Name: Aip1p Dynamics שונה על ידי מוטצית R256H ביקטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: חקור את הדינמיקה של Aip1p בשמרים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה TIRF. השיטה מדגימה כיצד מוטציות באקטין משפיעות על תנועת חלבוני הקישור לציטוסקלטון ומאפשרת ניתוח מהירות התנועה בין זנים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לפיטר רובינשטיין לדיון מועיל וייעוץ טכני ודוד Pellman לשיבוט PB1996 המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמצעד הפרוטות ומימון מהרכיבה לילדים.

1. שיבוט לפלסמיד PB1996 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים DNA עיצוב והזמנה מחברת oligonucleotide הייצור כי האגף רצף היעד ומכיל אתרי הגבלה ייחודיים בפלסמיד ההורה שנבחר. הערה: במקרה זה, פריימרים נועדו להגביר את זוגות הבסיסים 400 בסוף &quot;5 של רצף Aip1. אתר הגבלת XhoI שולב בפריימר על 20 נ&quot;ב לפני רצף Aip1, וXmaI נכלל כ -20 נ&quot;ב לאחר רצף Aip1 היעד. פלסמיד המשמש לשיבוט היה PB1996, המכיל תג 3XGFP לקרינה, גן URA לבחירת זן שמרים, וגן התנגדות אמפיצילין לבחירה בקטריאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הדנ&quot;א הגנומי מזן הפלואידים Ura-שמרים. הערה: עיין באיור 1 לתרשים של תהליך השיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובת PCR סטנדרטית באמצעות שני פריימרים והדנ&quot;א הגנומי שמרים כדי להגביר את גן Aip1p עם אתרי ההגבלה משני enד. לעכל את המוצר ה-PCR ופלסמיד PB1996 עם אנזימי ההגבלה בתגובות נפרדות לכל יצרן מומלץ פרוטוקולים. במקרה זה XmaI וXhoI שימשו עם החיץ הנלווה ב-C ° 37 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 0.8% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי להפריד את שברי DNA מתעכלים. באחד היטב, טען סולם המוני DNA נמוך, ובבארות נפרדות, טען את כל התגובה ממערכת עיכול. הרץ את הג&#39;ל על 100 וולט כ 1 שעות, עד שחזית הצבע קרובה לסוף של הג&#39;ל. דמיין את הג&#39;ל תחת אור UV ולטהר את הקטע שמתאים למגזר חלבונים ואת הפלסמיד החתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור מגזר Aip1 מתעכל ופלסמיד PB1996. להפוך את המוצר לתאי DH5α באמצעות פרוטוקולי יצרן (10 DNA μl עם 100 תאי μl ל30 דקות על קרח, הלם חום על 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לגדול בתקשורת SOC לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס) וצלחת על גבי צלחות תרבות הכולל אנטיביוטיקה לבחירה, במקרה זה LB +צלחות מגבר. בחר ולגדול מושבה אחת בתרבות נוזלית. לטהר את הפלסמיד החדש תוכנן. </li></ol> 2. דור הזנים שמרי Mutant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזן שמרי הפלואידים בי אלל אקטין נמחק לבנות זן שמרים שעבר מוטציה. הערה: במקרה זה, את המתח ההורי היה מתנה נדיבה של ד&quot;ר פיטר רובינשטיין (אוניברסיטת איווה) והבנייה תוארה על ידי קוק ואח&#39; 20 זן זה חסר את הגן אקטין כרומוזומליות ומכיל פלסמיד שמקודד שמרי סוג בר. אקטין ואורציל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשמרים אקטין הסוג בר קידוד פלסמיד PRS עם TRP + בחירה כבסיס לפלסמיד mutagenesis 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מכוון mutagenesis אתר על פלסמיד PRS להנדס את המוטציה missense ליקטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למוטצית R256H ביקטין, להפיק את פריימר 5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39; כדי לשנות את Arg 256 256. הפעל mutagenesis סטנדרטיתגובת PCR עם פלסמיד משלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד אקטין מוטציה מPCR לתאי DH5α. לבודד את ה-DNA פלסמיד ולרצף את הגן אקטין כדי לאמת את המוטציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את קידוד פלסמיד שמרים אקטין מוטציה לתוך זן שמרים הפלואידים משלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים הפכו בTRP-צלחות כדי לבחור עבור שמרים המכילים TRP המכיל פלסמיד שמרים אקטין מוטציה +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לתאים חסרי פלסמיד המקורי המקודד אקטין סוג בר ואורציל (מתואר ב2.1) על ידי תאים תת culturing מTRP-הצלחות על צלחות המכילות 5-Fluoroorotic חומצה (5-פואה). 