Name: כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למד כיצד לכמת חדירות בכלי דם קטנים בריאות עכברוש מבודדות באמצעות שיטת דימות פלואורסצנטית בזמן אמת. השיטה מאפשרת לחקור תגובות כלי דם ריאתיים לגירויים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקרים שנתמכו על ידי NIH HL75503 לתהליך קימברלי.

כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טנסי למדעי בריאות במרכז. 1. Tubing תכשירים מרוססים עכברוש ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת צינורות עם צינורות Tygon (# 18) לזלוף דם כפי שמוצג באיור 1. חבר מתמרים ללחץ (P23XL) ולמקם את צינורות על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טמפרטורת אמבט מים עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כניסת הריאות ולשקע באופן זמני עם צינור Tygon. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. צינורות טפטוף דם. סכמטית מציגה את התקנת צינורות המשמשת למחזור הדם דרך הכנת ריאות המבודדת. כמו כן ציינו הם הרכיבים הקשורים שדרכו אני צינורותשל מנותב. סכמטי של הלב והריאות כלול להראות אתרים של חיבור בין צינורות ועורק ריאה (הרשות הפלסטינית), והשאיר את פרוזדורי צינורית (LA) (כחול קווים מקווקווים). 2. הכנת ריאות חולדה מבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות (חולדות זכרים ספראג-Dawley; 250-300 גר &#39;) עם קטמין (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם) ועם xylazine (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם). לאחר שווידאת מטוס של הרדמה כירורגית, מקום חי במצב שכיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ההנשמה, הכנס צינורית לקנה הנשימה (PE-90) ובטוח עם תפר כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הפרין (100-200 U) ללב על ידי לנקב לב (21 מחט פרפר G), לחכות ל60 שניות ודם לגרום לדימום מחודש (~ 12-15 מיליליטר דם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי קנולה (צינור Tygon, בקוטר 3 מ&quot;מ; ארוכה 4 סנטימטר; מתרחבת בקצה אחד) ולמלא עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פתיחת בית החזה. עושה חתך (3 מ&quot;מ) בחדר ממני והחלק את הסוף התלקח של צינורית לתוך החתך לכיוון הריאותעורק. Secure צינורית לעורק ריאה עם תפרים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך (3 מ&quot;מ) את שיאו של החדר השמאלי והחלק את הקצה התלקח של הצינורית השנייה לתוך החתך. להנחות את הצינורית לתוך אטריום השמאל. Secure צינורית לחדר השמאלי עם קלטת טבור (2 מ&quot;מ רוחב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את כל רקמת חיבור, ולהסיר את הריאות ולב, יחד עם קנולה המצורפת. הנח ריאות ולב בצלחת פטרי. למקם מחדש את הריאות, כך שמשטח סרעפתי הוא על העליונה. שלוש קנולה לצריכה להתמודד לאותו כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנת הריאות בשלב שניתן להשפיע בכיווני XY. כל שלב שמגיע עם מיקרוסקופ יכול להיות שונה כדי להחזיק את צינורות או שלב מחוייט שנבנה, במידת הצורך. </li></ol> 3. זלוף הדם של ריאות חולדה מבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את דם exsanguinated עם אלבומין שווה נפח (5%) פתרון ולהוסיף למאגר. הפעל את משאבת peristaltic ולהגדיר זרימת rאכלתי ל14 מיליליטר / דקה. מאפשר לדם למלא את צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המחלף פתוח, להסיר את מחבר כניסה-לשקע ריאות הזמנית. צרף את עורק הריאה וצינורית פרוזדורי שמאל לכניסת הריאות ולשקע, בהתאמה. ודא שאין בועות אוויר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הצינורית לקנה הנשימה למתמר לחץ שלישי (P23XL). לנפח את הריאות בחמצן 30% באמצעות הצינורית לקנה הנשימה ולשמור על לחץ ב5 סנטימטר H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המחלף עם מהדק להתחיל זלוף ריאות. לשמור על עורק ריאה ולחצי פרוזדורי שמאל ב ~ 10 ו3 ס&quot;מ H 2 O, בהתאמה. </li></ol> 4. הכנת ריאות לכלי דם עירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את חלקו האחורי של צינור הארכה לקטטר מעל לרמה של הריאות ומאובטחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צנתר עירוי על ידי הוספה כ 30 סנטימטר של צינורות PE10 ארוכים 40 סנטימטר לתוך צינורות PE90 ~ ארוכים 30 סנטימטר. חבר את הקצה החשוף של צינורות PE10 למחט (30 G) בשעהtached למזרק (1 סמ&quot;ק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שילוב