן על ידי ממצה בתגובות זירחון מבחנהggregates מהיר ויעיל יותר 26,33-35. תוצאות אלו הן בהסכם מצוין עם התפקידים פתולוגית של p-טאו. מערכת במבחנה המבוססת על הצבירה של p-טאו ניתן אפוא לשמש ככלי רב עוצמה להקרנת סמים לספירה. לאור קשר ההדוק בין צבירת טאו והניוון של מערכת העצבים ההדרגתית של הספירה, כמו גם הכישלון האחרון בפיתוח תרופות מיקוד פלאק Aβ, עוד סמן היסטולוגית מפתח של הספירה 36-38, העניין בגילוי תרופות השולטות צבירת טאו עולה. ואכן, כמה קבוצות כבר החלו מסכי סמים בתפוקה שונה, תוך שימוש בתגובות צבירת טאו מבחנה, כמו assay העיקרי. מספר הכימיקלים נמצא להציג פעילויות מעכבות או היפוך על הצטברות טאו במבחנה 39-42. עם זאת, כל מסכים רגולטור צבירת טאו טאו הנוכחי להשתמש ללא שינוי שמחטיא את מטרת פתולוגי המפתח של זרחןylation, העלאת דאגה לייחודו ויעילותו של שימוש בתרכובות אלו בטיפול לספירה. אחד המכשולים העיקריים של פיתוח מבחני קיבוץ לאפיון ביוכימי והקרנת הסמים AD הוא הייצור של כמויות מספיקות של חלבון טאו hyperphosphorylated הרלוונטי pathophysiologically. שימוש במערכת קטליזה-Assisted הרוכסנים שבי איזופורם 1N4R של טאו וkinase GSK-3β הם שיתוף לידי ביטוי בE. coli כחלבוני היתוך רוכסן לאוצין, יש לנו להתגבר על האתגר הזה (. סוי et al, הוגש; ראה איור 1 עבור המוצרים הסופיים של טאו וp-טאו; ראה גם 43 לאפיון ספקטרומטריית מסה ראשוני של p-טאו). מהרכב של תשעה נוגדנים ספציפיים לאתרי זירחון שונים של טאו, אותות חיוביים נראו בשמונה עמדות (מידע לא מוצג). בהמשך, אנו מתארים פרוטוקולים וinstrumentations שיכול להבדיל ד הקינטית הצבירהifferences בין טאו ללא שינוי ומיני p-טאו. מבחני אלה שונה מפרוטוקולים שפורסמו שנמדדו העלייה של הקרינה של thioflavin T (THT) או thioflavin S (THS) על עמילואיד (מצרפי טאו) מחייב 26. ב&quot; המסוף &quot;הראשון, גישה לא-צבע, תגובות צבירה הם התאספו וטופחו בהעדר צבע עמילואיד. בנקודות זמן שונות, aliquot של כל תגובה מוסרת ומעורבב עם נפח שווה של חיץ tht המכיל לעצור צבירה ולאפשר tht להיקשר אגרגטים טאו. הקרינה נמדדת על ידי fluorometer IAP FluoroMax-2. במקרה השני &quot;עם צבעים&quot; assay מעקב הרציף, THT או THS כלול בתגובות הצבירה. הקרינה ניתן למדוד באופן רציף לאורך כל הניסוי באופן ידני או באמצעות קורא רב-צלחת. בנוסף, אנו מתארים assay המשתמש בריכוז ליד-פיסיולוגי של טאו וp-טאו לקיבוץ במו המדידה המתמשךדה. ההשפעה של זירחון נשארה לזיהוי בקלות. להלן, נתאר נהלי פעולת צעד-אחר-צעד, ולהראות תוצאות נציג של מבחני אלה. דיון בכמה מהיתרונות והחסרונות של כל גישה, כמו גם יישומי הקרנת סמים פוטנציאליים יבוא בעקבותיו. בריכוז גבוה, טאו אגרגטים למבנים דמויים-עמילואיד באופן ספונטני. עם זאת, במעבדה, fibrillization טאו מואץ בדרך כלל על ידי מעוררים כגון הפרין (משקל מולקולרי ממוצע, 6,000 g / mol) וחומצה הארכידונית. דוגמאות שמוצגים במסמך זה כוללים 30 מיקרומטר הפרין. ההיווצרות של אגרגטים עמילואיד טאו מנוטרת על ידי הקרינה הנובעת מעמילואיד הכריכה בthioflavin T (THT) או thioflavin S (THS). על כריכה למצרפי טאו, THT מציג משמרת אדומה בקרינה (עירור: 450 nm; פליטת שיא: 485 ננומטר). THS, לעומת זאת, יש פליטה חלשה ב 510 ננומטר (עירור ב 450 ננומטר) לפני עמילואיד מחייב, אבל fluorescenc זהעליות דואר באופן משמעותי בנוכחות של חלבון עמילואיד כגון טאו מצטבר 44. שני הצבעים לעבוד גם באיתור צבירת טאו וp-טאו. בגלל שיא הפליטה החזק ורחב יחסית של tht (ראה איור 2), יש הפחתת% רק 30 ביחידת הקרינה ב 510 ננומטר. לנוחיותכם, אנו משתמשים באותו שילוב של אורכי גל עירור / פליטה (כלומר, 450 nm / 510 ננומטר) כדי לפקח על צבירת טאו בעת שימוש או צבע. צבירת טאו ניתן לעשות זאת בנוכחות או עדר של הצבע, בהתאם למטרה של assay ואת הזמינות של חלבון טאו. שני המצבים של תגובות מוצגים להלן. בנוסף, אנו מדגימים את פעולתם של שני מכשירים שונים - fluorometer יחיד מדגם (ISA-SPEX FluoroMax-2) וקורא רב-צלחת (SpectraMax M2). קוראים צריכים להיות מסוגלים להתאים את הפרוטוקולים הללו כדי להתאים לצרכימים הספציפיים שלהם וזמינות מכשיר.

