מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא היא לבחון את ההשפעות של זיהום מיקרוביאלי על דלקת כרונית in vivo באמצעות מודל בעלי חיים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. זה מושג על ידי הדבקה אוראלית של עכברים ב-porphyromonas gingivalis כדי לגרום לדלקת כרונית מקומית ומערכתית. לאחר מכן ניתן להשתמש ב-MRI כדי למדוד את התקדמות הדלקת המערכתית בבעלי חיים חיים, בעוד שאובדן עצם דלקתי מקומי מוערך על ידי מיקרו CT וניתן לדמיין פלאק טרשת עורקים על ידי צביעת שומנים על הפנים לאחר הקרבה.

בסופו של דבר, ניתן למדוד הבדלים בנפח העצם המכתשית והצטברות פלאק טרשת עורקים בין עכברים נגועים ב-P gingivalis לבין בקרות לא נגועות על סמך ניתוח מיקרו CT ועל צביעת שומנים בפנים בהתאמה. היתרון העיקרי של מודל בעלי החיים שלנו הוא שהוא מאפשר לבחון הן מנגנונים מארחים והן מנגנונים פתוגניים המעורבים בדלקת כרונית ובמיוחד באתרים מרוחקים מזיהום. אז אתה יכול להסתכל על אתרים מערכתיים כמו גם אתרי זיהום מקומיים באמצעות עכברים טרנסגניים ומוטציות חיידקיות מוגדרות.

מודל זה יכול לסייע בזיהוי היבטים מרכזיים של פתוגנזה, כגון גורמים מארחים ומיקרוביאליים התורמים למחלות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנוני המארח והפתוגן הספציפיים המעורבים באובדן עצם דלקתי וטרשת עורקים, ניתן להתאים אותה גם למודלים אחרים של מחלות בעכברים, כולל דלקת מפרקים שגרונית, סוכרת וסרטן. זהו מתקן הליבה של MRI באוניברסיטת בוסטון, ועמיתי הפוסט-דוקטורט נינג הולך להדגים היבטים של הדמיית עכברים להתחיל על ידי פיזור גבעולים קפואים של אפרסק 3 81 על צלחות אגר דם אנאירוביות, ולדגור את הלוחות בתא אנאירובי ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר שלושה עד חמישה ימים, השתמשו באורגניזמים שגודלו בצלחת כדי לחסן תרביות נוזליות של חמישה מיליליטר של מרק עירוי לב מוח, או BHI. לאחר גידול בן לילה, העבירו את התרביות ל-45 מיליליטר של BHI ודגרו על התרביות באופן אנאירובי למשך 18 עד 24 שעות נוספות. בשלב אמצע היומן, קצרו את החיידקים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-7,000 GS וטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ביסודיות בחמישה מיליליטר PBS עם פיפטה סרולוגית לאחר שטיפת הגלולה שלוש פעמים ב-50 מיליליטר של PBS Resus, הגלולה ב-PBS כך שדילול של 1 עד 10 של התרבית הוא בעל צפיפות אופטית של 1.0 ב-660 ננומטר.

לאחר מכן יצא מספיק צמיגות בינונית קרבוקסי מתיל צלולוז כדי להשיג תמיסה של 2% משקל לנפח ולהוסיף לאט לאט את הקרבוקס אתיל תאית לתרחיף החיידקים תוך כדי מערבולת כדי למנוע גושים. למדוד את התקדמות הדלקת ב-C שתיים. תחילה הנח מחזיק בעל חיים עם ראש העכבר במצב שכיבה לתוך בדיקה אנכית של 30 מילימטר ולתוך הקדח האנכי של סורק 11.7 TMRI.

לאחר תהליכי נדנוד ושימינג, השתמש ברצף נדיר כדי לרכוש תמונות צופים לאורך שלושה כיוונים אורתוגונליים כדי ליצור תמונות ציריות קורונליות וסגיטליות. לאחר מכן, לאחר שימוש באנגיוגרפיה של תהודה מגנטית ברזולוציה נמוכה כדי לאשר שהתמונות שנרכשו נמצאות באזור היעד, בצע אנגיוגרפיה של תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה של העורק האינומינטי עם רצף הד שיפוע תלת מימדי לא ממוקד, תוך שימוש בפרמטרים הבאים. עובי לוח של 1.5 סנטימטרים, זווית היפוך של 45 מעלות, זמן חזרה של 20 אלפיות השנייה, זמן הד של 2.2 אלפיות השנייה, שדה ראייה של 1.5 על 1.5 על 1.5 סנטימטרים, מטריצה של 1 28 על 1 28 על 1 28 על 1 28, ומספר הממוצע של ארבע לזמן סריקה כולל של כ -22 דקות.