קטטר לתוך חלק אחורי המורם של צינור הארכה. מדריך שילוב הצנתר דרך אטריום השמאל ולתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. ואז, לדחוף את הקטטר PE10 לבד יותר לתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. שים לב שהפעלת כוח מופרז בעת החדרת הצנתר תפגע הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מזרק 1 סמ&quot;ק עם הפתרון של רינגר ולצרף למשאבת מזרק. הגדרת קצב עירוי ל10 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר עירוי יהיה חיוור בהשוואה לשאר הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחלח את הריאות עם מי מלח ולכסות את הריאות בניילון עם חור גדול מספיק כדי לעזוב את אתר העירוי נחשף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית קצת שומן ברזלים על החלק התחתון של O-Ring (מחוייט) ומקום coverslip זכוכית (# 1.5, 22 קוטר מ&quot;מ) בחלק התחתון של טבעת O-. בעדינות עמדת O-הטבעת עם coverslip באתר העירוי. אבטח את O-הטבעת עם חול מבחנה סטנדרטידר. Coverslip / שילוב טבעת O לא לעוות את מבני מכתשיים מתחתיו, כפי שדיווח לאחרונה 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם אובייקטיבי (20X) של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל O-Ring ולהתמקד על פני הריאות. </li></ol> 5. ההדמיה פלורסנט Dextran מעבר דרך microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ לתפרחת FITC ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור להיות צילם ולרכוש תמונות בשיעור של 1/minute באמצעות תוכנת רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל עירוי של 20 KD FITC-dextran (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) באמצעות משאבת המזרק. הקרינה בכלי דם תעלה בהדרגה ולהגיע למקסימום. המשך עירוי ל60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לעבור לעירוי של רינגר כדי לשטוף את הקרינה של אור. לשמור על עירוי במשך 10 דקות. המשך רכישת תמונה ב1/min במהלך לשטוף-off. </li></ol> 6. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ תמונת רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי מקוםשל ריבית על פני microvessels בתוך מסגרת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגן את קובץ תמונת מסגרת לפי מסגרת ולהקליט את עוצמת הקרינה בכל אזור של עניין לכל המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את השינוי בעוצמת הקרינה לכל אזור של עניין כפונקציה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הקרינה המרבית ואת עוצמת הקרינה שיורית לאחר 10 דקות של washoff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את היחס מרבי לעוצמת הקרינה שיורית בכל אזור של עניין כדי לקבל את מדד החדירות לmicrovessels הקשורים לאזור זה של ריבית. </li></ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li>
<li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2%2B-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li>
<li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li>
<li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li>
<li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li>
<li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy%2C+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li>
<li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li>
<li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2%2B-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li>
<li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li>
<li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+1985%22%5BJournal%5D)">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li>
<li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנת הריאות המבודדת-perfused הדם בשילוב עם הדמיה בזמן אמת מספקת כלי פשוט לקביעת שינויים בחדירות microvessels ריאה אחת. אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי להגדיר שינויי חדירות בתגובה לחליטות של LPS. הנתונים שלנו מראים בבירור כי עירוי LPS גרם לעלייה בחדירות כלי הדם. יתר על כן, הנתונים גם מצביעים על כך ששינויי חדירות הנגרמים על ידי LPS היו דומים בשני venules ונימי דם. לכן, יתרון גדול של שיטה זו הוא היכולת להגדיר leakiness של microvessels אחת, כמו גם רשת גלובלית של כלי דם. בהתחשב בכך שטכניקה ז...

