Name: ניתוח האוטומטי של דינמי Ca 2 + אותות ברצפי תמונות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: למד ניתוח אוטומטי של אותות סידן אנדותליאליים בעורקי כליות חזיר. השיטה מספקת נתונים מקיפים במהירות ובדיוק גבוהים תוך הפחתת הטיות משתמש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HL-085,887, HL-092,992, S10RR027535, וMOP-93676.

1. Dissection כלי והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת קציר מחזירים לנוער מקומיים, כמתואר במרטנס et 27 אל. הנח חדרים תקין חזירים שנקטפו לpolydimethylsiloxane צלחת לנתיחה תחתונה המכילה HEPES נאגרו פתרון פיסיולוגי מלוח (PSS) (PDMS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סטראו, לנתח ולהסיר את קטע של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (אורך ~ 8 מ&quot;מ, קוטר 0.5 מ&quot;מ) מרקמות באמצעות מלקחיים ומספריים באביב על ידי הסרת קטע הכלי משכבות רקמת לב שמסביב. הערה: שים לב שלא לנקב את דפנות כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוק PDMS (1 x 0.5 x 0.5 סנטימטר) לתוך הצלחת לנתיחה, ולהשתמש במחט להצמיד אותו לתחתית. חותכים כ 40 מיקרומטר תיל טונגסטן בקוטר לשנתי עשרה מקטעים באורך 0.3 סנטימטר ~, ויצר micropins, ולמקם את אלה בצלחת. בעזרת מלקחיים, לאבטח את הקצה אחד של מגזר הכלי לבלוק עם micropin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס מספריים באביב קטנים לתוך לומן הכלי, וחתך אורכים בצד אחד של הכלי כדי לפתוח אותו לחלוטין. לכוון את מגזר הכלי נפתח עם האנדותל למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropins שנותר כדי לאבטח את הגבולות של מגזר הכלי נפתח כדי לחסום באופן שהכלי יוצר מלבן שטוח. הערה: צריכה להיות כפופות צמרות Micropin 90 ° ונוסף עד מיושר עם משטח הבלוק. יש להקפיד למתוח את הכנת הכלי ללא מתיחת יתר; רוחב סופי צריך להיות ~ 1.5x רוחב unstretched מתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנפח קטן (~ 1 מיליליטר) של Fluo-4 פתרון טעינת PM על ידי ערבוב Fluo-4 בבוקר (10 מיקרומטר) מומסים DMSO עם (0.03%) pluronic בHEPES נאגר PSS (המכיל במ&quot;מ: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז), והכנס את כל הגוש לפתרון הטעינה כ 40 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינה, לשטוף את הבלוק בHEPES נאגרוPSS ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר האבן על 50-100 מפרידי עבים מיקרומטר בתא תחתון coverglass מכיל HEPES נאגרו PSS. הערה: פינים ממתכת יכולים לשמש כמפרידים ולהבטיח מגזר הכלי פונה כלפי מטה ולא נוגע במפרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידת להדמית confocal, ומתמקד בשכבת תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצפי הזמן לשגות תמונת לכידה של הקרינה היחסית הבסיסית ל~ 3 דקות בהגדלה 20X וקצב פריימים של ~ 8 פריימים לשנייה באמצעות תוכנת aquisition רצף תמונת confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ~ 3 דקות של הקלטת הקרינה הבזליים, להחליף HEPES נאגרו פתרון PSS עם אותו הנפח (~ 1 מיליליטר) של החומר P (100 PM) מומס בHEPES נאגרו PSS, ולהקליט עבור 3 דקות addtional. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח אוטומטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקלם רצף תמונה (ים) של פעילות סיד ניאון מתוכנה רכישת confocal כ8 סיביות, גרם&#39;. Tif&#39; קבצי rayscale תבנית עם מידע לא בקנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ הפתוח, לחץ על &quot;פתוח&quot; בתפריט הקובץ, ובחר את התמונה ברצף המתאים בחלון הסייר כדי להציג את התמונה ברצף (ים) בImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ההחזר על ההשקעה בקוטר מתאים על ידי שימוש בכלי ROI המלבני להעריך את הגבולות העליונים ותחתונים של הפריסה המרחבית של פעילות בתוך רצף התמונה (ים). הערה: הקוטר המלבני הממוצע הוא בחירה מתאימה לקוטר החזר על השקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תיקייה חדשה בכונן הקשיח של המחשב, ולהוסיף את התמונה ברצף (ים) לתוך ספריית התיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בImageJ, לחץ על החלון &#39;התוספים&#39;, ולאחר מכן לחץ על &#39;LC_Pro&#39; כדי להתחיל את הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את ערך קוטר החזר על ההשקעה ובחר את ערך סף מסנן (או 0.05 או 0.01). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבת הסימון &#39;הטיפול תרופתי&#39; והזן את ערכי נקודת הזמן מייד לפני ואחרי התרופה נוספת (בשניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;אישור&#39;, והזן את ספריית רצף התמונה לתוך חלון סייר קבצים. </li></ol> 3. פלט גרפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד גרסת R 3.0.2 <a href="http://www.r-project.org/">מhttp://www.r-project.org/.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את גרסת 32 ביט של ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;קובץ&quot;, ואז &quot;תסריט פתוח &#39;ובחר תסריט R&#39; traceplot.R &#39;להפקת דוחות ניסיוניים גרפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הכיול, וחבילות gplots על ידי בחירה &quot;חבילות&quot;, &quot;התקנת חבילות&quot;, ובחירה בחבילות appropirate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;קובץ &quot;, ואז&quot; מדריך שינוי &quot;הפקודה, ולהשתמש בחלון הסייר כדי לבחור את הספרייה המתאימה לפלט ניתוח LC_Pro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חלון סקריפט ולאחר מכן &quot;להפעיל את כל&quot; הפקודה כדי להריץ את הסקריפט. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פענוח Ca 2 + אותות מורכבים ברמה התאית ורבה תאית ידרוש גישות ניסוייות ואנליטיות קפדניים. כאן, גישה מתוארת שבזמן רצפי תמונת confocal נפתרו של Ca 2 + הקרינה תלויה נתונים לניתוח אוטומטי שמזהה ומכמת Ca 2 + אותות רלוונטיים מבחינה סטטיסטית בתוך שדות סלולריים ללא פגע במקרה הספציפי שהוצגו, קטע עורק היה מבודד מלב של חזיר, הצמיד נפתח כדי לחשוף את האנדותל, עמוס Ca 2 + מחוון Fluo-4 בבוקר, נתון להדמית confocal, ומוערך עם האלגוריתם המותאם אישית LC_Pro....

