Name: פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משבס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: חקור פרופילי ביטוי microRNA בתאי גזע iPS אנושיים, רשתית פיגמנט האפיתל נגזרת מהם ורשתית עוברית. השיטה משתמשת במערכי microRNA ובניתוח רשתות כדי לזהות הבדלים בביטוי גנים ולהבין תהליכי התמיינות ומחזור התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הדעות או טענות הכלולות במסמך זה הן התצוגות אישי של הכותבים ואינם להתפרש רשמי או כפי שמשקפים את הדעות של מחלקת הצבא או משרד ביטחון. מחקר זה בוצע בזמן שהמחברים יטני א גרין, אלברטו מוניז, וראמש ר Kaini קיימו המועצה הלאומית למחקר דוקטורים Associateship מחקר בUSAISR. מבחני microarray בוצעו על ידי מתקן המכון לחקר סרטן Microarray Core הילדים Greehey וביואינפורמטיקה המחלקה ב UT למדעי בריאות במרכז סן אנטוניו. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית הצבא האמריקאי לרפואה הקלינית שיקומית מחקר (CRMRP) ותכנית צבאית לרפואה תפעולית מחקר (MOMRP).

1. הכנת ריאגנטים תרבות וצלחות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת mTeSR1: הכן תקשורת mTeSR1 על פי הוראות היצרן. הפשירו של תוסף mTeSR1 5x 100 מיליליטר הלילה בשעה 4 ° C. הוספה של תוסף mTeSR1 5x 100 מיליליטר 400 מיליליטר של תקשורת הבסיסית mTeSR1 ומערבבים היטב. המדיה הזו היא יציבה בC ° 4 עד 2 שבועות וב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת בידול: הכן תקשורת בידול בDMEM/F12 להניב β-mercaptoethanol 0.1mm, 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ&quot;מ, L-גלוטמין 2.0 מ&quot;מ, 10% בסרום בנוקאאוט, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת IPS-הרשתית: הכן תקשורת iPS-RPE בMEM להניב תוספת 1x N1, 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ&quot;מ, 250 מיקרוגרם / מיליליטר טאורין, 13 ng / ml מלח נתרן triiodo-L-thyronine, הידרוקורטיזון 20 ng / ml, 5 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ו15% FBS 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מניות מלח נתרן Triiodo-L-thyronine. כדי להכין פתרון מניות לפזר 1.0 מ&quot;ג triiodo-L-thyronineמלח נתרן בנתרן הידרוקסידי 1 N ידי בעדינות מתערבל. הבא להוסיף 49.0 מיליליטר של תקשורת בסיס כדי להפוך 50.0 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר של מלח נתרן triiodo-L-thyronine. הכן aliquots ולהקפיא ב -20 ° C עד צורך. השתמש בנפח מתאים להשגת ריכוז הרצוי בתקשורת והתרבות הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון הידרוקורטיזון המניה: כדי להכין פתרון מניות הידרוקורטיזון, solubilize 1 מ&quot;ג של הידרוקורטיזון ב 1 מיליליטר של אתנול מוחלט על ידי תסיסה עדינה. הבא להוסיף 19.0 מיליליטר של תקשורת בסיס ל20 פתרון מניות הידרוקורטיזון מיליליטר של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. aliquot והקפאה ב -20 ° C עד צורך. השתמש בנפח מתאים כדי להשיג את הריכוז הרצוי בתקשורת והתרבות הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום גידול הרשתית עוברי. הכן את תקשורת הצמיחה על ידי ערבוב כל חומרים כימיים בערכת RTEGM בתקשורת הבסיסית, על פי הנחיות היצרן, למעט FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת ציפוי הרשתית עוברית. הכן תקשורת ציפוי על ידי העברת כמות קטנה של תקשורת צמיחה למכל וסטריליFBS dd לריכוז סופי של 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dispase: הכן פתרון עבודה של dispase של 1 מ&quot;ג / מיליליטר ב DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות Matrigel מצופים: הכינו matrigel ב DMEM/F12 ל0.08 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל היטב בכל צלחת 6 היטב עם 1.0 מיליליטר של פתרון matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות המצופה בטמפרטורת חדר למשך 1.0 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1.0 שעות, לשאוב DMEM/F12 העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של תקשורת mTeSR1 כדי למנוע התייבשות. צלחות matrigel מצופים מוכנות כעת לשימוש. </li></ol> 2. IPS תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לי לפני זריעת תאי iPS כל הצינורות, מדיה mTESR1 חמה לטמפרטורת חדר, וצלחות matrigel מצופים מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להפשיר את תאי iPS IMR90-4 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ואז להסיר את cryovial מאמבט המים ולעקר באמצעות 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה 2 מיליליטר כדי למזער שבירה של אגרגטים תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה מבחינת להוסיף 5 מיליליטר של warm תקשורת mTeSR1 לתאים ולערבב בעדינות. צנטריפוגה תאי XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend בזהירות אגרגטים התא ב2 מיליליטר של תקשורת mTeSR1 וזרעי התאים על גם אחד מצלחת גם שש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס חממה ותרבות עם 5% CO 2, לחות 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תקשורת תרבית תאי iPS יומי. מושבות לא עברו התמיינות תופיע 5-7 ימים לאחר זריעה. בדקו אם מושבות מובחנים כי הם מוכנים למעבר (מושבות במרכז צפוף). </li></ol> 3. Passaging של תאי iPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת מעבר לתאי iPS, שכל הצינורות, פתרון dispase, מדיה DMEM/F12 וmTERS1 חיממו לטמפרטורת חדר, וmatrigel מצופה צלחות מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני passaging תאי iPS, להסיר כל תחומי בידול על ידי גירוד באזור ונשיפת כלי התקשורת. בידול צריך להישאר מתחת 20% גם לגבוהתרבויות באיכות. לשטוף היטב היטב עם 2 DMEM/F12 מיליליטר המכיל תאי iPS ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / מיליליטר dispase היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לשאוב dispase ולשטוף בעדינות מושבות תאים עם 2 מיליליטר של DMEM/F12 פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה, להוסיף 2 מיליליטר של mTSER1 היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 5 מיליליטר בעדינות לגרד את המושבות של הצלחת בצורה אגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המושבות מנותקות לצינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף מדיה mTeSR1 מספיק כדי לזרוע את הקטע הבא של תאים. </li></ol> 4. התמיינות של תאי iPS לIPS-הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי iPS על צלחת מצופה חדש בתקשורת mTESR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מושבות תאי iPS להרחיב ל4-5 ימים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת mTeSR1 תחליף עם תקשורת בידול 4 מיליליטר. שינוי אחד וחצי של התקשורת כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מוקדי פיגמנט לצמוח גדולים מספיק כדי להיות גזור באופן ידני מתוך התרבות (40-50 יום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש200 קצה פיפטה μl לחתוך מסביב ולהרים את מושבות פיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולרכז את המושבות גזורים בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של DMEM/F12 לתאי הרשתית ונקווה ו צנטריפוגות XG 300 5 דקות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תא בודד על ידי דוגרים IPS-הרשתית ונקווה עם 0.25% EDTA טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי iPS-RPE עם תקשורת IPS-הרשתית וצלחת התאים שנאספו על טרי גם ב4 מיליליטר של תקשורת IPS-הרשתית מצופה matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים במשך 3 שבועות לפני המעבר. לשנות את התקשורת כל 3 ימים. לצורך הניסוי, צלחת iPS-RPE ב100,000 תאים / 2 סנטימטר. איסוף תאים ביום 17. רוזן היום של זריעה כמו יום 0. </li></ol> 5. אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף תאי iPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי iPS עד מושבות לא עברו התמיינות הם נצפו להיות צפופים במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המושבות ב DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפרק לתאים בודדים באמצעות accutas<html> דואר. לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend ב 2 מיליליטר של DMEM/F12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתית אוסף עוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף בתרביות תאים עוברי הרשתית עם DMEM/F12 והתפרק לתאים בודדים באמצעות 0.25% EDTA טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend ב 2 מיליליטר של