<table><tbody><tr><td>טריזמה&nbsp; בסיס</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron כימיקלים עדינים</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td> <td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>מאוחסן בחושך</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>מאוחסן בהפרין כהה</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 קורא מיקרולט רב-מצבי</td> התקנים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>עכבר נוגדן חד שבטי נגד טאו</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3494</td><td>מאוחסנת ב-&ndash; 80 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון hyperphosphorylated טאו

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

מחלת אלצהיימר היא אחת מקבוצה גדולה של הפרעות נוירודגנרטיביות הידועות בשם טאואופתיה המתבטאות במשקעים עצביים של חלבון טאו היפר-זרחני בצורה של סבכים נוירו-פיברילריים (NFTs). צפיפות ה-NFT מתאמת היטב עם ליקוי קוגניטיבי ותסמינים ניווניים אחרים, ובכך מניעה את המאמץ לפתח טיפולים מבוססי צבירת טאו. עם זאת, עד כה, מבחני צבירת טאו משתמשים בטאו רקומביננטי או סינתטי נטול סימני זרחון הקשורים לפתולוגיה. כאן אנו מתארים שתי בדיקות המשתמשות בטאו רקומביננטי, היפר-זרחני כנושא. ניתן להגדיל את הבדיקות הללו עבור מסכים בעלי תפוקה גבוהה עבור תרכובות שיכולות לווסת את הקינטיקה או היציבות של אגרגטים טאו היפר-זרחניים. ניתן לגלות טיפולים חדשים למחלת אלצהיימר וטאואופתיות אחרות באמצעות איזופורמים של טאו היפר-זרחניים.

