ברונכוסקופיה מודרכת מבחינה ויזואלית, Intrabronchial הרכבת חיסון ו: ריאות שור במחקר ביו
3 ביולי 2014
מאמר זה מתאר טכניקות bronchoscopic בריאת השור תחת תנאי ניסוי, כלומר חיסון מודרך bronchoscopically, שטיפה ברונכואלוואולרית, צחצוח הסימפונות, וביופסית ריאות transbronchial.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור אינטראקציות בין מאוחר לפתוגן במודל בקר של זיהום נשימתי. מטרה זו מושגת על ידי השראה של זיהום נשימתי בעגלים באמצעות הזרקה תוך-סימפונית (intra bronchial) של הפתוגן הנבדק במהלך מהלך המחלה. דגימות נלקחות מהחיה באופן חוזר באמצעות שטיפה ברונכואלוולולרית (bronchoalveolar lavage).
בשלב הבא מבצעים שטיפות מברשת ברונכיאליות וביופסיות ריאה טרנס-ברונכיאליות כדי להוציא תאי אפיתל ודגימות של רקמת בועיות או רקמת ריאה, בהתאמה. בסופו של דבר, ניתן לאשר מחלה נשימתית ספציפית לנתיב פתוגני, למשל, על ידי שינויים דלקתיים בשטיפה, ציטולוגיה ובזיהוי אימונוהיסטוכימי של הפתוגן. בביופסיות ריאה טרנס-ברונכיאליות, היתרון המרכזי של מודל בעלי החיים הגדולים זה בהשוואה למודלים קיימים אחרים של בעלי חיים ומכרסמים, הוא שבמודל שלנו אנו מסוגלים לחקור את מהלך המחלה לאורך פרק זמן ממושך באותו פרט באמצעות דגימה חוזרת.
בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האינטראקציות בין המארח לפתוגן in vivo, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרים, כגון פתוגנים חלופיים או מיני מאחס אחרים. את השמירה על ההרדמה והסיוע בדגימה תבצע פישר, שהיא וטרינרית מהמעבדה שלנו. לפני תחילת הפרוצדורה, מלאו שלוש מזרקים ב-1, 2 ו-5 milliliters של האינוקולום.
לאחר אישור ההרדמה, יש לשלוף את לשונו של בעל החיים ולמתוח את הצוואר. לאחר מכן, באמצעות תנועות סיבוב קלות, יש להניח ספקולום מתכת בפיו של בעל החיים. דחפו את הספקולום קדימה תחת בקרה חזותית, והשתמשו בפנס כדי לקבוע מתי הלרינקס נראה.
בשלב הבא, הכניסו צינור טפלון לתעלת העבודה של האנדוסקופ. הצינור לא אמור לבלוט מקצה האנדוסקופ. הכניסו את האנדוסקופ דרך המפשעת (speculum).
ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות קלות למרחיב (speculum) כדי לאפשר את הכנסת האנדוסקופ. כדי לעבור דרך הלרינקס, השתמש ב-bronchus trache, שמתפצל לצדו הימני של הריאה, כדי לסייע ביישור התמונה על המסך. לאחר מכן, חבר את המזרק המכיל 5 mL של אינוקולום לקצה צינור הטפלון.
הנח את הצינור אל תוך הענפים שבהם יופקד האינוקולום והחדר את כמות האינוקולום המתאימה. לאחר מכן, חבר את המזרק המכיל 1 mL של אינוקולום אל הצינור. התקדם אל הסימפונות והקנה והפקד את האינוקולום בענף הרלוונטי.
הוצא את האנדוסקופ ואת המרחיב (speculum). לאחר מכן, חבר את המזרק האחרון למפעיל (actuator) ורסס 1 mL של התרבית לכל נחיר. החזר את בעל החיים למאגר שלו במצב שכיבה על הבטן להשכמה.
דיור ההתאוששות צריך להיות ממוזג. מכיוון שהיכולת של בעל החיים לוויסות תרמי פוחתת תחת הרדמה כללית, כדי לאסוף דגימות שסתום בנקודת הזמן הרצויה לדגימה, חממו חמישה מזרקים, שכל אחד מהם מכיל 20 milliliters של תמיסת סליין סטרילית איזוטונית, במקלח מים בטמפרטורה של 38 degree Celsius. לאחר מכן, הכניסו קטטר שטיפה לתעלת העבודה של האנדוסקופ והכניסו את האנדוסקופ לתוך הספקולום המתכתי.
בשלב הבא, התקדמו אל תוך הסיבון הראשי של הריאה השמאלית עד להגעה למצב טריז (wedge position), כאשר לא ניתן לדחוף את האנדוסקופ קדימה יותר. לאחר מכן, one after another, חברו למבוב השטיפה מזרקים המכילים תמיסת sodium chloride חמה לצורך הזרקת הנוזל ושאיבתו באופן ישיר.