Ca 2 + הוא שליח שני בכל מקום איתות מולקולה וCa 2 + רמות cytosolic קבועות בתקנות. תאיים Ca 2 + אותות הם מורכבים וכוללים ארעיים מבודדים, תנודות ומתפשטים גלים 4 - 1. שליטה במרחב ובזמן של Ca 2 + הוא חשב לבסיס סגוליות אות פיזיולוגית, ולכן הניתוח של 2 + דפוסי אות Ca הוא עניין רב לחוקרים בתחומים מרובים 5. צבעי Ca 2 + מחוון כגון Fluo-4 ופורע-2 הם בדרך כלל מועסקים על מנת למדוד 2 + אותות תאיים Ca עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5-12. בדרך כלל, Ca 2 + אותות זמן מוערכים כשינויים תלויי זמן בקרינה ממוצעת בתוך אזור המוגדר על ידי משתמש, או באזור של עניין (ROI) 5,6,13 - 16. נכון לעכשיו, ניתוח ROI במדריך הוא גם זמן רב ועבודה בtensive מכיוון שהיא דורשת למשתמשים לזהות ROIs רבות ולבצע חישובים החוזרים על עצמן 17-19. טכניקות אלו עשויות להיות כפופות גם למשתמש שגיאה ניכרת, כוללים הקדמה של מצבי אות מלאכותיים והדרה של משרעת נמוכה או אותות מפוזר 18,20. אלגוריתמים לזיהוי אוטומטיים את ההחזר על ההשקעה בעבר יושמו באמצעות מגוון של גישות סטטיסטיות כדי לקבוע מיקום ROI אופטימלי, אבל הם בדרך כלל היו מוגבלים לניתוח של קו סריקה או פסאודו אונליין תמונות סריקה, אשר מגבילה את הניתוח לממד מרחבי יחיד בזמן 17, 19-22. בנוסף, קיימים אלגוריתמים רבים אינם מספיקים כדי להקיף את המגוון של Ca 2 + אירועי שחרור אשר נעו בין ארעיים תקופתי, מקומי לגלים מתפשט 23,24. הערכה מקיפה של 2 + אותות Ca הפיסיולוגיים לעתים קרובות מסתבכת עוד יותר על ידי הנוכחות של artif תמונה המשמעותיתלפעול שמקעקעת אות לרעש באפליה רבות מערכות ניסיוניות. בעבר, פתרון אוטומטי זיהוי ROI אלגוריתם לCa 2 + אות זיהוי חולף, מיושם כתוסף לתוכנת NIH ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD), פותח ומאומתים 25,26. אלגוריתם זה, הנקרא LC_Pro, תוכנן כדי לזהות ולנתח ROIs המקיפה ארעיים 2 + אות Ca ברצפי הזמן לשגות תמונה דו ממדיים. הנה פרוטוקול ניסוי מעשי והפגנת נציג יישום של האלגוריתם בהאנדותל של עורקים הכליליים חזירי מסופק, עם postprocessing נוסף באמצעות R תוכנת עיבוד הסטטיסטי בקוד הפתוח ליצירת פלט גרפי שמיש.