חדירות כלי הדם מוגברות לריאות מובילה להתפתחות של בצקת מכתשיים וחילוף גזים שנפרצו והוא מאפיין עיקרי של פגיעה חריפה ריאות (עלי) 1-3. לפיכך, הערכות של חדירות כלי דם חשובות בהגדרת היקף פציעת ריאות ויעילות של התערבויות טיפוליות מוצעים. ניתוח gravimetric כגון יחס דם ריאה בחינם רטוב ליבשים ומקדם סינון כלי הדם נמצא בשימוש נרחב בשיטות להעריך 4,5 חדירות. שיטות אחרות כוללות כימותי השמירה של בדיקות רדיואקטיביים או ניאון ברקמת הריאה 6-8. עם זאת, השיטות הנ&quot;ל דורשות עיבוד postexperiment של דגימות רקמת ריאה לכיוון הבהרת נתוני חדירות. יתר על כן, מאחר שבעל חיים אחד יכול לשמש רק לפרוטוקול טיפול יחיד, ייתכן שיהיו צורך מספרי חיה גדולים למחקר מלא. מאפיין משותף של השיטות הנ&quot;ל הוא שהם קובעים את חדירות כלי דם הממוצעת שלכל כלי הדם בדגימת הרקמה. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי כלי מאקרו מיקרו וריאה שונים 9 phenotypically. לפיכך, תגובות חדירות עשויות להיות הטרוגנית בין המגזרים השונים, כמו גם כלי 9,10. לפיכך, כימות חדירות ממוצעת של כל כלי ריאתי בדגימת רקמה עשוי שלא משקפת באופן נאות את ההטרוגניות הזאת. בהכנת ריאות perfused דם המבודדת, ניתן דמיינו כלי דם על פני השטח הריאה על ידי מיקרוסקופ זקוף 4,11,12. זה מאפשר תגובות אפיון בכלי אחד, ולכן, פונה ההטרוגניות כל בתגובות 13. בנוסף לכך, על ידי ניצול דימות פלואורסצנטי של microvessels, ניתן לשלב מבחני הקרינה מבוססת. יתר על כן, microcatheter פרוזדורי שמאל יכול לשמש כדי לספק סוכנים ובדיקות הקרינה לכלי דם 11,14. Microcatheter מגביל את המשלוח לאזור ריאות קטן, ובכך לשעברפוזות רק את כלי דם באזור לסוכנים וfluorophores רוויי. זה מאפשר אזורים קטנים מרובים בתוך אותה הריאה שישמשו לניסויים נפרדים, מה שמוביל לירידה כוללת בבעלים החיים הנחוצים למחקר. הדמיה בזמן אמת מאפשרת לכידה של שינויים דינמיים בכלי דם וקרינת extravascular של microvessels היחיד של הכנת הריאות המבודדת. לכן, עבור כל דם קטן בתוך שדה תמונה, שינויים בקרינה במהלך העירוי של fluorophores וwashoff יכולים להיות מוקלטים, ולכמת מחובר 14. שימוש בערכים של הקרינה כלי דם המרבית ושייר, ניתן לקבוע מדד חדירות לכל דם קטן בתחום ההדמיה. כדי לקבוע שינויי חדירות בתגובה לסוכנים דלקתיים או פוגעניים, הסוכן הרצוי יכול להינתן ראשון ולאחר מכן מדד החדירות נקבע. בנוסף, שדה התמונה ניתן להגדיר בכל מקום באזור הריאות רווי ידיmicrocatheter, ובכך מאפשר רמה גבוהה של גמישות בבחירת רשת כלי הדם הרצויה. לכן, ההכנה המבודדת-perfused דם הריאה בד בבד עם הדמיה בזמן אמת מספקת מודל ניסיוני אטרקטיבי לכמת חדירות בmicrovessels ריאה אחת.