DMEM/F12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף נייד IPS-הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר IPS-הרשתית להגיע חלוף 3 וחלוף 5, לאסוף את התאים ביום 17 לאחר מעבר. יש לשטוף IPS-הרשתית פעמים PBS ולהכין השעיה תא בודדת על ידי דגירה עם טריפסין 1.0 מיליליטר של 0.25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל טריפסין עם 2 מיליליטר של תקשורת IPS-הרשתית קרח קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ההשעיה התא ב 3 מיליליטר של חיץ מכתים מערכת microbead. </li></ol></li></ol>בחירת ve_title &quot;&gt; 6. שלילי של IPS-הרשתית כדי להסיר תאים מובחנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל חומרים כימיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, אבל לא עובד על קרח. צנטריפוגה השעיה תא מהצעד 5.3.4 XG 300 למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב של חיץ מכתים 100 μl מערכת microbead ל2 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של נוגדן Anti-TRA-1-60-PE ל2 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב1-2 מיליליטר של חיץ לכל 2 x 10 6 תאים. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 80 μl של חיץ מכתים ל2 x 10 6 תאים. הוסף 20 μl של microbeads אנטי PE שכותרתו (מערכה) לכל 2 x 10 6 תאים. מערבבים היטב. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר של חיץ מכתים ל2 x 10 6 תאים. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב500 &amp; #956; ליטר של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרדת תא מגנטית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודת סדרן תא מגנטי. יש לשטוף את העמודה עם 3 מיליליטר של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל השעיה תא מ6.8 על עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור בנמל השלילי כדי לאסוף את TRA-1-60 תאים שליליים. </li></ol></li></ol> 7. סה&quot;כ RNA חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים על ידי הפעלת הדגימות באמצעות טור ספין מיני homogenizer microcentrifuge זמין מסחרי המיועד לminipreps חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ RNA המוחלט מתאי iPS, IPS-הרשתית, ורשתית של העובר עם ערכת חילוץ RNA זמינה המסחרית שנועדה לשמר את מולקולות RNA קטנות 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע סך ריכוזי RNA באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop. </li></ol> 8. Bioanalyzer וMicroarray Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות RNA עם Bioanalyzer בשיתוף עם ערכת איכות RNA זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 100 ngרנ&quot;א הכל עם phosphatase מעי עגל ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל RNA באמצעות DMSO 100% ב-C ° 100 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הדגימות עם PCP-Cy3 באמצעות האנזים T4 על ידי דגירה על 16 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא בפורמט 8_x_15K מערך מירנה אנושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערכים בהתאם להוראות יצרן וסריקה ברזולוציה של 5 מיקרומטר באמצעות סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים באמצעות תוכנת חילוץ תכונת microarray תואמת את microarray מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את אותות מירנה כדי לקבוע את הרמה היחסית של ביטוי במדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את רמות הביטוי של כל מירנה בין קבוצות מדגם. בחר miRNAs עם ביטוי ההפרש לפחות פי שניים לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי לניתוח נתונים, בצע את ההוראות ליצירת מפות חום להדמיה של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי 28. </li></ol> 9. ניתוח מסלול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הנתונים מmiRNAs נבחר ב8.9 בפורמט אקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכנס לתכנית ניתוח מסלול RNA באינטרנט. העלה קובץ Excel. בחר באפשרות &quot;תבנית גמישה&quot; לפורמט קובץ ובחר &quot;Agilent&quot; מרשימה נפתחת עבור סוג המזהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת כותרת הנתונים גולמית, להקצות &quot;מזהה&quot; לחקור עמודה מזהה ולהקצות &quot;תצפית 1&quot; ו &quot;יומן יחס&quot; לעמודת מנת יומן. בחר &quot;להתעלם&quot; לכל עמודות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים לניתוח באופן הבא: בטחון: בניסוי נצפה רק; כוללים קשרים ישירים ועקיפים; וכוללים כימיקלים אנדוגני; בחר את בסיס ידע שנינות כקבוצת ההתייחסות. בחר את מסד הנתונים של מולקולות התייחסות הכולל נתונים מכל המינים, בכל שורות התאים וברקמות, ואת כל המוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשת הפעלה ומסלול מנתח. </li></ol>

