Name: qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למד שיטת qPCR לזיהוי DNA של ציטומגלו וירוס בביופסיות מעי גס מוטבעות בפרפין. טכניקה זו מציעה רגישות גבוהה יותר משיטות צביעה קונבנציונליות ומפחיתה תוצאות דו-משמעיות באבחנה קלינית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את איימי Thomasson על סיועה בהכנת כתב היד הזה, ופרדריק Skarstedt וריאן כריסטי על מאמציהם בהכנה של דמויות.

עם אישורו של דירקטוריון סקירה המוסדי, חיפוש של מסד הנתונים מעבדה האלקטרוני בוצע לזהות קבוע פורמלין, פרפין המוטבע בלוקים (FFPE) המייצגים מקרים של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת עיכול ביופסיות (GI) שאובחנו על ידי histopathology (hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו / או אימונוהיסטוכימיה (IHC)). 1. עיבוד רקמות מרקמות FFPE GI ביופסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בלוקים רקמת הביופסיה FFPE GI לציטומגלווירוס (CMV) תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בלוקים אלה מאוחסנים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות microfuge 1.7 מיליליטר מראש תווית עם מספר זיהוי הייחודי של הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את Handwheel microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיאט גוש הרקמה לתוך מהדק הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין טרי, שאינו בשימוש, ויישר את הבלוק לזווית הסכין על microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את microtome לחתוך 10 מיקרומטר חלקים עבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעילת הHandwheel דואר ומראש לחסום כיוון הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 5 סעיפים של הבלוק ב10 מיקרומטר מרווחים עבים, המאפשר לכל חתך לגלגל לגלילה של רקמה. ודא כי כל מגילה מכילה ייצוג נאות של רקמות ביופסיה הרצויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את Handwheel microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, למקם את כל 5 המגילות של רקמה לתוך צינור צנטריפוגות מראש שכותרתו, נזהר רק לתפעל את המגילה על ידי פרפין על מנת להפחית את הפוטנציאל לזיהום לחצות. הצמד את הכובע על הצינור ומניח אותו בחזרה על המדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את חסימת הרקמה מmicrotome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק את הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר כל משטחים או מכשירים שייתכן שבאים במגע עם הרקמה הקודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להב טרי, שאינו בשימוש לתוך מחזיק הסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4-1.14 עבור כל בלוק נוסף לעיבוד. צינורות microfuge המכילים את מגילות הרקמה עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד timדואר של מיצוי DNA. </li></ol> 2. מיצוי DNA ממגילות של רקמות FFPE GI ביופסיה הערה: פרוטוקול זה מותאם מהעלון של ערכת FFPE רקמת DNA חילוץ (זהירות: מתייחס לגיליון בטיחות חומרים (MSDS)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת קסילן 1 מיליליטר (זהירות: עיין MSDS) לכל דגימת צינור microfuge. סגור את המכסה והמערבולת במרץ ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך במיצוי DNA באופן ספציפי שתואר בעלון המוצר של היצרן בשינויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ראשון 6 μl של הבקרה הפנימית (IC) על צינור אחד microfuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה ATL / proteinase K תמוגה ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לדגור על 99 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולא 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב elution DNA הסופי, לפתוח בזהירות את המכסה של עמודת טיהור DNA ולהחיל 50 μl DNAse / מים RNase ללא מזוקקים במרכזו של הקרום, ולא buffer-ATE. הערה: עיין בעלון לאחסון וההכנה של חומרים כימיים המתאימים. ה-DNA צריכה להיות מופק מכל 5 מגילות FFPE. לבצע את כל שלבי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR לCMV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת שרשרת פולימרז נוהל (PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור גיליון עבודה של Excel PCR לטווח assay CMV. גיליון עבודה של Excel זו מחשבת את הסכום הכולל של כל אחד מגיב הדרוש כדי להפוך את תערובת ההורים עם Mg. זה מכפיל את הכמות של כל אחד מגיב זקוקה לדגימה (מפורט בהמשך) פעמים מספר הדגימות והבקרה ועוד אחד (כדי לפצות על אובדן בשל pipetting). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוללים את ריאגנטים הבאים בכל תגובת PCR בסכום שצוינו: מגיב0; הסכום לדוגמה 12.5 μl בקבוקון תערובת ההורים LC-CMV 2.5 μl בקבוקון הצהוב פתרון מ&quot;ג נפח כולל 15.0 μl </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלול בכל assay, המנוהל על מים או אין שליטת יעד (NTC), ביקורת שלילית, ביקורת חיובית נמוכה, בקרה חיובית גבוהה, וגם QS3 או QS4, וכל דגימות המטופל. יש להגדיר את נימי הדם בצו זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ספציפי בלוק הקירור למכשיר ה-PCR בזמן אמת שמאוחסן ב 4 ° C. מניחים את צינורות נימים המתאימים בבלוק הקירור. אל תיגע במשטח של צינורות נימים. תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בנימי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כל תגובות שרשרת פולימראז במכסת מנוע נקייה אינו מזוהם בproduc ההגברהts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המספר הנכון של בקבוקוני הורים מערכת PCR כדי לבדוק את כל הדגימות החולים, בתוספת 5 פקדים. בואו בקבוקוני ההורים, פתרון Mg, והפשרת מים כיתה PCR בבלוק הקירור. כל בקבוקון אדון מכיל מספיק חומרים כימיים ל12 בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת בקבוקוני האדון ומהיר לסובב אותם בצנטריפוגה במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את התוכן של כל בקבוקון אדון לבקבוקון אחד, ובעדינות מערבולת שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת ההורים ופתרון Mg בכמויות שצוינו בגיליון עבודת PCR לתוך צינור microfuge סטרילי אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl תמהיל הורים עם Mg לתוך כל צינור נימים, למעט הנימים בעמדה 5 שהינה על רמת quantitation (QS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בלוק הקירור המכיל את צינורות נימים ושילוב הורים עם Mg ממכסת המנוע הנקי למכסת מנוע עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של בקרה פנימית (IC) ל30 μl הנותר של אמןלערבב עם Mg. מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl לתוך הנימים בעמדה 5 (עמדה לQS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl מים, לשלוט DNA, או דנ&quot;א מדגם לתוך