פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב"ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשוות את ביטוי ה-micro RNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (induced pluripotent stem cells), בתאי אפיתל של הרשתית הפיגמנטית המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, ובתאי אפיתל של הרשתית הפיגמנטית עובריים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תרבית והרחבה של תאי IPS ושל RPE עובריים.

השלב השני הוא גדילת תאי ה-IPS לתאי RPE. לאחר מכן, מוצאים RNA מתאי ה-IPS, מתאי ה-I-P-S-R-P-E ומתאי RPE עובריים. השלב הסופי הוא ביצוע אנליזת micro RNA microarray על דגימות ה-RNA וניתוח הנתונים.

בסופו של דבר, ניתוח מסלולים ורשתות משמש לזיהוי microRNAs המבטאים ביטוי דיפרנציאלי המעורבים ברשתות תאיות מרובות, כולל התרבות והתקדמות מחזור התא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר הראייה, כגון תפקיד ה-microRNA בבקרתה של דיפרנציאציה לתאי RPE בוגרים, התקדמות מחזור התא, התרבות והזדקנות תאית. ההשלכות של טכניקה זו חלות על טיפולים המשתמשים באפיתל רשתית (RPE) המופק מתאי גזע להחלפת RPE חולה או פגום, מכיוון שניתן לקבוע את מספר המעברים (passage number) האופטימלי של התאים המשמשים לטיפול.

אף על פי שנושא זה יכול לספק תובנות לגבי הגורמים המווסתים את הגבולה של RRP מ-IPS, ניתן ליישמו גם על מערכות איברים אחרות, כגון גבולה של סוגי תאים ספציפיים אחרים של TC מ-IPS. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, זרעו את התאים הגזעיים הפלוריפוטנטיים המושרים בריכוז של כ-350 מושבות תאים לבאר על פלטה מצופה שזה עתה הוכנה במדיום M tester one, ואפשרו למושבות ה-IPSL להתרחב במשך ארבעה עד חמישה ימים בתרבית.

לאחר מכן, בכל שלושה ימים החליפו את מצע ה-M tesser one בארבעה מיליליטר של מצע דיפרנציאציה, והחליפו מחצית מהמצע במצע דיפרנציאציה טרי. המתינו עד שהמוקדים הפיגמנטיים יגדלו מספיק כדי שניתן יהיה להוציאם מהתרבית באופן ידני, תהליך שארך כ-40 עד 50 ימים. לאחר מכן, השתמשו בקצה של פיפט של 200 microliter כדי לחתוך מסביב למושבות הפיגמנטיות ולהרים אותן.

אספו את המושבות שבודדו ורכזו אותן במבחנה קונית של 15 milliliter. הוסיפו חמישה milliliters של מצע DMMF 12 לתאי ה-RPE המרוכזים וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את המצע, השעיו שוב את משקע התאים בחמישה milliliters של מצע וחזרו על הסבב בצנטריפוגה.

הסר את המצע ממשקע התאים. לאחר מכן, הכן תמיסת תאים בודדים על ידי דגירה של ה-I-P-S-R-P-E המאוחדים עם 0.25% TRIPSIN EDTA למשך חמש עד 10 דקות ב-37 °C, עד שהצבירי התאים יתפרקו לתאים בודדים. שטוף את תאי ה-I-P-S-R-P-E במצע I-P-S-R-P-E ולאחר מכן זרע את התאים שנאספו בצלחת חדשה מצופה ב-matrigel בתוך 4 mL של מצע תרבית I-P-S-R-P-E. גדל את התאים למשך שלושה שבועות לפני המעבר (passage) והחלף את המצע במצע I-P-S-R-P-E טרי מדי שלושה ימים לצורך הניסוי.

יש לזרוע תאי I-P-S-R-P-E בריכוז של 100,000 תאים לסנטימטר רבוע ולאחר מכן לאסוף את התאים 17 ימים לאחר הזריעה לצורך איסוף תאי IPS לא מובחנים. יש לתרבת את התאים עד להשגת מושבות לא מובחנות בעלות מרכז צפוף. כאשר תופעה זו נצפית, יש לשטוף את המושבות במדיום D-M-E-M-F 12, ולאחר מכן להפריד את תאי ה-IPS לתאים בודדים באמצעות Accutane.

אספו את התאים למבחנה קונית של 15 milliliter וסובבו בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות. שאבו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את משקע התאים בשני milliliters של מצע D-M-E-M-F 12. לאיסוף RPE עוברי, שטפו תחילה תרביות של תאי RPE עובריים עם D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, פרקו את תרביות התאים לתאים בודדים באמצעות 0.25%TRIPSIN EDTA למשך חמש עד 10 דקות, בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

אספו את תאי ה-RPE העובריים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה ב-300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון ותלו את משקע התאים ב-2 מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12.

אספו את תאי ה-I-P-S-R-P-E ביום 17. לאחר מעבר שלישי וחמישי, שטפו את תאי ה-I-P-S-R-P-E פעמיים ב-PBS והכינו תרחיף של תאים בודדים באמצעות דגירה עם 1 ml של 0.25% trypsin למשך 5 עד 10 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, נטרלו את ה-trypsin עם 2 ml של מצע I-P-S-R-P-E קר מאוד ואספו את התאים לשפופרת קונית של 15 ml.

סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 Gs ולאחר מכן שאב את הנוזל העליון. השהה מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר של חוצץ צביעה מערכת המיקרו-בידס, סובב בצנטריפוגה את תגלי התאים I-P-S-R-P-E בחוצץ הצביעה ב-300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן שאב את הנוזל העליון והשהה מחדש.

שעלק את משקע התאים לריכוז של 2×10⁶ תאים ל-100 µL מתוך תמיסת הצביעה שקימה עם ערכת המיקרו-בידס (microbead kit). הוסף 10 µL של נוגדן anti TRA1-60 PE לכל 2×10⁶ תאים. ערבב היטב ולאחר מכן הדגר בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

שטפו את התאים ב-1 mL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים. לאחר מכן, סבבו את ת сусפנזיית התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-300 ×g. לאחר מכן, שאבו את הנוזל והשביו את משקע התאים ב-80 µL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים.

לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של חרוזי מיקרו המסומנים ב-anti PE עבור כל 2×10⁶ תאים. ערבבו היטב והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. הוסיפו 1 mL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים, סבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-300 ×g ושאבו את העלייה.

לאחר מכן, השביה מחדש את משקע התאים ב-500 µL של תמיסת צביעה ובצע מיון לתאים שליליים ל-TRA one 60 באמצעות מיין תאים מגנטי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. המוסף את התאים על ידי העברת כל דגימה דרך עמודת מיני-ספין של הומוגניזר מיקרו-צנטריפוגה הזמינה מסחרית, שתוכננה להכנת מיני-prep של חומצות גרעיניות. לאחר מכן, הוצא את ה-RNA הכולל מתאי IPS, I-P-S-R-P-E ו-RPE עוברי באמצעות ערכה להוצאת RNA הזמינה מסחרית, שתוכננה לשמר מולקולות RNA קטנות.

השתמש בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי לקבוע את ריכוזי ה-RNA הכוללים. ניתן ליצור קובץ Excel עם רשימה של ה-microRNAs שזוהו עם רמות ביטוי השונות לפחות פי שניים בין קבוצות הדגימות. לאחר מכן, התחבר לתוכנית ניתוח נתיבי RNA המקוונת והעלה את קובץ ה-Excel. בחר ב-flexible format עבור פורמט הקובץ ובחר ב-Agilent מרשימת הנשירה עבור המזהה (identifier).

הקלידו תחת הכותרת raw data. שייכו את ה-ID לעמודת probe ID ושייכו את observation one ואת log ratio לעמודת log ratio. בחרו ignore עבור כל שאר העמודות.

בחר את הפרמטרים לניתוח באופן הבא: במידה והביטחון (confidence) הוא עבור תצפיות ניסיוניות בלבד, כלול קשרים ישירים ועקיפים וכלול כימיקלים אנדוגניים. בחר ב-ingenuity knowledge base כסט הייחוס. לאחר מכן, בחר את מאגר המולקולות הייחוס.

זה כולל נתונים מכל המינים, כל שורות התאים והרקמות וכל המוטציות. לאחר בחירת כל הפרמטרים, הפעל את ניתוח הרשת על ידי בחירה ב-networks. לאחר מכן בחר ב-overlapping networks ולחץ על רשת רלוונטית כדי לצפות בתוצאות.

תאי IPS שהבדילו לתאי I-P-S-R-P-E הראו את הפנוטיפ הקלאסי של RPE, המתאפיין במורפולוגיה של תאים פיגמנטיים משושיים, בדומה לתאי RPE עובריים. השוואה של פרופיל הביטוי של micro RNA בין תאי IPS לא מובחנים לבין תאי I-P-S-R-P-E חשפה עלייה בביטוי של 47 microRNAs וירידה בביטוי של 36, בעוד שבתאי RPE עובריים נמצאו 61 microRNAs עם ביטוי מוגבר בהשוואה לתאי I-P-S-R-P-E ו-49 עם ביטוי מופחת. ניתוח מסלולים באמצעות תוכנת ingenuity IPA הצביע על כך שגני המטרה של ה-microRNAs שהובאו לביטוי דיפרנציאלי היו מעורבים בתהליכים תאיים הכוללים התפתחות תאית, גדילה ומחזור התא. ניתוח זה הצביע גם על כך ש-microRNAs המובעים ברקמות עיניות in vivo היו מועשרים ב-I-P-S-R-P-E וב-RPE עוברי בהשוואה לתאי IPS. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע זיהום ופירוק של דגימות ה-RNA לאחר סיום התהליך.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון R-T-P-C-R, כדי לאשש את רמת הביטוי של micro RNA בכל סוג תא לאחר פריסתו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקרי הראייה לבחון את תפקידו של micro RNA בדיפרנציאציה ובהתקדמות מחזור התא ב-rrp. לאחר צפייה בסרטון זה, תגעירו להבנה טובה של אופן גזירת RPE מ-IPS והשוואת פרופיל ביטוי ה-microRNA של I-P-S-R-P-E לתאי IPS ול-RPE עוברי.