לאחר מכן בחר תמונה צירית של העורק המכנה 0.3 עד 0.5 מילימטרים מתחת להתפצלות התת-בריחית לניתוח החזר ROI כדי להצמיד את אבי העורקים, תוך שמירה על הרקמה מכוסה ב-PBS בכל עת. התחל בהנחת אבי העורקים במצב אנטומי עם נורות אבי העורקים משמאל. לאחר מכן הניחו סיכות מנוצ'ין זמניות ברצף בחמשת המיקומים הבאים, החלק העליון של אבי העורקים מתחת לענף השלישי של הקשת, באמצע אבי העורקים היורד ליד הקצה התחתון של אבי העורקים היורד ומעל הענף של עורק הירך.

לאחר מכן, השתמש במספריים קפיציים עדינים במיוחד כדי לחתוך את הצד השמאלי של אבי העורקים החל מהענף השמאלי של עורק הירך עד מתחת לענף הנמוך ביותר של אבי העורקים העולה. לאחר מכן לאחר חיתוך והצמדה של כל ענף כדי לחשוף את פני השטח הפנימיים שלו, המשך להצמיד את הרקמה. כל המשטח הפנימי חשוף ונראה בבירור מלמעלה וללא הפרעות חזותיות מהפינים.

כדי להכתים את השומנים ולכמת את הנגעים, התחל בכיסוי אבי העורקים המוצמד בתמיסת סודאן ארבע או O אדום שמן. לאחר 50 דקות יש לשטוף את הטישו עם 70% איזופרופנול למשך דקה עד חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף בעדינות את אבי העורקים במים מזוקקים כפולים עד שהמים היורדים מהטישו כבר לא אדומים. לאחר מכן, כסו את אבי העורקים ב-PBS והניחו סרגל ליד הרקמה כדי לסייע בכיול התמונה.

לאחר מכן צלם תמונות של הרקמה עם המצלמה ברזולוציה גבוהה המחוברת למיקרוסקופ מנתח, ושומר את התמונות כקובצי TIFF. לבסוף, בתוכנת ניתוח תמונות עקוב ידנית אחר כל משטח אינטימי כדי לקבוע את שטחו. לאחר מכן, כדי לחשב את שטח הנגע באמצעות סף צבע אוטומטי, הגדר סף לכל תמונה כדי להגדיר עוצמת צבע המפלה בין הנגעים לאזורים הנורמליים.

לאחר מכן ניתן לחשב את אחוז המשטח האינטימי המכוסה בנגעים טרשת עורקים בניסוי מייצג זה עם עכברים נגועים ב-p gingivalis. ניתוח נפחי גילה כי עכברים נגועים מציגים אובדן עצם משמעותי בהשוואה לבקרות לא נגועות. בדיקה ויזואלית של ה-Hemi maxilla המשוחזר מדגימה עלייה בשטח הפנים החשוף של השורשים הטוחנים בעכברים נגועים בהשוואה לביקורת הנוטה לטרשת עורקים.

עכברים עם מחסור ב-POE. P gingivalis גורם לדלקת כרונית המניעה אובדן עצם מכתשית ושקיעת רובד דלקתי בתוך הסינוס של אבי העורקים ועורק נומיננטי כבר 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה, שניתן לנטר בעכברים חיים על ידי MRI סדרתי in vivo, MRI בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה כמו בתמונות מייצגות אלה. בהמשך למדידות הפנים של אבי העורקים בסודן, ארבעה כתמים מדגימים כי זיהום p gingivalis מגדיל משמעותית את שקיעת השומנים ואזורי הנגע על פני השטח האינטימיים.

בנוסף, ניתוח אימונוהיסטוכימי של נגעי סינוסים באבי העורקים מגלה חדירת מיקרופאגים מוגברת וביטוי מוגבר של הקולטן החיסוני המולד דמוי טול שני עכברים נגועים בעירוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לקחת בחשבון את משך הניסוי נקודות הזמן שבהן מוערכת הדלקת צריכות להתאים כראוי להתקדמות המחלה. לאחר הדמיית MR של אחרים, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עמידת פנים או כימיה חיסונית כדי לענות על שאלות נוספות כמו העומס הגלובלי של טרשת העורקים או המרכיבים התאיים של הנגע.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב מודל עכבר in vivo, המאפשר לך לבחון גורמים מארחים ופתוגניים המעורבים בדלקת כרונית. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש נכון ב-PPE בעת ביצוע הליך זה.