באמצעות טאו רקומביננטי וp-טאו (איור 1), שהקמנו שני פרוטוקולים שונים כדי להשוות קינטיקה של צבירה של טאו וp-טאו, מנצל את פליטת הקרינה החזקה של tht וTHS על מחייב לamyloidal אגרגטים חלבון, טאו כולל וp-טאו (איור 2). עם או בלי צבע הניאון בתגובת הצבירה, אנו נצפו שיפור של צבירת טאו עקבי על ידי hyperphosphorylation (איורים 3-5). גירוי זה אינו תלוי בהפרין (מידע לא מוצג). בoligomerize טיפוסי תגובה, טאו וp-טאו בקצב מהיר בתוך 30 דקות הראשונות ...

חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ההתקדמות של מחלת אלצהיימר.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר ולהשוות את קינטיקת האגרגציה של מיני חלבון tau לא מושפעים ובעלי פוספורילציה גבוהה (hyper phosphorylated). דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור חלבון tau לא מושפע וחלבון tau בעל פוספורילציה גבוהה באמצעות מערכת זרז המסייעת למסרקים (zippers assisted catalyst system). השלב השני הוא הקמת מערכי בדיקת אגרגציה שיהיו מתאימים לכל אחד משני מכשירים שונים.תהליך אגרגציית ה-tau מנוטר באמצעות פלואורסצנציה של שני צבעי thioflavin שונים, thioflavin S ו-thioflavin T. השלב הסופי הוא שרטוט והשוואה של עקומות האגרגציה. בסופו של דבר, השינויים הקינטיים בפלואורסצנציה של thioflavin כתוצאה מהקישור למיני TA מאגרגטים משמשים להדגמת ההגברה של הפיברילציה של tau in vitro התלויה ב-hyperphosphorylation.שלום. ברוכים הבאים למאמר ה-JOV שלנו. בדיקות אגרגציה in vitro באמצעות חלבון tau בעל פוספורילציה גבוהה. שמי מינקו, והניסויים יבוצעו ויודגמו על ידי way.עבור פרוטוקול זה, נדרש באפר אגרגציה טרי יחסית שהוכן במהלך החודש האחרון. ממש לפני השימוש, יש להוסיף DIOThreeEtol בריכוז 1 mM. כמו כן, נדרש תמיסת מלאי (stock solution) מסוננת של Thioflavin T. תמיסות המלאי, שתיהן, ניתנות לאחסון בטמפרטורה של 20°C-, והחלבון מאוחסן בטמפרטורה של 80°C-.העבירו את הדגימה לקרח, ולאחר מכן התאימו את ריכוזה באמצעות בופר אגרגציה לפי הצורך לצורך עקביות. סבבו את הדגימה עם בופר אגרגציה במהירות של 20,800 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כעת העבירו את הסופרננטנט למבחנה אחרת ושמרו אותה על קרח עד למועד הרכבת תגובת האגרגציה.הכינו את תערובת האגרגציה באنبובות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. בהתאם לטבלה, 100 microliters מספיקים לאליקוט אחד של ריאקטנטים. חשבו את הנפח הכולל בהתבסס על מספר התגובות והגדילו אותו ב-10% כדי לפצות על שגיאות פיפטינג.ניתן להחליף את ה-Pepper ב-raonic acid או בבופר אגרגציה במידת הצורך. ערבבו את התגובות באמצעות הפיכה והעבירו אותן ל-37 °C ללא אוורור. בכל 24 שעות, הוסיפו לתגובות תוספת של 1 mM DTT כדי להבטיח סביבה מחזרת למדידת פלואורסצנציה.חממו את הפלואורימטר של Spectra למשך כ-10 דקות. פעולה זו תשפר את עקביות המדידות בתוכנת המחשב. בחרו במצב תצוגה בזמן אמת (real-time display mode) הנמצא במרכז הבקרה של המכשיר.הגדירו את אורך גל העירור ל-450 nanometers עם מפתח סליט של שני nanometers, והגדירו את אורך גל הפליטה ל-510 nanometers עם מפתח סליט של חמישה nanometers. לאחר מכן, חזרו למרכז הבקרה של המכשיר ובחרו בניתוח אורך גל קבוע (constant wavelength analysis). לחצו על מקש ההוספה (add) במסגרת העליונה כדי להוסיף קבוצת אורכי גל.הגדירו את פרמטרי הרכישה של השגיאה הסטנדרטית לאחד ואת מספר הניסיונות המקסימלי לשלושה. לאחר מכן לחצו על add. כעת לחצו על go כדי לפתוח את חלון תצוגת הנתונים.