5-פואה מומרת לצורה רעילה, 5-flurouracil, בעצירת זנים המבטאים את גן URA3 הפונקציונלי. התאים שגדלים לאחר הבחירה בשלבים יכילו רק את הפלסמיד אקטין מוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד מזן השמרים החדש. רצף פלסמיד כדי להבטיח את הגן אקטין מוטציה הוא הווה. השתמש בזה זהלהתאמן במחקרים נוספים. תהליך זה נתח באיור 2. </li></ol> 3. הפיכת פלסמיד לתוך תאי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הפלסמיד Aip1p-GFP עם אנזים הגבלה כדי לאפשר השתלבות בשמרי כרומוזום. הערה: אתר ההגבלה חייב להיות מחוץ לגוש הרצף המכיל את תג הניאון, גן של עניין, וסמן בחירה. במקרה זה, להשתמש 1 μl של אנזים הגבלת HPAI עם 8-DNA μl וμl 1 של החיץ 10x הנלווה עבור שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ס תאי cerevisiae (משלב 2.5) שאינם מסוגלים לסנתז אורציל (Ura-מתח) לילה ב 5 מיליליטר בתקשורת YPD (1% תמצית שמרים, peptone 2%, ודקסטרוז 2%) על גלגל ב30 ° C. ספין למטה 1 מיליליטר של התאים 5 דקות ב1,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תערובת PLATE. הפוך 10XTE ידי הוספת 5 מיליליטר של 1 M טריס pH 7.5 ו -2 מיליליטר של 250 מ&quot;מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל43 מיליליטר של DDH 2 O. הוסף 0.204 גרם של ליתיום אצטט 20 מיליליטר של 1XTE, אז 8 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG) (MW ~ 3,300) ולסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant מהתאים סובבים מטה בשלב 3.2 ו resuspend התאים בנוזל שנותר. לתאים מושעים, להוסיף 2 μl של 10 מ&quot;ג / DNA ספק אשכים סלמון מיליליטר. הוסף 10 μl של פלסמיד דנ&quot;א מתעכל משלב 3.1 ומערבולת. הוסף 0.5 מיליליטר של צלחת ומערבולת. הוסף 20 μl של 1 M DTT ומערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת ל6-8 שעות ב25 ° C. Heat Shock התאים באמבט מים ב42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. של תאים מהחלק התחתון של צינור microcentrifuge שבו הם התיישבו מתוך גבי-Ura צלחת הצלחת 100 μl. דגירה ב30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים או עד טופס מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבות ופס בודדים החוצה אל-Ura צלחת. הערה: תאים אלו מכילים את הפלסמיד עם גן Aip1-GFP ועורה ישולב בכרומוזום, המאפשרים צמיחה. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש בmicroscopy. </li></ol> 4. לדמיין את תנועת חלבון Aip1p באמצעות השתקפות סה&quot;כ הפנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של תאי שמרים עם Aip1p-GFP התאגד בYPD לילה על גלגל ב30 ° C. תת 1 מיליליטר של תרבות הלילה ל9 מיליליטר של-Ura תקשורת. לגדל את התאים ל3-4 שעות נוספות על שייקר ב30 ° C כדי לוודא שהם נמצאים בשלב צמיחת יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של תאים לשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולהוסיף coverslip. אפשר התאים להסתפק בשקופית למשך 5 דקות. מניחים את השקף בסוגר של צלחת הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לחלבון Aip1p-GFP עם הקרינה כוללת פנימית השתקפות מיקרוסקופ (TIRF) (488 ננומטר) באמצעות טבילת שמן 100X TIRF אובייקטיבית ומצלמת CCD דיגיטלית. באמצעות תוכנת SlideBook 5.0, להשיג תמונות ל20 שניות בקצב של 5 פריימים / שנייה (מסגרות בודדות של תמונות שנרכשו מוצגות באיור 2 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בגאמות, תוכנת SlideBook 5.0 פתוחה ולחצו על לחצן פוקוס החלון בסרגל הכלים כדי לגשת לפקדי המיקוד. בחר בכרטיסייה היקף ובחר את מטרת 100X-TIRF. כבה את המנורה ובהחלק