צינור הנימים המתאים. מכסה את צינורות נימים באמצעות כלי מכסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קירור בלוק / דגימות למכשיר ה-PCR בזמן אמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת בזמן אמת PCR המכשיר (ראה טבלה 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברה והאיתור שבוצעו על מכשיר ה-PCR בזמן אמת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר למחשב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על סמל המכשיר ולהיכנס לתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר בזמן אמת PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;CMV / EBV&quot; מהמסך הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההנחיות של אשף המאקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתיבה כדי להפעיל בדיקה עצמית כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי התוכנה. בדיקה עצמית יש לבצע פעם אחת בכל יום המכשיר נמצא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם הארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ספירת המדגם ממוקמת בLEF העליוןהפינה לא של הדף לסכום של בקרות וחולים שנכללה בריצה והזן את מספר זיהוי של כל דגימת חולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;אבס קוואנט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;סוג לדוגמא&quot;, להקצות את סוג הדגימה המתאים לסטנדרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד בריכוזים הצפויים לסטנדרטי quantitation (QS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות נימים מהגוש הקריר ומניח אותם למצב המקביל בקרוסלה (קירור מדגם # 1 בלוק צריך להיות ממוקם בעמדת המס &#39;1 על הקרוסלה, וכו&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרוסלה לתחילת צנטריפוגות והעיתונות של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח צנטריפוגות ולהסיר את הקרוסלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרוסלה למכשיר ה-PCR בזמן אמת. סגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל הפעלה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר ה-PCR בזמן אמת יבדוק כל עמדה למדגם. לא להתרחק מהמכשיר עד סימון זו הושלם, ובייחודcially אם אחד מנימי הדם לא נמצא בקרוסלה. המכשיר יהיה לציין זאת ולשאול אם הריצה היא להמשך יבוא. לענות בחיוב לפני שעזבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה תושלם, סגור את הדו&quot;ח שנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;המוחלט Quantitation&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על החץ שליד צבע פיצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר צבע פיצוי&quot; מהתיבה הנפתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ פיצוי צבע העדכני ביותר לפנות לריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אישור כאשר התיבה יצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על החץ בתקן Curve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;שימוש חיצוני&quot; מהתפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ עקומת סטנדרט החיצוני העדכנית ביותר, ולאחר מכן לחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל על כל עקומה תחת התפריט המוחלט כימות כדי להבטיח שעקומות נמצאות ולא קו ישר, אם ריכוז מוקצה. כימות מוחלטת ל530 705/Back הוא ניתח באופן אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quשליטת ality <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שמספר הרבה חדש של חומרים כימיים הוא קיבל, או כל שישה חודשים, לפי תכוף יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של כל תקן לתערובת ההורים עם Mg. קחו למשל את הסטנדרטים כלולים בערכה ה-DNA שחולצה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של בקרה פנימית עבור כל תקן לתערובת ההורים עם Mg שימוש בתהליך יצירת העקומה סטנדרטית כדי להבטיח quantitation מדויק. אל תוסיף IC לתערובת ההורים עם Mg לשום תבנית הבקרה (NTC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן NTC ושלושה משכפל של Quantitation התקנים 4 QS, 3, 2, 1, ודילול של 1:10 QS4 לריצה כדי ליצור את עקומת הסטנדרט, בהיקף ב16 נקודות נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;לשכפל של&quot; בתפריט הנפתח לסטנדרטים חוזרים ונשנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אף 530/back ערוץ ולהדליק פיצוי צבע בעת ניתוח הארוך, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;Curve הרגיל (בהפעלה)&quot;, בחר &quot;שמירה בשם לשעברשלהן פנימי &quot;ושם העקום. הזן את התגובה &quot;מיושמת כעקומת סטנדרט&quot; בעת שמירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרף התוצאות. מקדם ליניאריות וכתוצאה מכך יש ≥ 0.81. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לריצות יומיות, כולל עותק אחד של QS3 או QS4 כשליטה בריצה. עקומת הסטנדרט החיצונית הנוכחית עשויה להיות מיובאת לתוך הריצה בשלב הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת פקדים: אין שליטת DNA, בקרה שלילית, נמוכה, ובקרות חיוביות גבוהות. עומס נגיפי צפוי נקבע ומותאם לכל ספק ומספר הרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת IC לכל דגימה ולשלוט במיצוי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל אחד מהפקדים נופל מחוץ לטווח, רשום את התוצאות בלתי מתקבלות על הדעת ולהתייחס assay לפתרון בעיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר של בקרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלול בכל ריצה: NTC, ביקורת שלילית, נמוכה חיובית, גבוהה חיובית, וסטנדרטית. </li></ol></li></ol> הערה: גבולות מקובלים לבקרות. אין פסגות יש להתבונןד לשום תבנית (NTC) ופקדים שליליים. פסגות צריכה להיות נוכחים בערוץ 530 ועומס נגיפי צפוי נקבעים ומותאם לכל ספק ומספר הרבה לבקרות חיוביות נמוכות וגבוהות.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
<li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li>
<li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded%2C+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li>
<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטות מעבדה רבות זמינות עבור האבחנה של זיהום ציטומגלווירוס (CMV), כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, מבחני ירמיה מולקולריים, היסטולוגיה של חומר ביופסיה, וכפי שהוכיח לאחרונה מבחני, מולקולריים של, ביופסיה קבועה פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) 5,6 רקמות. סרולוגיה, ברגע שעמוד תווך של אבחנה, רק באופן מהימן מזהה חשיפה ואינה תואמים היטב עם זיהום CMV אקוטי 7. תרבות ויראלי, קונבנציונלית ובקבוקון פגז אנטיגן מוקדם, הקשו על ידי פעמים assay ממושכות, במקרה טוב 2-3 ימים במקרה של <sup...