<table><tbody><tr><td>צלחת דיסקציה</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td></td><td>ערכת אלסטומר Fisher Sci#NC9644388, חייבת להיות יצוקה לתוך כלים</td><td></td></tr> <tr><td>PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>חומצת HEPES</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיצים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>חוט טונגסטן</td><td>המכון המדעי Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>לייף טק.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>סיכות מתכת</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>תא תחתון</td><td></td><td></td> מזכוכית <td>כיסוי מעוצב בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">הורד ב: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</א></td></tr><tr><td>תוסף LC_Pro עבור imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">הורד ב: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">הורד ב: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">הורד ב: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

ניתוח האוטומטי של דינמי ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

תאיים Ca 2 + אותות נלמדים בדרך כלל עם צבעי Ca 2 + חיווי ניאון ושיטות מיקרוסקופיה. עם זאת, ניתוח כמותי של Ca 2 + נתוני הדמיה הוא זמן רב ובכפוף למשוא פנים. אלגוריתמי ניתוח אותות אוטומטיים המבוססים על האזור של עניין גילוי (ROI) יושמו למדידות קו סריקה חד ממדי, אבל אין שום אלגוריתם הנוכחי המשלב זיהוי מותאם וניתוח של ROIs ברצפי תמונה דו ממדיים. הנה אלגוריתם לרכישה מהירה וניתוח של ROIs ברצפי תמונה מתואר. הוא מנצל אליפסות שיתאימו לאותות מסוננים רעש על מנת לקבוע את המיקום אופטימלי את ההחזר על ההשקעה, ומחשב את פרמטרי אות 2 + Ca של משרעת, משך והתפשטות במרחב. אלגוריתם זה מיושם כתוסף זמין באופן חופשי לתוכנת ImageJ (NIH). יחד עם סקריפטים ניתוח נכתבו עבור R תוכנת עיבוד הסטטיסטי הקוד הפתוח,גישה זו מספקת צינור קיבולת גבוהה לביצוע ניתוחים סטטיסטיים מהירים של תפוקה ניסיונית. המחברים מראים כי שימוש בפרוטוקול ניתוח זה יוביל לאפיון של Ca 2 + איתות פיזיולוגית שלם יותר ובלתי משוחד.

אלגוריתם מותאם אישית, LC_Pro, פותח ומיושם על מנת לבצע ניתוח אוטומטי של Ca 2 + דינמיקה ברצפי תמונת confocal. כמתואר באיור 1, האלגוריתם מנצל מודולים עיבוד רציפים ש) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p &lt;0.01) רעש, B) להגדיר אזורים של עניין (ROI) באופן אוטומטי במרכזי אתר פעילים, ו ג) לחשב את עוצמות הקרינה ממוצעת בROIs לקבוע פרמטרים אירוע ספציפיים. סקירה גרפית של האלגוריתם מוצגת באמצעות פולסים גאוס ממוחשבים של עוצמת ומיקום י...