את סרגל המנורה 15%. לשנות את הגדרת סל ל2 x 2. שינוי מסנן לשדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקרוסקופ, להשתמש בחיוג להתמקד בסדר להביא את התאים אל מוקד כפי שניתן לראות על מסך המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפקדים בתוך חלון הפוקוס, להפוך את המנורה כבויה, לשנות את המסנן לחיות, ולחץ על לחצן TIRFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורת ה TIRFM המחובר לצד הנמל הנכון של המיקרוסקופ, להפוך את פליטת הלייזר לאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה הזרם בתוך חלון הפוקוס, סמן את התיבה הבאה כדי להתחיל בהקלטה ולאחר מכן לחץ על לחצן שדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורת ה TIRFM, להפוך מיקרומטר כדי להתאים את זווית האירוע של הלייזר. זה משמש כדי לייעל את פליטת הקרינה ממוקדי Aip1-GFP ולמזער את הקרינה רקע מתאים ושקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התמונה הרצויה מוצגת, לחץ על &#39;התחל&#39;. אחרי 20 שניות, עצירה לעיתונות. שמור את התמונות. בכרטיסיית הקובץ בשורת התפריט הראשית, בחר שקופיות שמירה ובלהזין את מיקום קובץ ואת השם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ImageJ לנתח את התמונות. השתמש בתוסף מאקרו &quot;Tracker הידני&quot; כדי לעקוב אחר התנועה ושיעור מוקדי Aip1p ניאון. שנה את פרמטר מרווח הזמן ל0.2 שניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בחירת מסלול תוספת, בחר ולעקוב אחר חלבון פלואורסצנטי פרט באמצעות ארבעה עד שמונה מסגרות חיבור. השתמש בפקודת מסלול הסוף ואת מהירות תנועה של חלבון בין כל מסגרת תציג בחלון תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את השיעור הממוצע בין כל מסגרת באמצעות גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel. השתמש בערכים כדי לחשב את המהירות של תנועת Aip1p הממוצעת עבור כל זן תא של עניין. הערה: עלילת פיזור של קצב תנועת Aip1p והמהירות שאינו ליניארי הממוצע מוצגת בfiguמחדש 2B. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lehtonen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+a+missense+variant+in+enteric+smooth+muscle+actin+gamma-2+with+autosomal+dominant+familial+visceral+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy.</a> Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).</li>
<li>Matsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cardiac+actin+mutations+produce+atrial+septal+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects.</a> Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gamma-actin+gene+%28ACTG1%29+are+associated+with+dominant+progressive+deafness+%28DFNA20%2F26%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26).</a> Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).</li>
<li>Nowak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+in+patients+with+actin+myopathy+and+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy.</a> Nat Genet. 23, 208-212 (1999).</li>
<li>Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mutations+in+dilated+cardiomyopathy%2C+a+heritable+form+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure.</a> Science. 280, 750-752 (1998).</li>
<li>Riviere, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+the+actin+genes+ACTB+and+ACTG1+cause+Baraitser-Winter+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome.</a> Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).</li>
<li>Guo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+smooth+muscle+alpha-actin+%28ACTA2%29+lead+to+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).</li>