יש לאחסן את נוזל שטיפת ברונכ׳אוולבולרית בבקבוקי זכוכית סיליקוניים על קרח מיד לאחר האיסוף, כדי למנוע מהמקרופאגים האלבולהריים להיצמד למשטח הזכוכית. רשמו הן את כמות התמיסה המלוחית שהוחדרה והן את כמות הנוזל שנאסף. לאחר מכן, הוציאו את קטטר השטיפה מהתעלה הפעילה כדי לאסוף תאים אפיתליאליים.
בשלב הבא, נavigo את האנדוסקופ למיקום הדגימה הרצוי. לדוגמה, בניסוי זה אל הפיצול של הקנה (bifurcation trache); כאשר האנדוסקופ במקומו, כסו מברשת ברונכיאלית עם הצינור והחדירו אותה לערוץ העבודה של האנדוסקופ עד שקצה המברשת יופיע על המסך. דחפו את המברשת ואת צינור הפלסטיק קדימה כחמישה סנטימטרים.
לאחר מכן, דחפו את ידית המברשת כדי להוציא אותה מתוך הפלסטיק. כאשר המברשת נמצאת במקומה, נתיבו אותה למיקום שיש להבריש. לאחר מכן, דחפו ומשכו בעדינות את המברשת קדימה ואחורה תוך כדי ניווט האנדוסקופ.
יש להבטיח מגע בין המברשת לדופן הסיבון כדי להסיר תאי אפיתל. יש להפסיק את השפשוף כאשר מופיע דימום. לאחר מכן, כסו את המברשת בעזרת השפופרת ומשכו אותה החוצה מתוך תעלת העבודה.
גלגלו בעדינות את סיבי המברשת המצופים בתאי אפיתל על עד חמש זכוכיות מיקרוסקופ, וקבעו את המריחות במתנול קר למשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר ייבוש של הזכוכיות באוויר, אחסנו אותן בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius כדי לבצע ביופסיית ריאה טרנשברונכיאלית. לאחר מכן, נווטו את האנדוסקופ למיקום הדגימה הרצוי.
לדוגמה, עבור הפרס Alis של ה-LOAs crans כבניסוי זה, לפני הכנסת מלקחי הביופסיה לתעלת העבודה, פתחו וסגרו אותם מספר פעמים כדי לוודא תפקוד תקין, ולאחר מכן דחפו את המלקחים אל ענף ה-coddle של הסימפונות והקנה עד להתרחשות התנגדות קלה. כעת, משכו אותם חזרה שניים עד שלושה סנטימטרים ופתחו את המלקחים. דחפו את המלקחים קדימה שוב, כשני סנטימטרים, ולאחר מכן סגרו אותם.
משכו חזרה והוציאו את המלקחיים מתעל הפעולה. השתמשו במחט כדי להסיר בזהירות את הרקמה ממלקחי הביופסיה ואחסנו אותה בתווך קיבוע מתאים כדי למנוע תהליכים אוטוליטיים. לבסוף, לאחר שהעגל התאושש בתאוה, נטרו שוב את בעל החיים לאיתור פנאומותורקס במהלך 24 השעות הבאות, תוך אספקת מזון ומים טריים.
כאשר בעל החיים החזיר לעצמו את ההכרה המלאה, ניתן לצבוע נתחים קפואים של ביופסיות ריאה טרנס-ברונכיאליות בשיטה אימונוהיסטוכימית. כדי להדגים את הפתוגן שהוחדר, שימו לב להכלילות החלאמידיות החומות בריאת בעל חיים זה, שהוחדר בחלאמידיה ארבעה ימים לפני הדגימה. צביעה אימונוהיסטוכימית של תאי השטיפה מאפשרת את הדמיית הפתוגנים התוך-תאיים.
לדוגמה, בתמונה זו, נראים גופי הכלואה (inclusions) של חלאמידיה במקרופגים אלבולאריים שנדגמו מעגל. תשעה ימים לאחר חיסון תוך-סימפוני בחלאמידיה, ניתן להבחין ב-CTAC. ניתן להבדיל בין תאי שטיפת סימפונות-שלפוחית (bronchoalveolar lavage) באמצעות צביעה ציטולוגית.
מקרופאגים אלבולריים הם סוג התאים השולט בנוזל השטיפה. עם זאת, מספר הגרנולוציטים נויטרופיליים עולה כאשר קיימים תהליכים דלקתיים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את ההזרקה ב-10 עד 15 דקות ואת הדגימה בתוך 20 עד 30 דקות, אם הפעולה מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע הזרקה תוך-סימפונית בעגלים, וכיצד לדגום נוזל שטיפת ברונכ׳יאולית (BAL), שפשוף סימפוני וביופסיית ריאה טרנס-ברונכ׳יאלית בבעל חיים תחת הרדמה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקות של ברונכוסקופיה בריאה של בקר בתנאים ניסויים, תוך התמקדות בשיטות כגון הזרקה מודרכת בברונכוסקופיה ושטיפה ברונכואלוולארית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של מערכת הנשימה
- מחקר מחלות זיהומיות
רקע
- אינטראקציות בין מאחס לפתוגן הן קריטיות להבנת זיהומים בדרכי הנשימה.