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח פעילות סידן אנדותליאלית בעורקים כליליים של חזיר באמצעות ניתוח ROI אוטומטי. זאת משיגים על ידי נתישה ופתיחה של עורקים כליליים של חזיר לצורך מדידת פעילות סידן אנדותליאלית כשלב שני. ניתוח ROI אוטומטי מבוצע על מדידות הסידן שנרכשו, ובסופו פלט מסכם של פעילות הסידן.בשלב הבא מורצים סקריפטים של תוכנה על הפלט על מנת לנתח סטטיסטית ולהציג גרפית את תוצאות ניתוח פעילות הסידן; התוצאות המתקבלות מראות את פרמטרי המעברים של אות הסידן בהתבסס על ניתוח ROI אוטומטי ועיבוד סטטיסטי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח ROI ידני, הוא שהניתוח האוטומטי מהיר יותר, מקיף יותר ופחות חשוף לשגיאות משתמש. בהליך זה, הניחו את חדרי הלב הימניים של החזירים שנאספו לתוך צלחת דיסקציה תחתית מסוג A-P-D-M-S המכילה תמיסת סליין פיזיולוגית עם HEPES buffered physiological saline solution.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, הסיר מקטע של העורק הכלילי השמאלי היורד (left anterior descending coronary artery) על ידי הפרדתו משכבות רקמת הלב שמסביב. הקפד לא לנקב את דופן כלי הדם. לאחר מכן, הנח את בלוק ה-PDMS בצלחת ההפרדה והשתמש במחט כדי להקבעו לתחתית.הוסיפו באפר לצלוחית. לאחר מכן, חתו תיל טונגסטן בעובי של כ-40 מיקרון ל-12 מקטעים באורך של 0.3 סנטימטר שיהוו פינים זעירים (micro pins) והניחו אותם בצלוחית. השתמשו בפינצטה כדי לקבע קצה אחד של מקטע הכלי לבלוק באמצעות פין זעיר.החדירו בזהירות את מספרי הקפיץ הקטנים לתוך לומן כלי הדם וגזרו לאורכו לאורך צד אחד של כלי הדם כדי לפתוח אותו לחלוטין. לאחר מכן, כווןו את מקטע כלי הדם הפתוח כך שהאנדותליום פונה כלפי מעלה. השתמשו בפיני המיקרו הנותרים כדי לקבע את גבולות מקטע כלי הדם הפתוח לבלוק, כך שכלי הדם ייצור מלבן שטוח.לאחר מכן, הכינו מיליליטר אחד של תמיסת טעינה של flu oh 4:00 AM. הניחו את כל הבלוק בתוך תמיסת הטעינה למשך כ-40 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה; לאחר הטעינה, שטפו את הבלוק ב-heaps buffered PSS למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, קבעו את הבלוק על ספייסרים בעובי 50 עד 100 מיקרון בתא עם תחתית של זכוכית כיסוי המכיל heaps buffered PSS.הניחו את התא על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד לדמיון קונפוקאלי ומקדו את שכבת התאי האנדותל. באמצעות תוכנה לרכישת רצפי תמונות קונפוקאליות, צלמו רצפי תמונות של פלואורסצנציה בסיסית יחסית למשך שלוש דקות בהגדלה של 20x ובקצב של שמונה פריימים לשנייה. לאחר שלוש דקות של הקלטת פלואורסצנציה בסיסית, החליפו את תמיסת ה-PSS בבופר HEPES בנפח זהה של 100 picomolar של substance P המומס ב-PSS בבופר HEPES, והקליטו למשך שלוש דקות נוספות. בהליך זה, ייצאו את רצף התמונות של פעילות סידן פלואורסצנטית מתוכנת הרכישה הקונפוקאלית כקובץ TIFF בגווני אפור של 8 ביט, ללא מידע על קנה מידה.לאחר מכן פתחו את תוכנת ImageJ. לחצו על Open בתפריט File ובחרו את רצף התמונות המתאים בחלון הסייר. כדי לצפות ברצף התמונות ב-ImageJ, הגדירו ROI מתאים באמצעות כלי ה-ROI המלבני כדי להעריך את הגבולות העליונים והתחתונים של התפשטות הפעילות המרחבית בתוך רצף התמונות. לאחר מכן, צרו תיקייה חדשה בכונן הקשיח של המחשב והוסיפו את רצף התמונות לספריית התיקייה.בתוכנת ImageJ, לחצו על חלון ה-plugins. לאחר מכן לחצו על lc pro. כדי להתחיל את הניתוח, הזינו את ערך קוטר ה-ROI ובחרו את ערך סף הסינון לאחר מכן.לחצו על תיבת הסימון של טיפול תרופתי (drug treatment) והזינו את ערכי נקודות הזמן מיד לפני ואחרי הוספת התרופה. לאחר מכן לחצו על אישור (okay) והזינו את נתיב ספריית רצף התמונות בחלון סייר הקבצים. בשלב זה, הורידו והתקינו את גרסה 3.0 0.2 של R.לאחר מכן פתחו את גרסת ה-32 ביט של R. לחצו כעת על קובץ (file). פתחו סקריפט (script) ובחרו בסקריפט trace plot RR ליצירת דוחות ניסויים גרפיים. התקינו את חבילות calibrate ו-gpls באמצעות בחירה בחבילות (packages).התקינו את החבילות ובחרו בחבילות המתאימות לאחר מכן. לחצו על קובץ (file), לאחר מכן על הפקודה לשינוי ספריה (change directory) והשתמשו בחלון הסייר כדי לבחור את הספריה המתאימה לפלט של ניתוח ה-lc pro. לאחר מכן לחצו על חלון הסקריפט ואז על פקודת "הרץ הכל" (run all) כדי להפעיל את הסקריפט כאן.תמונות time-lapse של רצף תמונות קלט של מרווח דגימה בסיסי ולאחריו מרווח דגימה שעבר גרייה של substance P מוצגות בסקאלה של גווני אפור; רצפי תמונות time-lapse של הליזות המיטביות עבור המרווחים הבסיסיים והמגורים הופקו באמצעות lc Pro, ועקומות העוצמה המנורמלות התלויות בזמן מכל ROI שמוצב אוטומטית מוצגות כאן; היסטוגרמות של אמפליטודת שיא, משך זמן בחצי מהמקסימום ופיזור מרחבי מקסימלי עבור אירועי בקרה ואירועים שעברו גרייה של substance P מניסוי מייצג הופקו באמצעות R לעיבוד גרפי של הפלט מ-lc Pro.ראוי לציין כי גרייה באמצעות substance P הגדילה את מספר האירועים והסבה להזזה משמעותית ימינה של האמפליטודה החציונית ושל משך הזמן, כפי שנמדד במבחן man Whitney U. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למזער ארטיפקטים בתמונה הנובעים מתזוזת מישור המוקד או מהגדרות ניגודיות שגויות, שכן אלו עלולים להשפיע רבות על תוצאות הניתוח.