<li>Sparrow, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+disease+caused+by+mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+%28ACTA1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1).</a> Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).</li>
<li>Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+deafness-causing+%28DFNA20%2F26%29+actin+mutations+affect+Arp2%2F3-dependent+actin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation.</a> J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).</li>
<li>Amberg, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+yeast+actin+cytoskeleton+through+the+budding+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).</li>
<li>Pelham, R. J., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+polymerization+and+actin+cables+in+actin-patch+movement+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).</li>
<li>Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+mechanism+of+the+contractile+ring+for+cytokinesis+by+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast.</a> Science. 319, 97-100 (2008).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ultrastructure+of+the+septin+filament+network+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).</li>
<li>Senning, E. N., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+mitochondrial+transport+in+mating+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).</li>
<li>Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+actin+assembly+by+in+vitro+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).</li>
<li>Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+bundle+formation+by+the+bacterial+actin+ParM%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM.</a> Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortex+organization+and+dynamics+in+microorganisms%2C+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. (63), e3982(2012).</li>
<li>Manneville, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TIRF+microscopy+to+visualize+actin+and+microtubules+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells.</a> Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).</li>
<li>Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+metabolism+of+the+yeast+actin+amino+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus.</a> J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probing+of+yeast+actin+subdomain+3%2F4+hydrophobic+loop+262-274.+Actin-actin+and+actin-myosin+interactions+in+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments.</a> J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).</li>
<li>Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+and+distinct+functions+for+cofilin%2C+coronin+and+Aip1+in+actin+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo.</a> J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).</li>
<li>Malloy, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+Aortic+Aneurysm+%28TAAD%29-causing+Mutation+in+Actin+Affects+Formin+Regulation+of+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization.</a> J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).</li>
<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ion+channel+dynamics+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane.</a> Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).</li>
<li>Bhattacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+vimentin+to+the+cell+surface+by+beta3+integrin+and+plectin+mediates+adhesion+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength.</a> J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).</li>