<ol><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+regulate+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation.</a> Front Genet. 3, 191 (2012).</li>
<li>Romano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commentary+on+iPS+cell+biology%3A+Potential+applications+in+autologous+tissue+and+cell+transplantation%2C+development+of+new+models+for+the+study+of+human+pathological+conditions+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening.</a> J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).</li>
<li>Almeida, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+pluripotent+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives.</a> Circ Res. 112, 549-561 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem-derived+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+exhibit+ion+transport%2C+membrane+potential%2C+polarized+vascular+endothelial+growth+factor+secretion%2C+and+gene+expression+pattern+similar+to+native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE.</a> Stem Cells. 29, 825-835 (2011).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+A+new+year+and+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells. A new year and a new era.</a> Nature. 451, 135-136 (2008).</li>
<li>Subba Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+outside+the+liver%3A+Induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+support+varicella-zoster+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Alipio, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+hyperglycemia+in+diabetic+mouse+models+using+induced-pluripotent+stem+%28iPS%29-derived+pancreatic+beta-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).</li>
<li>la Cour, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Organ+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium.</a> Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li>
<li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+uptake%2C+processing+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).</li>
<li>Leonardo, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+microRNAs+in+pluripotency+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming.</a> Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).</li>
<li>Arora, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+microRNAs+affecting+mRNA+expression+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development.</a> BMC Dev Biol. 10, (2010).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).</li>
<li>Mallanna, S. K., Rizzino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+microRNAs+in+the+control+of+embryonic+stem+cells+and+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 344, 16-25 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466, 835-840 (2010).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphthalmia-associated+transcription+factor+%28MITF%29+promotes+differentiation+of+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+by+regulating+microRNAs-204%2F211+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression.</a> J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+miRNA+signatures+during+the+differentiation+of+hESCs+into+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Wilson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li>