כעת, בחלון תצוגת הנתונים, לחצו על start act כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח לדגימה חדשה ובחרו ב-unknown עבור סוג הדגימה. לאחר מכן, הכינו את התגובות על ידי העברת 100 µL של תמיסת aggregation buffer ו-2 µL של 3 mM של flavin S או T. בצעו פיפטינג של התערובת מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב טוב.העבר את כל 200 microliters של תערובת אחת ל-FA three qve והכנס אותה למקומה. לאחר מכן לחץ על run כדי לאסוף את נתוני הפלואורסצנציה. לאחר הוצאת התמיסה מה-vete, שטוף אותה שלוש פעמים במים מזוקקים וייבש אותה בזרם אוויר. בדיקה זו כוללת את הצבע הפלואורסצנטי בתגובת ה-aion, מה שמאפשר מדידות רציפות, ומומלץ לבצעה באמצעות קורא לוחיות ריבוי בארות אוטומטי.גם פרמטר רגיל עובד, אך הוא מוגבל על ידי מהירות התפעול הידני. הכינו את תערובת האגרגציה בצלחת שחורה אטומה בעלת 96 בארות. בנפח בארה של 360 µL, כמות של 200 µL מספיקה עבור מדידה בכל נקודת זמן.ערבבו היטב כל תגובה באמצעות פיפוט. דגרו את פלטת 96 הבארות בטמפרטורה של 37 °C ובכל 24 שעות הוסיפו 1 mM נוסף של DTT כדי להבטיח סביבה מחזרת בכל נקודת זמן. לצורך מדידה, הפעילו את קורא המיקרופלטה הרב-מצבי ואת המחשב לפחות 10 דקות מראש בתוכנת המחשב.הגדירו את הטמפרטורה ל-37 °C ובחרו במצב עוצמת פלואורסצנציה. לאחר מכן, הגדירו את אורך גל העירור ל-450 nm ואת אורך גל הפליטה ל-510 nm. הכניסו את פלטת 96 הבארות למגירה ולחצו על מקש הקריאה.לאחר ביצוע המדידות, החזירו מיד את הפלטה לאינקובטור לפני ניתוח הנתונים; ניתן לבצע את הבדיקה במצב רציף באמצעות ספקטרופוטומטר קומפקטי. הכינו את תערובת האגרגציה במבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter. תגובות של 200 microliter מספיקות למדידת נקודת זמן.הפוך את המבחנות כדי לערבב. הגדר את התגובות בטמפרטורה של 37 °C או בטמפרטורת החדר, והוסף תוספת של 1 mM DTT בכל 24 שעות לצורך ביצוע המדידות. הגדר את הערומטר ואת התוכנה כפי שבוצע בבדיקת ה-no die terminal assay.העבירו את התערובת כולה ל-vet והניחו אותה במחזיק הדגימות בתא הדגימות וסגרו את המכסה. לחצו על run כדי לאסוף את נתוני הפלואורסצנציה במרווחי הזמן המתאימים. אם מרווח זה קצר, למשל 30 או 60 שניות, ניתן להשאיר את ה-Q vet במכשיר בין המדידות עד להגעה לנקודת הזמן האחרונה.החזירו את התגובה מה-vete לשפופרת הדגימה והחזירו את השפופרת לאינקובטור עם סיום הפעולה. נקו את ה-vete כפי שהודרך קודם לכן באמצעות tau רקומביננטי ו-p tal. שני פרוטוקולים שונים נקבעו כדי להשוות את קינטיקת האגרגציה של tau ו-p tal, תוך ניצול הפליטה הפלואורסצנטית החזקה של flavin t ו-s בעת קישור למקבצי חלבוני עמילואיד, כולל tau ו-p tal, עם או בלי הצבע הפלואורסצנטי.בתגובת האגרגציה, נצפתה הגברה עקבית של אגרגציית tau על ידי היפר-פוספורילציה. בדרך כלל, T ו-p tal liga עולים במהירות ב-30 הדקות הראשונות לפני האטה משמעותית, כולל those of flavin. T בתגובות האגרגציה גורם לעיכוב משמעותי בקצב האגרגציה.הן ה-Theof Flavian s וה-t הגיעו למישור (plateau) לאחר תגובה של 160 דקות. לעומת זאת, Bio flavin s לא גרם להאטה ניכרת של האגרגציה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש במבדק כדי לבחון איזופורמים נוספים של מערכת העצבים המרכזית או חלבונים אחרים הנוטים לאגרגציה בתהליכי ניוון עצבי, כגון likein, וזאת במטרה להבין את תרומת ה-protein ization לפתוגנזה לאחר פיתוחו.טכניקה זו להכנת חלבון PA היפר-פוספט מהחלק העליון מהווה דרך למחקר בתחום זה, למספר מחלות כדי לבחון את הטיפולים הפוטנציאליים ואת פיתוח התרופות.