<li>Hetheridge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+FMNL3+is+a+cytoskeletal+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis.</a> J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).</li>
<li>Bergeron, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+effects+of+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection+alpha-smooth+muscle+actin+mutations+on+actin+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function.</a> J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אסטרטגיה יעילה כדי להמחיש את הדינמיקה של שלד התא והשירות בחקירות על מוטציות פתוגניים שתוארה כאן. שיטות הדמיה מתקדמות יצרו הזדמנויות חדשות כדי להבין את התנועה תאית של חלבונים ליד קרום התא. מיקרוסקופיה סך הקרינה השתקפות הפנימית (TIRF) היא טכניקה רגישה ללימודים תפקודיים בתאים חיים. TIRF משתמש בליזר עירור זווית שיוצר שדה חלוף בשל ההבדל במדדי שבירה של coverslip והבינוני מימיים. האנרגיה של שדה חלוף מרגשת fluorophores אבל יורדת באופן אקספוננציאלי עם המרחק של הממשק בין coverslip והמים. הת...

אקטין הוא החלבון הדומיננטי המרכיב את שלד התא, ומשתתף בתהליכים תאיים קריטיים, כולל חלוקת תא, תנועת אברון, תנועתיות תא, התכווצות, ואיתות. במהלך העשור האחרון, מוטציות הגורמות למחלות בתקטנה התגלו בכל אחד מששת isoforms אקטין האדם המוביל למגוון של הפרעות, מmyopathies למחלת לב כלילית 1-7. התהליכים שבאמצעותם מוטציות אקטין להוביל למחלות ימשיכו להיות הובהר. שמרי המודל נשאר סטנדרטי כדי לחקור את ההשפעות ביוכימיות של מוטציות על תפקוד אקטין בשל היתרונות של איזופורם אחת החיוני אקטין, עקיבות גנטיות וגבוה שימור רצף אקטין ותפקוד זהב. מחקרים מראים כי מוטציות אקטין פרט להוביל לתפקוד ספציפי מולקולרי עם השפעות שליליות דומיננטיות 8. לדוגמא, מוטציות הגורמות לחירשות ביקטין γ הלא שרירים המשפיעות על השאריות ליס-118 לשנות רגולציה על ידיהחלבון אקטין מחייב Arp2 / 3 9. מחקרים לעתים קרובות להעסיק במבחנה ניתוחים של חלבון: אינטראקציות חלבון. חקירות ההשפעה יקטין מוטציות בביולוגיה של תא, ובפרט, יקטין לוקליזציה חלבון מחייבת בתא מוגבלות. מחקרים של שלד תא שמרי in vivo מסתמכים כמקובל בתמונות של תאים קבועים ממיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך 10. ניסויים אלה סיפקו נתונים בסיסיים על המורפולוגיה של שלד התא אקטין. חקירות שכן שולבו שלוש הדמיה confocal ממדים כדי להמחיש את הרשת המורכבת cytoskeletal 11, 12. הדמיה זו מאפשרת כימות של השפע ומיקום יחסי של תיקונים אקטין וחוטים. טומוגרפיה אלקטרון סעיף דקה שמשה לתמונה את המורפולוגיה של רשתות פילמנטיות הצפופים ביחס למבני subcellular השתמרו 13. ים סלולארי צפוףצעדים עם חתך קטן יכולים להיבחן בפרטים עדינים עם טכניקה זו. מחקרי הדמיה שהורחבו לתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. כאשר ניתן להקהות הלבנת צילום וקרינת רקע, זמן לשגות הדמיה מאפשרת חקירה באשר לדינמיקה של חלבוני cytoskeletal והתגובה לתנאים סביבתיים 11, 14. בנפרד, להדמיה של הדינמיקה של סיבי אקטין במבחנה הייתה מתקדמת על ידי ההקדמה של הקרינה השתקפות הפנימית המוחלטת מיקרוסקופיה (TIRF). בהשוואה למיקרוסקופ שדה רחב, יש TIRF היתרון של הקרינה רקע ירידה ולעומת זאת משופר לפקח חוטים בודדים 15, 16. עם התכונות האלה, מיקרוסקופיה TIRF הותאמה על ידי ביולוגים תא כדי לפקח על מבנים הסלולר בקרום הפלזמה 17, 18. אירועים הסלולר, לרבות שינויים בשלד התא, יכוללהיות דמיינו בזמן אמת עם phototoxicity הנמוך, לעומת זאת מקסימאלי, ותפרחת רקע מינימאלית 19. כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של מוטציות אקטין בתנועה, לוקליזציה, ומחזור של חלבוני cytoskeletal בתיוג תא, מיקרוסקופיה TIRF והחלבון היו בשימוש. בזאת, שיטות כדי לחקור את ההשפעות של מוטציה רלוונטית קליני ביקטינו על דינמיקת cytoskeletal בשמר אפייה מתוארות. באופן ספציפי, הלוקליזציה והתנועה של החלבון קושר אקטין, Aip1p, הייתה דמיינו ולכמת בתאים המבטאים את המוטציה R256H ביקטין. טכניקות אלה משלימים במחקרים ביוכימיים מבחנה ולאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות חלבון ופונקציות.