הפרשנות של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) בדגימות קליניות חשובה באופן קריטי. CMV הוא חבר בתת משפחת betaherpesvirinae של הרפס. דומה להרפס אחר, יש CMV היכולת להקים זיהום מתמשך או סמוי מאופיינת בחוסר השכפול נגיפי פעיל 1. הפעלה מחדש של נגיף עלולה להתרחש בזמנים של לחץ או דיכוי חיסוני אחר, מה שמוביל לשכפול נגיפי פעיל מאופיין בשחרור virion, אשר עשוי להיות מלווה בגילויי מחלה 2-4. במערכת העיכול (GI) תסמיני המחלה CMV בתדירות גבוהה כוללים כאבי בטן ו / או צואה דמה 1. האבחנה של גסטרואנטריטיס CMV ידי היסטולוגיה מנצלת hematoxylin ו eosin (H &amp; E) לזהות תכלילים נגיפיים CMV. במקרים בהם חשד קליני גבוהה עדיין אין תכלילים ברורים הם נצפו, אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לעתים קרובות כשיטת בדיקה נלווית. עם זאת, IHCיכול גם להיות הקשתה על ידי דפוסים נדירים לא קלאסיים המופיעים כתמים סלולריים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה (איור 2) 5. הוא ביקש להשתמש DNA שנלקח קבוע פורמלין, פרפין, מוטבע (FFPE) רקמת ביופסיה במערכת העיכול ותגובה הכמותית פולימראז שרשרת (qPCR) כדי לזהות CMV בביופסיות במערכת העיכול. טכניקה זו הוכח להיות בעל ערך בזיהוי של CMV בביופסיות במערכת העיכול, ומועילה במיוחד במקרים מכתים IHC המשמעיים 5,6. כמו כן, qPCR גם הוכח לתאם גם עם נתוני בדיקה נוספים קליניים CMV כאשר הוא זמין 6. שימוש בqPCR באיתור CMV עלול להוביל לאבחון מוקדם וטיפול במקרים בהם חשד קליני לCMV הוא גבוה, אבל H &amp; E ו-CMV IHC הוא שליליים.