<li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNeasy+Mini+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Sample+and+Assay+Technologies%22%5BJournal%5D)">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Technologies%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths%3A+230+nm%2C+260+nm%2C+280+nm%5BTitle%5D)+AND+%22About+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

לסיכום, דו&quot;ח זה מתאר את השיטות המשמשות לתאי iPS תרבות, IPS-הרשתית, ורשתית של העובר. הרשתית נובעת מiPS הן מורפולוגית ופונקציונלית דומות לרשתית של העובר. IPS-הרשתית גם מבטאת גנים הרשתית אופייניים כולל RPE65, CRALBP, PEDF, וLRAT 16. כדי להמשיך ולאפיין את התאים האלה, RNA הופק ומשמש לביצוע ניתוח microarray לזהות מירנה הביעה באופן דיפרנציאלי. ניתוח של עוצמות האות חשף כי המספר הגדול ביותר של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי זוהה ברשתית העוברית לעומת השוואות IPS-הרשתית, דבר המ...

לתאי גזע יש את היכולת לשכפל ללא הגבלה והפוטנציאל להתמיין לכל סוג תא סומטי. הפיתוח של טכניקות כדי לתכנת מחדש את התאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent עורר התרגשות רבה בקהילת המחקר ובקרב רופאים, כמו כניסתו של התחדשות רקמות אישית היא באופק 1. -Induced pluripotent תאי גזע (iPS) להפגין את אותן תכונות של פוטנציאל replicative בלתי מוגבל וpluripotency כגזע עוברי (ES) תאים תוך עקיפת הדילמות האתיות הקשורות לESCs. בנוסף, תאי גזע שמקורם בחולה לא לעורר תגובה חיסונית, מאוד להגדיל את ההסתברות ליישומים טיפוליים המוצלחים 2-3. בתנאי תרבות מסוימים, תאי iPS הוכחו להתמיין לכמה סוגי תאים שונים במבחנה, כוללים שריר לב, תאי עצב, תאים בטא בלבלב, hepatocytes, ואפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 4-12. הרשתית היא שכבה מיוחדת של תאי אפיתל פיגמנט ממוקמים בחלק האחורי של הרשתית שמבצעת מספר פונקציות שהם חיוניים לבריאות ותפקוד חזותיים כגון קליטת אור התועה, phagocytosis של המגזרים החיצוניים קולטי האור, ועיבוד של רטינואידים לייצור של chromophore החזותי. חוסר תפקוד של הרשתית עקב נזק או מחלה משפיע עמוקות על בריאות קולטי אור ותפקוד ראייה כפי שמעיד מחלות המסנוורים שהן התוצאה של פתולוגיה הרשתית הבסיסית כגון ניוון הקשור לגיל מקולרי (AMD), המחלה של Stargardt, ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP) 13. טיפולים באמת יעילים שיכול לשחזר את חזון לא הושגו, והחלפה של הרשתית חולה עם הרשתית בריאה עשויה להיות האפשרות הטובה ביותר למנוע אובדן הראייה 14-15. הרשתית נובעת מiPS (iPS-RPE) היא מקור אפשרי של תאים כדי להחליף את הרשתית הפגועה. IPS-הרשתית מבטאת characterisחלבוני הרשתית טיק LRAT, CRALBP, PEDF, וRPE65; מציג את מורפולוגיה המשושה פיגמנט מאוד הקלסית הרשתית; ומבצע פונקציות הרשתית כגון phagocytosis, עיבוד retinoid, והפרשת 11 - 5,16 רשתית cis. עם זאת, לפני IPS-הרשתית יכולה לשמש טיפולית, IPS-הרשתית חייבת להיות מאופיינת באופן יסודי. הבנת הגורמים הקובעים בידול הרשתית יש צורך לשפר את התשואה וטוהר של התאים שישמש ליישומים קליניים. התמיינות תאים היא התוצאה של ביטוי גנים מוסדרים מאוד. שיפוץ אפיגנטיים של הגנום והתיאום של גורמי שעתוק נדרש להחלטות גורל תא המתרחשות במהלך התמיינות והתפתחות 17. רגולציה של תרגום ההודעה RNA (mRNA) על ידי microRNA (מירנה) להציג עוד רמה של רגולציה המשפיעה על תא גורל 1. MiRNAs קצר, ~ 22 NT, אורכים של נוקלאוטידים כי גם תרגום לדכא ידיהקשירה של UTR &#39;3 של mRNA או למקד את ה-mRNA לשפלה. MiRNAs זוהו כמעט בכל הרקמות ועד כה מעל 2,000 מיקרו RNA האנושי הייחודי נרשם באתר miRBase. מאז miRNAs דורש השלמה חלקית בלבד כדי לאגד את ה-mRNA היעד, מירנה אחד יכולה באופן פוטנציאלי להיקשר לעשרות או מאות מטרות, ולהיפך, כלומר mRNA אחד יכול להיות ממוקדת על ידי מספר miRNAs שונה. מאפיין מחייב מופקר זה מגדיל באופן דרמטי את רמת המורכבות של רגולציה, כמו גם את רמת קושי של קביעת הפונקציות של miRNAs פרט ואת התפקיד כל הצגות בתפקודים תאיים 18-21. עם זאת, מחקרים הראו כי מירנה משכללת ביטוי גנים במהלך בידול על ידי המשפיע על מעמדה מתילציה דנ&quot;א 17. במחקר ספציפי יותר לרשתית, miR-204/211 הוצג כדי לקדם את הפנוטיפ האפיתל של הרשתית 22. קבוצה נוספת ניתחה את פרופיל מירנהשל הרשתית במהלך התמיינות