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>אמרסקו</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT אתר מוטציות מרובות מכוון ערכת מוטגנזה</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, יחיד גדיל מאשכי</td> <td>סלמוןSigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>אזהרה! גירוי מזיק</td></tr><tr><td>ערכת DNA פטרייתי/חיידקי</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>סולם מסת DNA נמוך</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה PCR SuperMix נאמנות גבוהה</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>כל ערכה תעבוד</td></tr><tr><td>ערכת קשירה מהירה</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>אשף SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>1/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD media</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>Media</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR מכונת</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>כל מכונת PCR תעבוד</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ TIRF</td><td>אולימפוס IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת ORCA-R מצלמה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p dynamics שונה על ידי מוטצית r256h ביקטין

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

מוטציות בתקטנה לגרום למגוון של מחלות בבני אדם כתוצאה משינויים מולקולריים ספציפיים, כי לעתים קרובות לשנות את תפקוד cytoskeletal. במחקר זה, הדמיה של חלבונים מתויגים fluorescently באמצעות הקרינה כוללת פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה משמשת כדי לחזות ולכמת את השינויים בדינמיקת cytoskeletal. מיקרוסקופיה TIRF והשימוש בתגי ניאון גם מאפשר כימות של השינויים בדינמיקת cytoskeletal נגרמים על ידי מוטציות בתקטנה. באמצעות טכניקה זו, כימות של פונקצית cytoskeletal בתאים חיים באופן מועיל משלימה במחקרי מבחנה של תפקוד חלבון. כדוגמא, מוטציות missense משפיעות על השאריות אקטין R256 זוהו בשלושה isoforms אקטין אדם המצביע על חומצה אמינית זו משחקת תפקיד חשוב באינטראקציות רגולציה. ההשפעות של המוטציה R256H אקטין בתנועות cytoskeletal נחקרו תוך שימוש בשמרי המודל. החלבון, Aip1, אשר ידוע לסייע cofilin בdepolymerization אקטין, היהמתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בN-הסופית ומעקב in vivo באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. קצב תנועת Aip1p סוג שני בר וזנים מוטנטים היה לכמת. בתאים המבטאים אקטין מוטציה R256H, תנועת Aip1p מוגבלת וקצב תנועה הוא כמעט מחצית מהמהירות שנמדדה בתאים מסוג בר (0.88 ± 0.30 מיקרומטר / sec בתאי R256H לעומת 1.60 ± 0.42 מיקרומטר / sec בתאים מסוג בר, עמ &#39; &lt;0.005).

שיטה לתמונת הדינמיקה של חלבוני cytoskeletal בתא מוצגת. החלבון אקטין מחייב, Aip1p, היה מתויג עם GFP. העיצוב לפלסמיד קידוד המוצר המתויג מוצג באיור 1. פלסמיד שהפך לאחר מכן לתאי שמרים. ביטוי של מתויג fluorescently Aip1p אפשר להדמיה של חלבון ההתנהגות בתא. Aip1p בדרך כלל localizes לתיקונים אקטין באתרים של אנדוציטוזה 22. כדי לכמת תנועת Aip1p, יותר מ 50 מוקדי Aip1p ניאון היו במעקב בלמעלה מ 10 תאים, כפי שמוצגים באיור 2 א. המהירות הממוצעת חושב לכ...

מוטציות הגורמות למחלות ביקטינו יכולות לשנות את תפקוד cytoskeletal. דינמיקת Cytoskeletal הם לכמת באמצעות הדמיה של חלבונים מתויגים fluorescently באמצעות כולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפנימי. כדוגמא, חלבון cytoskeletal, Aip1p, שינה לוקליזציה ותנועה בתאים המבטאים את איזופורם אקטין המוטציה, R256H.