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מדגים בדיקת ציטומטריית זרימה של זרימת תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי לזהות את פעילות הזריעה של אגרגטים חלבוניים שבודדו מדגימות ביולוגיות. תאי יונקים המבטאים חלבוני טאו ריפורטר מודגרים בקומפלקסים של התמרה ליפוזומלית המכילים זרעי טאו. זרעים אלה מתווכים את הצבירה של חלבוני הכתב, מה שמוביל ליצירת אות חיובי FRET בציטומטר הזרימה.

טכניקת ציטומטריה של זרימת FRET לזיהוי צבירת חלבוני כתב המושרה על ידי זרעי טאו

סרטון זה מציג בדיקה מבוססת תאים המכמתת את ספיגת טאו על ידי מיקרוגליה מורין באמצעות אגרגטים טאו רגישים ל-pH המסומנים בפלואורסצנטיים, המנותחים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות לצורך הערכה כמותית.

בדיקה מבוססת תאים להערכת ספיגת חלבון טאו על ידי מיקרוגליה

סרטון זה מדגים הערכה חוץ גופית של קריסת חרוט גדילה עצבי על ידי צברי עמילואיד-β (Aβ). טיפול בנוירונים עם אגרגטים Aβ גורם לערעור יציבות השלד הציטו-שלד, מה שמוביל לקריסת מדוכי צמיחה בקצה האקסונים. התאים המטופלים מושווים לתאי ביקורת כדי להעריך את מידת קריסת חרוט הגדילה.

הערכה חוץ גופית של β עמילואיד מצטבר על קריסת חרוט גדילה עצבי

סרטון זה מדגים את תהליך התמרת תאי עצב אנושיים עם נגיף לנטי המקודד חלבון טאו אנושי מוטנטי המתויג בחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לחקור צבירת חלבונים. הוא מתאר את השלבים מכניסה ויראלית לביטוי טאו מוטנטי, ומגיע לשיאו בהיווצרות אגרגטים ציטופלזמיים גלויים בתאי העצב.

התמרה מתווכת לנטיוויראלית של נוירונים אנושיים לניתוח צבירת חלבון טאו

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

וזמינותו צבירת טאו תיאר כתב יד זה מחקה את התכונות הצפויה של ויוו misfolding טאו צבירה.

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

כאן נתאר וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

למדו איך לנטר את קינטיקת הצבירה של חלבון טאו מופוספורל-יתר לעומת טאו לא מעובד במבחנה. השיטה משתמשת בצביעת תיופלאבין ומסייעת לחוקרים להבין את מנגנוני מחלת אלצהיימר.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

גלה סרטונים נוספים