בתאי גזע עובריים וחשפו סטים שונים של מירנה באים לידי ביטוי בתהליך ההתמיינות 23. למעשה, פרופילי מירנה יכולים באופן חד משמעי להבחין בין סוגי תאים, כוללים תאי גזע עובריים, תאים מבשר, ותאי הבדיל סופני 24,25. מעל 250 miRNAs באים לידי ביטוי ברשתית. בהתבסס על מחקרים אלה, אנו משערים כי miRNAs לשחק תפקיד חשוב בהתמיינות של הרשתית משב&quot;ס. מטרת דו&quot;ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להתמיינות של הרשתית מIMR90-4 תאים iPS, אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, והניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים, תאי iPS , IPS-הרשתית ורשתית של העובר. RNA סה&quot;כ היה שחולץ מן התרבויות של כל סוג תא והכלאה לmicroarray מירנה, המכיל בדיקות ספציפיות ל1,205 miRNAs אדם ו144 miRNAs הנגיפי. תוצאות microarray היו להשוותד כדי לקבוע אילו miRNAs באו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בין סוגי התאים השונים. miRNAs עם 2 קיפול או שינוי של פי יותר בביטוי נבחרו לניתוח נוסף. תוכנת ניתוח מירנה שימשה כדי לזהות מטרות פוטנציאליות של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי וליצור רשתות סלולריות מוסדרים על ידי miRNAs שנבחר.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 מדיה + תוסף 5X</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&beta;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>היקלון (פישר)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>MEM מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N1</td><td>סיגמא</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>היקלון (פישר)SH3008803HI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-l-thyronine מלח נתרן</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RTEGM מדיה RPE עוברית Life</td><td>Technologies</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח היקלון (פישר)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>היקלון (פישר)</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>מאגר כביסה Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שטיפה Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו-חרוזים Anti-TRA-1-60</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>עמודת מיון תאים Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>מגרסת QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Labערכת שבב</td><td>Agilent</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מערך miRNA אנושי v16</td><td>Agilent</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

פרופילי הביטוי microrna של תאי ips האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

מטרת דו&quot;ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להשוואת microRNA (מירנה) פרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) שמקורם בתאי iPS האנושי (iPS-RPE), ורשתית של העובר. הפרוטוקולים כוללים אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, וניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים. השיטות לתרבות של תאי iPS ורשתית של העובר הם הסבירו. הפרוטוקול המשמש לבידול של הרשתית מiPS האנושי מתואר גם. טכניקת הפקת RNA אנו מתארים נבחרה כדי לאפשר התאוששות מקסימלי של RNA הקטן מאוד לשימוש במירנה microarray. לבסוף, מסלול הסלולר ורשת ניתוח של נתוני microarray הוא הסביר. טכניקות אלה תאפשר ההשוואה בין פרופילי מירנה משלושה סוגי תאים שונים.

תאי iPS (איור 1 א) גודלו בתנאי בידול כדי לגרום להתמיינות לתאי iPS-RPE. IPS-הרשתית הציגה פנוטיפ הרשתית קלאסי של מורפולוגיה של תאי פיגמנט משושה (איור 1) דומה לרשתית עוברית (איור 1 ג). כדי להבין את התפקיד שמירנה עשויה לשחק בתהליך של בידול משב&quot;ס לIPS-הרשתית טובה יותר, ניתוח microarray של ביטוי מירנה נערך. RNA סה&quot;כ נאסף מתאי iPS, הרשתית עוברית, וIPS-הרשתית ב...

MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשוות את ביטוי ה-micro RNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (induced pluripotent stem cells), בתאי אפיתל של הרשתית הפיגמנטית המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, ובתאי אפיתל של הרשתית הפיגמנטית עובריים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תרבית והרחבה של תאי IPS ושל RPE עובריים.השלב השני הוא גדילת תאי ה-IPS לתאי RPE. לאחר מכן, מוצאים RNA מתאי ה-IPS, מתאי ה-I-P-S-R-P-E ומתאי RPE עובריים. השלב הסופי הוא ביצוע אנליזת micro RNA microarray על דגימות ה-RNA וניתוח הנתונים.בסופו של דבר, ניתוח מסלולים ורשתות משמש לזיהוי microRNAs המבטאים ביטוי דיפרנציאלי המעורבים ברשתות תאיות מרובות, כולל התרבות והתקדמות מחזור התא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר הראייה, כגון תפקיד ה-microRNA בבקרתה של דיפרנציאציה לתאי RPE בוגרים, התקדמות מחזור התא, התרבות והזדקנות תאית. ההשלכות של טכניקה זו חלות על טיפולים המשתמשים באפיתל רשתית (RPE) המופק מתאי גזע להחלפת RPE חולה או פגום, מכיוון שניתן לקבוע את מספר המעברים (passage number) האופטימלי של התאים המשמשים לטיפול.אף על פי שנושא זה יכול לספק תובנות לגבי הגורמים המווסתים את הגבולה של RRP מ-IPS, ניתן ליישמו גם על מערכות איברים אחרות, כגון גבולה של סוגי תאים ספציפיים אחרים של TC מ-IPS. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, זרעו את התאים הגזעיים הפלוריפוטנטיים המושרים בריכוז של כ-350 מושבות תאים לבאר על פלטה מצופה שזה עתה הוכנה במדיום M tester one, ואפשרו למושבות ה-IPSL להתרחב במשך ארבעה עד חמישה ימים בתרבית.לאחר מכן, בכל שלושה ימים החליפו את מצע ה-M tesser one בארבעה מיליליטר של מצע דיפרנציאציה, והחליפו מחצית מהמצע במצע דיפרנציאציה טרי. המתינו עד שהמוקדים הפיגמנטיים יגדלו מספיק כדי שניתן יהיה להוציאם מהתרבית באופן ידני, תהליך שארך כ-40 עד 50 ימים. לאחר מכן, השתמשו בקצה של פיפט של 200 microliter כדי לחתוך מסביב למושבות הפיגמנטיות ולהרים אותן.אספו את המושבות שבודדו ורכזו אותן במבחנה קונית של 15 milliliter. הוסיפו חמישה milliliters של מצע DMMF 12 לתאי ה-RPE המרוכזים וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את המצע, השעיו שוב את משקע התאים בחמישה milliliters של מצע וחזרו על הסבב בצנטריפוגה.הסר את המצע ממשקע התאים. לאחר מכן, הכן תמיסת תאים בודדים על ידי דגירה של ה-I-P-S-R-P-E המאוחדים עם 0.25% TRIPSIN EDTA למשך חמש עד 10 דקות ב-37 °C, עד שהצבירי התאים יתפרקו לתאים בודדים. שטוף את תאי ה-I-P-S-R-P-E במצע I-P-S-R-P-E ולאחר מכן זרע את התאים שנאספו בצלחת חדשה מצופה ב-matrigel בתוך 4 mL של מצע תרבית I-P-S-R-P-E. גדל את התאים למשך שלושה שבועות לפני המעבר (passage) והחלף את המצע במצע I-P-S-R-P-E טרי מדי שלושה ימים לצורך הניסוי.יש לזרוע תאי I-P-S-R-P-E בריכוז של 100,000 תאים לסנטימטר רבוע ולאחר מכן לאסוף את התאים 17 ימים לאחר הזריעה לצורך איסוף תאי IPS לא מובחנים. יש לתרבת את התאים עד להשגת מושבות לא מובחנות בעלות מרכז צפוף. כאשר תופעה זו נצפית, יש לשטוף את המושבות במדיום D-M-E-M-F 12, ולאחר מכן להפריד את תאי ה-IPS לתאים בודדים באמצעות Accutane.אספו את התאים למבחנה קונית של 15 milliliter וסובבו בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות. שאבו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את משקע התאים בשני milliliters של מצע D-M-E-M-F 12. לאיסוף RPE עוברי, שטפו תחילה תרביות של תאי RPE עובריים עם D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, פרקו את תרביות התאים לתאים בודדים באמצעות 0.25%TRIPSIN EDTA למשך חמש עד 10 דקות, בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.אספו את תאי ה-RPE העובריים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה ב-300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון ותלו את משקע התאים ב-2 מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12.אספו את תאי ה-I-P-S-R-P-E ביום 17. לאחר מעבר שלישי וחמישי, שטפו את תאי ה-I-P-S-R-P-E פעמיים ב-PBS והכינו תרחיף של תאים בודדים באמצעות דגירה עם 1 ml של 0.25% trypsin למשך 5 עד 10 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, נטרלו את ה-trypsin עם 2 ml של מצע I-P-S-R-P-E קר מאוד ואספו את התאים לשפופרת קונית של 15 ml.סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 Gs ולאחר מכן שאב את הנוזל העליון. השהה מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר של חוצץ צביעה מערכת המיקרו-בידס, סובב בצנטריפוגה את תגלי התאים I-P-S-R-P-E בחוצץ הצביעה ב-300 GS למשך חמש דקות. לאחר מכן שאב את הנוזל העליון והשהה מחדש.