Aip1p Dynamics שונה על ידי מוטצית R256H ביקטין

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לה可וויזואליזציה של תנועת חלבון הקושר אקטין בשמרים המבטאים איזופורמה מוטגית של אקטין. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת פלסמיד וסימון של החלבון המקיים אינטראקציה עם אקטין, אחד או IP one P gene, באמצעות תג של three x green fluorescent protein Fluor four. השלב השני הוא יצירת זן שמרים המבטא רק אקטין מסוג wild type או אקטין מוטג.בשלב הבא, פלסמיד A IP one P מתויג ב-GFP מותמר לתוך זן השמרים מסוג הבר (wild type) או לתוך זן מוטנטי. השלב האחרון הוא הדמיה וניתוח של תנועת A IP one P המתויג בתאי שמרים מסוג הבר ובתאי שמרים מוטנטים. לבסוף, שימוש בשיטת השתחלה פנימית כוללת (total internal reflection).מיקרוסקופיית פלואורסצנציה או TIRF משמשת כדי להראות כי A IP one P נע לאט יותר בשמרים המבטאים את מוטציית R 2 56 H של האקטין מאשר באקטין מסוג ברי (wild type). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השלד התאי, כגון התנועות הזמניות היחסיות של שותפי קישור. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גיליתי שבניגוד לשבט מסוג בר, מחיקה של A IP one P משבט השמרים המוטנטי הייתה קטלנית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא הניגודיות המשופרת ומהירות הדימות. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עשויים להתקשות באופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ עבור הניסוי הספציפי שלהם, בשל מספר ההתאמות הרב שניתן לבצע והאופי הסובייקטיבי של איכות התמונה. התחילו פרוטוקול זה ביצירת הפלסמיד A IP one PGFP וזן השמרים המוטנטי כפי שהודרך בפרוטוקול הכתוב, ועזרו את הפלסמיד בעזרת אנזים הגבלה כדי לאפשר אינטגרציה לתוך תרבית כרומוזומי השמרים.את תאי ה-S-C-V-C-A שהוכנו, שאינם מסוגלים לסנתז uracil, מדגירים למשך לילה ב-5 mL של מצע YPD בגלגל בטמפרטורה של 30 °C. סובבים 1 mL מהתאים למשך 5 דקות ב-1000 ×g. לאחר מכן, מכינים את תערובת הפלטה כפי שהודעה בפרוטוקול הכתוב, ומסננים לסטריליזציה, מנstמשים את עליית התאים וממיסים מחדש את התאים בנוזל שנותר לתאי התליה.הוסיפו 2 µL של DNA נשא מביצי סלמון בריכוז 10 mg/mL. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של הפלסמיד שעבר עיכול, DNA, וערבבו ב-vortex לפני הוספת 0.5 mL של פלטה וערבוב חוזר ב-vortex. לבסוף, הוסיפו 20 µL של diethyl pyrocarbonate בריכוז 1 M וערבבו ב-vortex.לאחר דגירה של התערובת למשך שש עד שמונה שעות ב-25 °C, בצעו הלם תרמי לתאים באמבט מים ב-42 °C למשך 10 דקות. העבירו 100 µL של תאים מהחלק התחתון של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה, שם הם שקעו, אל לוח מינוס U.דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים או עד להיווצרות מושבות. בחרו מושבות בודדות והעבירו אותן בריחוב (streak) למצע minus.ATE. להכנה למיקרוסקופיה, תאים אלו מכילים את הפלסמיד עם ה-A IP one GFP ו-UroGen המשולבים בכרומוזום.גדלו תרבית של תאי שמרים הכוללים את ה-A IP one PGFP במצע YPD למשך לילה במערכת סיבוב בטמפרטורה של 30 °C. העבירו 1 mL מהתרבית של הלילה לתוך 9 mL של מצע minus Euro. גדלו את התאים למשך שלוש עד ארבע שעות נוספות במכשיר ניעור בטמפרטורה של 30 °C כדי להבטיח שהם נמצאים בשלב צמיחה לוגריתמי.בשלב הבא, העבירו שלושה מיקרוליטרים של תאים לפסמיקרוסקופ זכוכית והוסיפו כיסוי. המתינו חמש דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע על הפסמיקרוסקופ. לפני הנחת הפסמיקרוסקופ בתושבת של פלטת הבמה, בחנו את חלבון ה-A IP one PGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם הח reflection פנימי כולל (TIRF), תוך שימוש בעדשת TIRF 100x עם טבילת שמן ובמצלמה דיגיטלית מסוג CCD.