<table><tbody><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>#18</td></tr><tr><td>מתמר לחץ</td><td>מדעי נתונים בינלאומיים</td><td>P23XL</td><td>צריך כמות 3</td></tr><tr><td>מחט פרפר</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>450081</td><td>21 גרם</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>קול פארמר</td><td>Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>PE-90 צינורות</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427421</td><td>30 ס"מ דרוש</td></tr><tr><td>צינורות PE-10</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427401</td><td>40 ס"מ דרושים</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS8000</td><td></td></tr><tr><td>טבעת</td><td></td><td></td> O <td>בהתאמה אישית עם חור בקוטר 20 מ"מ וידית לאבטחת טבעת O למחזיק</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף</td><td>אולימפוס אמריקה</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לרכישת תמונה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>מטמורף</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 20KD</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>0.5 מ"ג/מ"ל (ניתן לבחור דקסטרן בגודל מולקולרי שונה, אם ניסויי ניסוי מצביעים על התאמתו על סמך ערכי מדד החדירות המחושבים)&nbsp;</td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד</td><td>סיגמא אולדריץ' סרוטיפ</td><td></td><td>0111:B4</td></tr></tbody></table>

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

הכנת ריאות perfused דם המבודדת נעשתה שימוש נרחב כדי לחזות ולהגדיר איתות בmicrovessels אחת. על ידי צימוד הכנה זו עם הדמיה בזמן אמת, הוא הופך להיות אפשרי כדי להבחין בשינויים בחדירות microvessels ריאה בודד. במסמך זה אנו מתארים את שלבים לבודד את ריאות עכברוש וינקב אותם עם דם עצמי. לאחר מכן, אנו מתארים את צעדים להחדיר fluorophores או סוכנים באמצעות microcatheter לאזור ריאות קטן. שימוש בהליכים אלה תוארו, קבענו עליות חדירות בmicrovessels ריאות עכברוש בתגובה לחליטות של lipopolysaccharide חיידקים. נתוני המחקר מראה כי lipopolysaccharide מוגבר דליפת נוזל על פני שני מגזרי venular וmicrovessel נימים. לכן, שיטה זו מאפשרת להשוות בין מגזרי תגובות חדירות כלי דם ובכך, מגדיר את ההטרוגניות כל בתגובה. בעוד שיטות נפוצות המשמשות להגדרת חדירות ריאות דורשות postprocessing של דגימות רקמת ריאה,שימוש בהדמיה בזמן אמת מבטלת דרישה זו באה לידי ביטוי החל מהשיטה הנוכחית. לכן, הכנת הריאות המבודדת בשילוב עם הדמיה בזמן אמיתי מציעה מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות לקביעת חדירות כלי הדם ריאה, עדיין היא שיטה פשוטה כדי לפתח וליישם.

הכנת ריאות מבודדת-perfused דם המחובר לצינורות טפטוף והציוד נלווה מוצגת באיור 2. למטרות הדגמה, השתמשנו עכברוש ספראג Dawley, אם כי ההליכים המתוארים במסמך זה יכול לשמש עם כל מיני עכברים. חליטות דרך microcatheter פרוזדורי שמאל להגיע לאזור קטן בלבד של הריאות. האזור רווי יכול להיות מזוהה על ידי שינוי הצבע-Induced עירוי (איור 3). הכנת הריאות כמיקום עבור הדמיה בזמן אמת מוצגת באיור 4. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