<table><tbody><tr><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרופוגה</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים משוננים</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>62086-1S</td><td>מיקרו מלקחיים MF-1</td></tr><tr><td>צנטריפוגות שולחניות (מיקרופוגה)</td> <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר</td><td>פישר מדעי: X3P</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>פישר מדעי: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE רקמות ערכת</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR ערכת תוסף</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler צנטריפוגה</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler קירור בלוק</td><td>רוש</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler כלי מכסה</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פיצוי צבע</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l נימים</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>להבים</td><td>סאקורה</td><td>פישר מדעי: 4689</td><td>Accu-Edge פרופיל נמוך</td></tr></tbody></table>

qpcr הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של cytomegaloviral dna בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

זה חיוני כדי לזהות זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת העיכול (GI) בדרכי של חולי immunosuppressed, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. שיטות מעבדה רבות לזיהוי של זיהום CMV פותחו, כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, ושיטות מולקולריות. לעתים קרובות, שיטות אלו משקפות את מעורבות מערכתית עם CMV ולא באופן ספציפי לזהות מעורבות רקמות מקומית. לכן, זיהוי של זיהום CMV במערכת העיכול הוא לעתים קרובות נעשה על ידי היסטולוגיה המסורתית של רקמת ביופסיה. מכתים Hematoxylin ו eosin (H &amp; E) בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) נשאר מעמודי התווך של בדיקת ביופסיה אלה. H &amp; E וIHC לפעמים לגרום לדפוסי מכתים לא טיפוסיים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה. זה היה הראה כי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) לCMV יכולה להתבצע בהצלחה על, רקמת ביופסיה (FFPE) מוטבע פרפין קבוע פורמלין למאודרגישות גבוהה וספציפיות. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לבצע בדיקות qPCR לגילוי CMV ברקמת הביופסיה FFPE במעבדת הגדרה קלינית. שיטה זו עשויה להיות יתרון גדול עבור חולים במקרים של כתמים חד משמעיים לCMV בביופסיות במערכת העיכול.

כולל של 228 לוקי רקמות נבדקו על ידי תגובה כמותית פולימראז שרשרת (qPCR), שהיה מורכבת מ91 ציטומגלווירוס (CMV) מקרים חיוביים המבוססות על היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה החיובית (IHC), 18 עם דו משמעי CMV IHC, ו79 פקדים שליליים. כפי שמודגם באיור 2, במקרים חיוביים CMV היו הפגינו תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים (א) ו / או כתמים חיוביים IHC (ב &#39;). מקרים דו משמעיים היו הפגינו דפוסים נדירים, לא קלאסיים המופיעים כתמים (C), ואי...

פרוטוקול זה מתאר זיהוי qPCR של ציטומגלווירוס ברקמת ביופסיה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין, שהיא מהירה, רגישה, ספציפית ושימושית לפירוש דפוסי צביעה דו-משמעיים של המטוקסילין ואאוזין או אימונוהיסטוכימיה.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