כדי למקוד את התאים, פתח את תוכנת slide book 5.0 ולחץ על כפתור חלון המיקוד (focus window) בסרגל הכלים. כדי לגשת לבקרת המיקוד, בחר בלשונית המיקרוסקופ (scope) ובחר בעדשה אובייקטיבית 100 x turf. הדלק את המנורה והזז את סרגל עוצמת התאורה ל-15%. שנה את הגדרת ה-bin ל-two by two ושנה את המסנן במיקרוסקופ ל-brightfield.השתמשו בכיול המיקוד העדין כדי להביא את התאים למיקוד כפי שמופיע על מסך המחשב. באמצעות הבקרים בחלון המיקוד, כבו את המנורה, שנו את המסנן למצב live ולחצו על כפתור ה-T-I-R-F-M במאיר ה-T-I-R-F-M המחובר ליציאה הימנית של המיקרוסקופ. העבירו את פליטת הלייזר למצב on ובחרו בלשונית ה-stream בתוך חלון המיקוד.סמנו את התיבה שליד start recording, ולאחר מכן לחצו על כפתור ה-brightfield במאיר ה-TIR FM. סובבו את המיקרומטר כדי להתאים את זווית הפגיעה של הלייזר. פעולה זו משמשת לאופטימיזציה של הפליטה הפלואורסצנטית ממוקדי A IP one GFP ולמינימום של פלואורסצנציית רקע מהתאים ומהשקופית, עד להצגת התמונה הרצויה.לחצו על התחל. רכשו תמונות במשך 20 שניות בקצב של חמישה פריימים לשנייה. לאחר 20 שניות, לחצו על עצור.שמרו את התמונות תחת לשונית הקובץ (file) בשורת התפריט הראשית. בחרו ב-"שמור שקופית כ-" (save Slide as) והזינו את הקובץ, המיקום והשם. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת Image J.כדי לנתח את התמונות, השתמש בתוסף המקרו manual tracker למעקב אחר התנועה והקצב של מוקדי ה-A IP one P הפלואורסצנטיים. שנה את פרמטר מרווח הזמן ל-0.2 שניות. באמצעות בחירת add track, בחר ועקב אחר חלבון פלואורסצנטי בודד לאורך ארבע עד שמונה פריימים רצופים.השתמש בפקודת N track, ומהירות תנועת החלבון בין כל פריים תוצג בחלון התוצאות. קבע את הקצב הממוצע בין כל פריים באמצעות גיליון Microsoft Excel.השתמשו בערכים כדי לחשב את המהירות הממוצעת של תנועת A IP one P, או עבור כל זן תא רלוונטי כדי לכמת את תנועת A IP one P. יותר מ-50 מוקדי A IP one P פלורסצנטיים נערכו במעקב ביותר מ-10 תאים. תוצאות מייצגות של תנועת A IP one P בתאי פרא (wild type) מוצגות כצפוי.החלבון AP1P המסומן פלואורסצנטית נע במהירותת רחבי התא ולאחר מכן נעלם בתאים המבטאים את המוטציה R256H באקטין. ל-AP1P יש פחות תנועה בהשוואה לתאי פרא (wild type). תנועתו של AP1P נמעקבת באמצעות Image J כדי למפות כמותית את תנועת החלבון.A IP one P נע ברחבי התא בזן הפרא, אך נע רק באזור מוגבל. בזן המוטנתי acton, חושבה המהירות הממוצעת עבור כל אזור פלואורסצנטי של A IP one P. בתאי פרא, המהירות הממוצעת של תנועת A IP one P היא 1.60 פלוס או מינוס 0.42 microns per second. תאים המבטאים את מוטציית R 2 56 H באקטין, הידועה כגורמת למורפולוגיה חריגה של שלד האקטין, מראים פנוטיפ משתנה של A IP one P בזן המוטנתי.תנועת A IP one P מוגבלת ואיטית יותר. המהירות הממוצעת של תנועת A IP one P היא 0.88, פלוס או מינוס 0.30 microns per second. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לצלם חלבונים של השלד התאי באמצעות מיקרוסקופיית turf.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע מהתאים להתייבש או לסבול מדהיית צבע פוטוכימית (photo bleaching).

aip1p-dynamics-are-altered-by-the-r256h-mutation-in-actin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

אקטין חוטי (F-actin) ממלא תפקיד חשוב בספינוגנזה, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. כימות של F-actin puncta הוא אפוא כלי שימושי לחקר שלמותם של מבנים סינפטיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים של כימות פונקטה F-actin המסומנת עם Phalloidin בתרביות עצביות קליפת המוח הראשוניות בצפיפות נמוכה.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

חקור את הדינמיקה של Aip1p בשמרים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה TIRF. השיטה מדגימה כיצד מוטציות באקטין משפיעות על תנועת חלבוני הקישור לציטוסקלטון ומאפשרת ניתוח מהירות התנועה בין זנים שונים.

Aip1p Dynamics שונה על ידי מוטצית R256H ביקטין

גלה סרטונים נוספים