הכנת ריאות perfused הדם המבודדת עושה את זה אפשרי לדמיין רשתות microvessel על פני הריאות. כאן אנו מתארים גישה לכמת חדירות של microvessels אחת ריאות מבודדות באמצעות דימות פלואורסצנטי זמן אמת.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את החדירות בכלי דם מיקרוסקופיים בודדים בריאות מבודדות של חולדה באמצעות שיטה מבוססת פלואורסצנציה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד ריאות החולדה וביצוע פרפוזיה שלהן בדם אוטולוגי. השלב השני של הפרוצדורה הוא החדרת מיקרוקתטר לעלייה השמאלית אל תוך אזור קטן של הריאה כדי להזרים דקסטרין המסומן ב-flora four.לאחר מכן, בעוד הדקסטרין המסומן מוזרק, נאספות תמונות של מיקרו-כלי הדם בריאה. השלב האחרון הוא כימות חדירותן של מיקרו-כלי דם בודדים מתוך התמונות באמצעות תוכנה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את מידת החדירות של מיקרו-כלי הדם בריאה תחת תנאים שונים, כגון לאחר טיפול ב-LPS.ד"ר Kava Kasami, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, תדגים את ההליך הזה. התחילו בביצוע טרכיאוטומיה לחולדה זכר הנמצאת במישור הרדמה כירורגי מאושר. השתמשו בקנולה טרכאלית מסוג PE 90 והדקו אותה באמצעות תפרים. לאחר מכן, מזגו ללב 100 עד 200 יחידות של heparin באמצעות מחט פרפר במידה 21 gauge.המתינו דקה אחת ולאחר מכן בצעו דימום מלא (exsanguination). אספו את הדם והניחו אותו בצד עם סליין. מלאו שתי קנולות העשויות מצינור tigon בקוטר 3 מילימטר ובאורך 4 סנטימטר, כאשר קצה אחד שלהן מורחב.כעת בצעו תורקוטומיה (פתיחת בית חזה). בצעו חתך בגודל שמספיק בדיוק להחדרת הקנולה אל החדר הימני, והחליקו פנימה את הקצה המורחב של קנולה אחת לכיוון העורק הריאתי. קבעו את הקנולה באמצעות תפרים.השתמש באותה טכניקה כדי להחדיר את הקנולה השנייה לקודקוד (apex) של החדר השמאלי לכיוון העליה השמאלית. קבע אותה באמצעות סרט טבורי ברוחב שני מילימטרים. כעת הסר את רקמות החיבור המפריעות והוצא את הריאה והלב יחד עם הקנולות.העבירו אותם לצלוחית פטרי כאשר פני השטח של הסרעפת בריאה פונים כלפי מעלה ושלוש הקנולות מיושרות. העבירו את הדגם המנותח לבמה מתכווננת המצוידת בצינורות tigon מספר 18 המחוברים למתמירים של לחץ המשמשים כצינורות כניסה ויציאה. כעת ערבבו את הדם שנאסף עם נפח שווה של תמיסת albumin 5%.הוסיפו תערובת זו למאגר הטעינה. הפעילו את המשאבה בקצב של 14 milliliters per minute. ודאו שאין בועות אוויר בצינורית.בשלב ההכנה, חברו את העורק הריאתי לצינור הכניסה של הריאה ואת הקנולה של העלייה השמאלית לצינור היציאה. ודאו שוב שאין אוויר בצינורות, ובדקו כי השנט פתוח.חבר את הקנולה הקנהית למתמר לחץ שלישי. נפח את הריאות באמצעות הקנולה הקנהית עם 30% oxygen. שמור על הריאות בלחץ של חמישה סנטימטרים מים.כעת סגרו את השנט בעזרת תפסן והפעילו את המשאבה בקצב של 14 milliliters per minute. כדי להתחיל את הפרפוזיה של הריאה במהלך התהליך, כווננו את המשאבה כך שתשמור על לחץ ריאתי של כ-10 centimeters of water ותשמור על לחץ בעלייה השמאלית של three centimeters of water. התחילו בהכנת הריאה המוחדרת בדם.ראשית, הכינו קטטר להזרקה על ידי הכנסת צינור PE 10 באורך 40 סנטימטרים לתוך צינור PE 90 באורך 30 סנטימטרים. חברו את הקצה השני של צינור ה-PE 10 למחט בכיול 30 gauge המחוברת למזרק של 1 cc. הביאו את קצה הצינור המחובר לריאה מעל הדגימה וחברו אליו את הקטטר להזרקה.הנחו את קטטר העירוי לעלייה השמאלית ולאחר מכן אל תוך הריאה עד למפגש עם התנגדות. הפעלת כוח מוגברת תגרום לפגיעה בריאה. חיתוך נכון של המיקרוקתטר הוא קריטי, שכן כל נזק שייגרם לריאה על ידי המיקרוקתטר יפחית את סיכויי ההצלחה של הפרוטוקול.בשלב הבא, מלאו את המזרק בתמיסת ringers וחברו אותו למשאבה. מזגו את התמיסה באיטיות בקצב של 10 µL לדקה. בהדרגה, אתר ההזרקה יהפוך לחיוור בהשוואה לשאר הריאה; כדי לשמור על פני השטח של הריאה לחים, עטפו אותה במהירות בניילון, למעט את אתר ההזרקה.כעת, כדי להדמיאן את הריאה, צרו חלון צפייה על ידי הצמדת טבעת O ללוחית כיסוי של 22 מילימטרים. בעזרת גריז לברזים (stopcock grease), הצמידו את טבעת ה-O למחזיק מבחנה. לאחר מכן, מקמו את החלון מעל נקודת ההחדרה.השלים את ההכנה על ידי העברת עדשה אובייקטיבית 20x מעל זכוכית המכסה ומיקוד על הריאה. לא צפויה עיוות ויזואלית. כעת הזרם לתוך הריאה תמיסה לפי בחירתך.בדוגמה זו, לאחר התמיסת המלח, מזריקים מיליליטר אחד של דקסטרין המצומד ל-ZI לתוך הריאה באמצעות משאבת מזריקים לאורך 60 דקות. באמצעות תוכנת הדימות, רשמו תמונה אחת לדקה במהלך שעת ההזרקה, והמשיכו ברישום במהלך שלב השטיפה העוקב למשך 10 דקות נוספות. לאחר הזרקת הדקסטרין, שטפו אותו על ידי הזרקת תמיסת רינגר לריאה למשך 10 דקות נוספות לפחות באותו קצב זרימה. מאוחר יותר, בעת ניתוח התמונות שנרכשו, דרגו את עוצמת הפלואורסצנציה המקסימלית באזור העניין במהלך הזרקת הדקסטרין.לאחר מכן, מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה המקסימלית של הפלואורסצנציה השיורית לאחר שטיפה של 10 דקות. שינויים בחדירות כלי הדם נבחנו באמצעות עירוי fitzy dextrin לאחר טיפול בליפופוליסכריד חיידקי, שכן זהו מודל נפוץ ל-LI. פלואורסצנציית fit e שיורית הייתה נמוכה בכלי דם זעירים שטופלו ב-ringers, אך גבוהה באלו שטופלו ב-LPS. יתרה מכך, בהשוואה לעירוי ringer's, עירוי LPS גרם להפחתה משמעותית במדד החדירות, דבר המצביע על עלייה גלובלית בחדירות בכל כלי הדם בתוך שדה התמונה.יתרה מכך, בהשוואה לעירוי רינגר, עירוי LPS גרם לירידה משמעותית במדד החדירות, דבר המצביע על עלייה גלובלית בחדירות בכל הכלי הדם בשדה התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות הבנה טובה של אופן הכנת ריאות בודדות של ציפור, החדרת מיקרוקתטר בזנב שמאל והגדרת חדירות במיקרו.