שעלק את משקע התאים לריכוז של 2×10⁶ תאים ל-100 µL מתוך תמיסת הצביעה שקימה עם ערכת המיקרו-בידס (microbead kit). הוסף 10 µL של נוגדן anti TRA1-60 PE לכל 2×10⁶ תאים. ערבב היטב ולאחר מכן הדגר בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.שטפו את התאים ב-1 mL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים. לאחר מכן, סבבו את ת сусפנזיית התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-300 ×g. לאחר מכן, שאבו את הנוזל והשביו את משקע התאים ב-80 µL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של חרוזי מיקרו המסומנים ב-anti PE עבור כל 2×10⁶ תאים. ערבבו היטב והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. הוסיפו 1 mL של בופר צביעה עבור כל 2×10⁶ תאים, סבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-300 ×g ושאבו את העלייה.לאחר מכן, השביה מחדש את משקע התאים ב-500 µL של תמיסת צביעה ובצע מיון לתאים שליליים ל-TRA one 60 באמצעות מיין תאים מגנטי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. המוסף את התאים על ידי העברת כל דגימה דרך עמודת מיני-ספין של הומוגניזר מיקרו-צנטריפוגה הזמינה מסחרית, שתוכננה להכנת מיני-prep של חומצות גרעיניות. לאחר מכן, הוצא את ה-RNA הכולל מתאי IPS, I-P-S-R-P-E ו-RPE עוברי באמצעות ערכה להוצאת RNA הזמינה מסחרית, שתוכננה לשמר מולקולות RNA קטנות.השתמש בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי לקבוע את ריכוזי ה-RNA הכוללים. ניתן ליצור קובץ Excel עם רשימה של ה-microRNAs שזוהו עם רמות ביטוי השונות לפחות פי שניים בין קבוצות הדגימות. לאחר מכן, התחבר לתוכנית ניתוח נתיבי RNA המקוונת והעלה את קובץ ה-Excel. בחר ב-flexible format עבור פורמט הקובץ ובחר ב-Agilent מרשימת הנשירה עבור המזהה (identifier).הקלידו תחת הכותרת raw data. שייכו את ה-ID לעמודת probe ID ושייכו את observation one ואת log ratio לעמודת log ratio. בחרו ignore עבור כל שאר העמודות.בחר את הפרמטרים לניתוח באופן הבא: במידה והביטחון (confidence) הוא עבור תצפיות ניסיוניות בלבד, כלול קשרים ישירים ועקיפים וכלול כימיקלים אנדוגניים. בחר ב-ingenuity knowledge base כסט הייחוס. לאחר מכן, בחר את מאגר המולקולות הייחוס.זה כולל נתונים מכל המינים, כל שורות התאים והרקמות וכל המוטציות. לאחר בחירת כל הפרמטרים, הפעל את ניתוח הרשת על ידי בחירה ב-networks. לאחר מכן בחר ב-overlapping networks ולחץ על רשת רלוונטית כדי לצפות בתוצאות.תאי IPS שהבדילו לתאי I-P-S-R-P-E הראו את הפנוטיפ הקלאסי של RPE, המתאפיין במורפולוגיה של תאים פיגמנטיים משושיים, בדומה לתאי RPE עובריים. השוואה של פרופיל הביטוי של micro RNA בין תאי IPS לא מובחנים לבין תאי I-P-S-R-P-E חשפה עלייה בביטוי של 47 microRNAs וירידה בביטוי של 36, בעוד שבתאי RPE עובריים נמצאו 61 microRNAs עם ביטוי מוגבר בהשוואה לתאי I-P-S-R-P-E ו-49 עם ביטוי מופחת. ניתוח מסלולים באמצעות תוכנת ingenuity IPA הצביע על כך שגני המטרה של ה-microRNAs שהובאו לביטוי דיפרנציאלי היו מעורבים בתהליכים תאיים הכוללים התפתחות תאית, גדילה ומחזור התא. ניתוח זה הצביע גם על כך ש-microRNAs המובעים ברקמות עיניות in vivo היו מועשרים ב-I-P-S-R-P-E וב-RPE עוברי בהשוואה לתאי IPS. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע זיהום ופירוק של דגימות ה-RNA לאחר סיום התהליך.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון R-T-P-C-R, כדי לאשש את רמת הביטוי של micro RNA בכל סוג תא לאחר פריסתו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקרי הראייה לבחון את תפקידו של micro RNA בדיפרנציאציה ובהתקדמות מחזור התא ב-rrp. לאחר צפייה בסרטון זה, תגעירו להבנה טובה של אופן גזירת RPE מ-IPS והשוואת פרופיל ביטוי ה-microRNA של I-P-S-R-P-E לתאי IPS ול-RPE עוברי.

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

חקור פרופילי ביטוי microRNA בתאי גזע iPS אנושיים, רשתית פיגמנט האפיתל נגזרת מהם ורשתית עוברית. השיטה משתמשת במערכי microRNA ובניתוח רשתות כדי לזהות הבדלים בביטוי גנים ולהבין תהליכי התמיינות ומחזור התא.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב"ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

גלה סרטונים נוספים