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה...

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

בmyocytes לב, מבני קרום צינורי ליצור רשתות תאיות. אנו מתארים מותאמים פרוטוקולים לבידוד i) של myocytes מלב העכבר כוללים בקרת איכות, ii) מכתים תא חי למיקרוסקופ פלואורסצנטי המדינה של-the-art, וiii) ניתוח תמונה ישירה לכמת את מורכבות רכיב והפלסטיות של קרום תאיים רשתות.

ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

אנו מציגים עבור זיהוי אופטי בזמן אמת של חלבונים יחיד ללא תווית פרוטוקול כפי שהם המופרשים מתאי חי. זה מבוסס על מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), אשר יכול להיות מיושם למגוון רחב של מערכות ביולוגיות שונות ותצורות.

ללא תווית הדמיה של יחיד חלבונים מופרש מתאי חי דרך iSCAT מיקרוסקופ

Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים (GECIs) השתנו באופן קיצוני איך באתרו Ca2 + הדמיה מבוצעת. כדי למקסם את שחזור נתונים מהקלטות אלו, נדרש ניתוח הולם של Ca2 + אותות. הפרוטוקולים נייר זה להקל על כימות של Ca2 + מאותת הקליט באתרו באמצעות מיפוי ייתכן וניתוח מבוסס חלקיק.

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) הוא תוסף קוד פתוח ImageJ לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית הבוחן תנועה על ציר z ומזהה את הערך המרבי של כל ערימת z כדי לייצג את עוצמת התא בנקודת הזמן המתאימה. הוא יכול להפריד תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך במישורי z שונים.

TACI: תוסף ImageJ לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית

בפרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקה חדשה לרישום וניתוח אותות Ca2+ בוורידים תוך-ריאתיים (ורידים ריאתיים קטנים או PVs) בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים. הטכניקה כוללת בידוד PVs קטנים, דגירה שלהם עם מחוון Ca2+ , קנולציה ולחץ עליהם, הדמיה קונפוקלית של אותות Ca2+ וניתוח נתונים.

הדמיית אותות Ca2+ בוורידי ריאה קטנים בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים

בדו"ח זה, אנו מציעים יישום חדש של אור ריפוי שיניים שרפים על בסיס הרכבה של אלקטרודות או בדיקות microdialysis בניסויים כרונית. חומר זה מאפשר התקשרות ישירה הגולגולת.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

למד ניתוח אוטומטי של אותות סידן אנדותליאליים בעורקי כליות חזיר. השיטה מספקת נתונים מקיפים במהירות ובדיוק גבוהים תוך הפחתת הטיות משתמש.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca

גלה סרטונים נוספים