quantifying-single-microvessel-permeability-isolated-blood-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של בידוד, איוורור ו instrumenting הריאות העכבר כדי למדוד יציב או pulsatile לחץ הדם הריאתי זרימה יחסים כדי לכמת את ההשפעות של זרימת הדם, זרימת אוויר, שינויים בדרכי הנשימה ושינויים בכלי הדם על afterload חדרית הנכון.

אפיון מבודד, מאוורר ריאות, instrumented ועכבר perfused עם תזרים pulsatile

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

איזוקונסטריאקציה ריאתי היפוקסית (HPV) היא תופעה פיזיולוגית חשובה שבאמצעותה ב זלוף ריאות היפוקסיה מכתשי מותאם אוורור. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לניתוח של HPV של כלי ריאות מורין עם קטרים של 20-100 מיקרומטר.

ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

מוצגת שיטה למדידת מהירות זרימת הדם במיקרו-סירקולציה בגרורות סרטן ריאתיות של פני הצדר בחולדות בצורה אוטומטית, באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית ריאתית בחזה סגור. למודל זה יש פוטנציאל לשמש ככלי נרחב לביצוע מחקר פיזיולוגי על גרורות ריאתיות במכרסמים.

אוטומטי מדידה של microcirculatory זרימת דם ריאתי במהירות גרורות של חולדות

Ex-Vivo ריאות זלוף (EVLP) אפשר השתלת ריאות בבני אדם להפוך לזמינה יותר בכך שיאפשר את היכולת להעריך איברים ולהרחיב את המאגר התורם. כאן אנו מתארים את הפיתוח של תכנית EVLP חולדה וחידודים המאפשרים למודל לשחזור להתרחבות עתידית.

שיטה של ​​מבודד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; ריאות זלוף במודל עכברוש: ​​לקחים מפיתוח תכנית EVLP עכברוש

טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

הכנת ריאות ארנב מבודד הוא כלי סטנדרטי זהב במחקר ריאתי. פרסום זה נועד לתאר את הטכניקה כפי שפותחה לחקר מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים המעורבים בתגובה בדרכי הנשימה, שימור ריאות ומחקר פרה-אקליני בהשתלת ריאות ובבצקת ריאות.

מערכת זלוף ריאות מבודדת במודל הארנב

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני לביצוע כימות בלתי משוחד של צפיפות כלי הדם הריאתיים עבור רקמת ריאה של עכברים שלמים באמצעות צביעה יחידה של איזולקטין B4.

כימות צפיפות כלי הדם הריאתיים בעכברים על פני אונות

למד כיצד לכמת חדירות בכלי דם קטנים בריאות עכברוש מבודדות באמצעות שיטת דימות פלואורסצנטית בזמן אמת. השיטה מאפשרת לחקור תגובות כלי דם ריאתיים לגירויים שונים.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

גלה סרטונים נוספים