- מדגמי בעלי חיים גדולים, כגון עגלים, מאפשרים מחקר של מחלות לטווח ארוך.
- טכניקות ברונכוסקופיות מאפשרות דגימה מפורטת של רקמות ריאה.
- דגימה חוזרת מספקת תובנות לגבי התקדמות המחלה.
מטרת המחקר
- לחקר אינטראקציות מאח-פתוגן במודל בקר לזיהום נשימתי.
- לאישור מחלה נשימתית ספציפית לפתוגן באמצעות טכניקות דגימה שונות.
- לבחינת התאימות של שיטות אלו לפתוגנים אחרים או למיני מאח אחרים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הזרקה תוך-סימפונית של פתוגנים בעגלים.
- שטיפה ברונכאוולאולרית לדגימה של מקרופאגים אלבולאריים.
- הברשה ברונכיאלית להשגת תאי אפיתל.
- ביופסיה ריאתית טרנסברונכיאלית לדגימה של רקמת ריאה.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים דלקתיים ספציפיים לפתוגן בנוזל השטיפה.
- זיהוי אימונוהיסטוכימי אישש את נוכחותם של הפתוגנים.
- דגימה חוזרת אפשרה ניטור של התקדמות המחלה לאורך זמן.
- הטכניקות הדגימו היתכנות למחקר של פתוגנים שונים.
מסקנות
- טכניקות ברונכוסקופיות הן יעילות לחקר זיהומים נשימתיים בבקר.
- המודל מספק תובנות בעלות ערך לגבי אינטראקציות בין המאחסן לפתוגן.
- הממצאים יכולים לתרום למחקר על פתוגנים נשימתיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של בעלי חיים גדולים, כגון ריאות בקר, מספקים מערכת רלוונטית מבחינה תרגומית לחקר זיהומים נשימתיים, ומאפשרים דגימה חוזרת in vivo וניתוח ארוך טווח של אינטראקציות בין המאחסן לפתוגן. טכניקות של הזרקה ודגימה מונחות ברונכוסקופיה תומכות באמינות חיזוית במידול מחלה ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור גילוי תרופות למערכת הנשימה. שיטות אלו משפרות את קבלת ההחלטות בניהול תיקי פיתוח על ידי גישור בין ממצאים פרה-קליניים לבין הרלוונטיות למחלות נשימה בבני אדם.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן במודל ריאה רלוונטי פיזיולוגית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות למחלות נשימה באמצעות דגימה ישירה של רקמות ותאים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי מתן אפשרות לניטור לאורך זמן באותו בעל חיים.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות במחקר של זיהומי נשימה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק דגימות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור בדיקות מולקולריות ותאיות המשך.
- מאפשר סטנדרטיזציה של נהלי הדגימה לצורך קבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- תומך בפיתוח בדיקות לזיהוי פתוגנים ואפיון דלקת.
- מכין דגימות המתאימות לאנליזות אימונוהיסטוכימיות וציטולוגיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את מידול המחלה לפתולוגיה נשימתית אנושית לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות דגימה חוזרת in vivo.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים ארוכי טווח חסונים.
- מאפשר הערכה של התערבויות טיפוליות במערכת הרלוונטית למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הזרקה ודגימה מונחות ברונכוסקופיה ממצבות את המודל הבקרי כגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני בנתיבי מחקר של מחלות נשימה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובמחקרים מכניסטיים של זיהום ודלקת in vivo.
- סריקה: מספק דגימות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך מוכנות לבדיקות ואנליזות המשך.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של סממני דלקת, עומס פתוגנים ותגובות תאיות לאורך נקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מספק פלטפורמה להתאמת סממנים ביולוגים ומידול מחלות הרלוונטיות לפתולוגיה של ריאות בני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מודל של בעלי חיים גדולים הניתן לשימוש חוזר למגוון מחקרי זיהומים נשימתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות נשימה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של דגימה פולשנית מינימלית לצורך הדירות ויכולת הרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של תרופות לנשימה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף וקידום של מועמדים לתרופות נשימה בהתאם לסיכון המותאם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בברונכוסקופיה ובהרדמה של בעלי חיים גדולים.
- נדרשת גישה לציוד אנדוסקופי ולתשתית לעיבוד דגימות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדגימה והניתוח בין צוותים שונים.
- ניתן להתאים לנפיצות אחרות או למיני מאכסון באמצעות שינויים פרוצדורליים.
- יש למטב את זמני הדגימה וההתאוששות למען רווחת בעלי החיים ואיכות הנתונים.