המטרה הכללית של ההליך הבא היא להגביר את הרגישות לגילוי DNA של cytomegalovirus בביופסיות של מערכת העיכול, ובמיוחד בביופסיות עם תוצאות מעורפלות בשיטות צביעה קונבנציונליות. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך ואיסוף של גלילי רקמה מביופסיות של מערכת העיכול המקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין. לאחר מכן, DNA מופק מגלילי הרקמה לצורך הגברה.הפריימרים הספציפיים שנעשה בהם שימוש מגבירים באופן סלקטיבי כל DNA של נגיף cytomegalo. כאשר שיטות קונבנציונליות המבוצעות על רקמת ביופסיה של מערכת העיכול מראות תוצאות לא חד-משמעיות, שיטה רגישה זו יכולה לזהות DNA של נגיף cytomegalo. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות בתחום, כגון hematin, andin ואימונוהיסטוכימיה, הוא ששיטה זו אינה כוללת פרשנות של דפוסי צביעה שאינם קלאסיים על השקופית המדגימה חיתוך של רקמת ביופסיה של מערכת העיכל; Zainab van Horn, היסטוטכנולוגית במעבדה, תדגים את מיצוי החומצות הגרעיניות, וכן יודגם תהליך ה-R-T-P-C-R במעבדה.רבקה ג'וסלין עבור פרוטוקול זה. הכינו בלוקים של רקמת ביופסיה ממערכת העיכול מקובעי FFPE המונחים על קרח גרוס. ראשית, סמנו מבחנה למיקרו-צנטריפוגה עבור כל בלוק דגימה עם מספר הזיהוי של בלוק הרקמה במיקרוטום.וודאו שגלגל היד נעול והכניסו את בלוק הרקמה לתפסן הקסטה. וודאו שאתם משתמשים בלהב חדש כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות. חיוני להשתמש בלהב שלא היה בשימוש עבור הדגימה הראשונה שלכם.החליפו להב אחר בין דגימה לדגימה וכדי לחטא את המיקרוטום בין הדגימות. לאחר מכן, יישרו את הבלוק לזווית הסכין וכווננו את עובי החתך ל-10 microns. כעת שחררו את הגלגל הידני והניחו את הבלוק להתקדם לעבר הלהב.חתכו חמישה סנשנים מהבלוק במרווחים של 10 micron, תוך מתן אפשרות לכל סנשן להתגלגל לרולדה של רקמה. ודאו שכל רולדה מכילה ייצוג הולם של רקמת הביופסיה הרצויה. לאחר חיתוך חמש הרולדות, נעלו את הגלגל הידני.בעת העברת חמשת הגלילים למבחנת הצנטריפוגה המסומנת, ודאו שהפינצטה נוגעת רק בפראפין ולא ברקמה באופן מיידי. סגרו את המבחנה במכסה, ולאחר מכן הסירו את הבלוק ממהדק הקסטה כדי לאסוף גלילים מהדגימה הבאה. ראשית, הסירו והשליכו את הלהב.ולפני טעינת להב חדש שאינו בשימוש, חטאו את כל המשטחים שייתכן ובאו במגע עם הדגימה הקודמת. עד לעיבוד נוסף של הדגימות, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר. הפרוטוקול הבא מותאם מהערכה להפקת DNA מרקמות FFPE.יש להיוודא כי עיינתם בגיליון בטיחות החומרים לפני התחלת העבודה. התחילו בהוספה של 1 mL של xylene לכל מבחנה של דגימה, ולאחר מכן ערבבו אותן ב-vortex בעוצמה למשך 10 שניות. לאחר מכן, פעלו לפי הוראות היצרן עם השינויים הבאים.ראשית, הוסף שישה µL של הבקרה הפנימית לכל מבחנה. שנית, לאחר דגירה של הליזיס באמצעות A TL proteinase K בטמפרטורה של 56 °C למשך שעה אחת, דגור את הדגימות בטמפרטורה של 99 °C למשך 30 דקות במקום בטמפרטורה של 90 °C למשך שעה אחת.שלישית, בעת ביצוע שלב האלוציה, במקום באפר TE, יש להוסיף בזהירות 50 microliters של מים מזוקקים נקיים מ-DNAs ו-RNAs למרכז הממברנה של עמודת האלוציה. ולבסוף, את כל שלבי הצנטריפוגה יש לבצע בטמפרטורת החדר. יש להכין את התגובות במנדף נקי שאינו מזוהם בתוצרי הגברה מהערכה.הוצא מספר מספיק של מבחנות מאסטר (master vials) ותמיסת מגנזיום עבור הדגימות ובתוספת חמש בקרות. כל מבחנת מאסטר מכילה ריאגנט מספיק ל-12 בדיקות. לאחר ההפשרה, ערבב את מבחנות המאסטר במערבל וורטקס (vortex) וסובב אותן קצרות בצנטריפוגה במהירות מקסימלית.בשלב הבא, בהתאם לגיליון העבודה של ה-PCR, ערבבו את תמיסת המגנזיום ואת תערובת המאסטר (master mix). ערבבו בעדינות את התמיסות באמצעות פיפוט תוך הנחתן בבלוק קירור. הוסיפו 15 µL מהתערובת לנימי הבדיקה בבלוק הקירור, למעט במיקום חמישה.קפילריה זו מוקצית לתקן הכימות. העבירו את בלוק הקירור המכיל את הקפילריות ואת תערובת המאסטר (master mix) עם מגנזיום ממנדף העבודה הנקי למנדף עיבוד נפרד. כאן הוסיפו 2 µL של בקרת פנים ל-30 µL הנותרים של תערובת המאסטר.ערבבו את התמיסה על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting up and down) והעבירו 15 µL מתערובת זו אל הקפילרה במיקום חמש. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של DNA של ביקורת מים או DNA של דגימה אל המיקום המתאים. לאחר הטעינה, סגרו את הקפילרות באמצעות כלי הסגירה בצנטריפוגת הקפילרות.העבירו את הקפילרות מבלוק הקירור למיקום המתאים במעמד הקרוסלה. לאחר מכן, טענו את הקרוסלה לצנטריפוגה והפעילו את מחזור הסבב. העבירו את הקרוסלה למכשיר ה-real-time PCR והפעילו את התגובה בשלב מאוחר יותר במהלך הניתוח.הצג את הנתונים באמצעות כימות מוחלט כדי להבטיח שקיים עקום לביצוע כימותים של סך הכל 228. בלוקים של רקמה נבדקו באמצעות QPCR 91. בלוקים היו מקרים חיוביים ל-CMV על בסיס היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה חיובית.ב-18 בלוקים התוצאה של C-M-V-I-H-C הייתה מעורפלת. 79 הבלוקים האחרים היו ביקורות שליליות. הוצגו מקרים חיוביים ל-CMV.הכללות נגיפיות טיפוסיות של CMV וצביעת IHC חיובית, או לפחות אחד משניהם. המקרים המעוררים ספק הראו דפוסי צביעה נדירים שאינם קלאסיים, בעוד שבביקרות השליליות לא נצפתה היסטולוגיה חשודה או צביעת IHC מתוך 91 הרקמות החיוביות ל-CMV 88. נמצאו חיוביים באמצעות QPCR; מתוך 71 הביקרות השליליות, אחת נמצאה חיובית ל-CMV באמצעות QPCR.A. דיון בביופסיות עם צביעת C-M-V-I-H-C שנויה במחלוקת מופיע בפרוטוקול הכתוב. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מיצוי DNA מרקמת ביופסיה של מערכת העיכול המקובעת בפורמלין ומוטמעת בפראפין (FFPE), ולאחר מכן זיהוי DNA של נגיף cytomegalo באמצעות real-time PCR.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

בסרטון זה, התאים הנגועים בנגיפים של MCPyV היו נתונים לתגובת שרשרת הכלאה  באתרם כדי לזהות גנומים ספציפיים של MCPyV. יתר על כן, טכניקת DNA-HCR שולבה עם FISH כדי לדמיין את הדנ"א MCPyV בתאי עור אנושיים נגועים.

דגי HCR-DNA: טכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתרה לזיהוי DNA נגיפי בתאים נגועים

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

ניתן להבחין בין ניתן להבחין בין כרומוזומי מעצבים של פרויקט גנום השמרים הסינתטיים, Sc2.0, לבין עמיתיהם המקוריים באמצעות בדיקת גנוטיפ מבוססת PCR הנקראת PCRTagging, שיש לה נקודת קצה של נוכחות/היעדרות. כאן אנו מתארים שיטת זיהוי PCR בזמן אמת בתפוקה גבוהה עבור גנוטיפ PCRTag.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת בשילוב עם שעתוק במהופך (RT-qPCR) כבר בשימוש נרחב כדי למדוד את רמת זיהומים וירוס RNA. כאן אנו מציגים assay RT-qPCR ישיר, אשר אינה דורשת שלב טיהור RNA, שפותחה עבור כימות של כמה וירוסים RNA, כולל וירוס דנגה.

מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

למד שיטת qPCR לזיהוי DNA של ציטומגלו וירוס בביופסיות מעי גס מוטבעות בפרפין. טכניקה זו מציעה רגישות גבוהה יותר משיטות צביעה קונבנציונליות ומפחיתה תוצאות דו-משמעיות באבחנה קלינית.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

גלה סרטונים נוספים